Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

O objetivo geral do experimento a seguir é testar se os efetores de patógenos são reconhecidos por proteínas resistentes em plantas. Isso é conseguido infectando primeiro as folhas da planta com uma cultura líquida de agrobacterium ou por meio da infecção por PVX agro, que expressará transitoriamente efetores no tecido vegetal. Em seguida, as plantas podem incubar e as plantas são pontuadas para morte celular.

São obtidos resultados que mostram respostas de morte celular no reconhecimento de desertores expressos transitoriamente por proteínas de resistência em plantas. A principal vantagem dessas técnicas sobre os métodos existentes, como estudos genéticos com marcadores moleculares, é que são ensaios funcionais. Eles não apenas mostram que o gene de resistência está presente na planta, mas também que funciona e que as respostas de defesa são ativamente induzidas.

Esses métodos podem ajudar a responder a questões-chave em patologia molecular de plantas, como descobrir rapidamente a resistência a bots e RA e criminosos genes AFI, que disponibilidade de ambas as sequências do genoma Demonstrando o procedimento será realizado por du, um estudante de doutorado de um laboratório Para gerar plantas de batata. Mantenha as plântulas in vitro em frascos de plástico estéreis contendo mais shige, scoog ou meio MS em câmaras climáticas a 18 graus Celsius com um regime de 16 horas e oito horas dia e noite por duas semanas. Quando as plantas crescem, as raízes brancas as transferem para vasos de solo esterilizado.

Em compartimentos de estufa regulamentados para plantas usadas nesses experimentos, use sementes de quatro a cinco semanas cultivadas em NCOA hamana e transplantes de batata de quatro a cinco semanas gerados in vitro. Para preparar a cultura de agrobactérias, comece enchendo tubos de 50 mililitros com 10 mililitros de meio YEB, suplementado com um microlitro de acetofenona, 100 microlitros de MES e os antibióticos apropriados. Em seguida, pipete 20 microlitros de estoque de glicerol das cepas desejadas de agrobacterium contendo o gene de interesse no YEB.

Incubar as culturas a 28 graus Celsius e 200 RPM por um a dois dias até um OD 600 de cerca de 1,0. Colha as células por centrifugação a 3000 GS por 10 minutos. Em seguida, despeje o supernat e ressuspenda o pellet.

Em MMA recém-feito médio para um OD 600 de 0,3. Suavemente vórtice as células para reutilizá-las suspendê-las para co-infiltração de duas cepas bacterianas. Misture a cultura em uma proporção de um para um.

Deixe as culturas em temperatura ambiente por uma a seis horas antes de se infiltrarem nas plantas. Enquanto isso, rotule as plantas a serem infiltradas com a cepa e a data do experimento para realizar infiltrações usando proteção para os olhos. Use uma seringa de um mililitro sem agulha para injetar cuidadosa e lentamente suspensões de agrobacterium nos painéis das folhas.

Injete pelo menos três plantas e três folhas por planta para servir como triplicados para evitar contaminação cruzada. Troque ou esterilize as luvas entre as infiltrações e evite regar as plantas até o dia seguinte. A inoculação aproximadamente três dias após a infiltração, pontua as plantas para morte celular em uma escala de zero a 100%, com zero representando nenhum sintoma.

100% indicando morte celular por confluência e valores intermediários que variam de esclerose a níveis crescentes de morte celular. Realizar a infecção por PVX agro em plantas cultivadas com sementes de duas a três semanas e hamana e transplantes de batata de duas a três semanas cultivados in vitro para três mililitros de YEB suplementados com antibióticos. Adicione 20 microlitros de estoque de glicerol de incubação de agrobacterium a 28 graus Celsius e 200 RPM a um OD 600 de cerca de 1,0.

Espalhe cerca de 300 microlitros de cada cepa de agrobacterium em placas de ágar LB com antibióticos e incube a 28 graus Celsius por um a dois dias. Use uma espátula para coletar a agrobactéria. Em seguida, inocular uma folha com uma grande quantidade de bactérias.

Mergulhe um palito na cultura e use-o para perfurar a planta. A folha inocula cada folha em vários locais por meio de folhas por planta e três plantas por cepa. Duas semanas após a inoculação, escore macroscopicamente, registrando cada mancha qualitativamente como sim ou não.

Em seguida, calcule a porcentagem de sites respondentes e compare com os controles mostrados. Aqui estão os resultados representativos da infiltração agrícola em hamana final e duas espécies de batata, Solenium JI 3 49 dash três e CV Desiree cerca de três dias após a inoculação. Há morte celular de confluência no painel foliar co infiltrado com a mistura da cepa de agrobactéria AGL um PVRG contendo P bin mais R três A e PK sete WG dois A VR três A enquanto nenhuma resposta de morte ocorre com o controle negativo PI mais R três A ou PK sete WG dois A VR três A nesta figura PVX agro infecção de n e duas espécies de batata S um Kae 3 54 dash um e S micro DOUM 360 dash um são mostrados cerca de duas semanas após a inoculação.

Há expansão da morte celular nos locais inoculados com o controle positivo PGR 1 0 6 CRN dois. Isso codifica um gene indutor de morte celular geral de Phytophthora Infest e PGR 1 0 6 em um que codifica um gene ilícito de P Infest. Não é observada morte celular em expansão no local inoculado com o poço vazio de controle negativo PGR 1 0 6

É importante tentar este procedimento para lembrar de cultivar material vegetal de boa qualidade. Essa técnica abriu o caminho para explorar ômicas de efeito na batata e em outras espécies de plantas para pesquisadores em patologia molecular de plantas e melhoramento de plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar uma análise funcional eficiente e robusta de alto rendimento do gene can em plantas.