Análise quantitativa baseada em microscopia a laser confocal da distribuição de aspergillus fumigatus conidia em pulmão de rato totalmente limpo opticamente

Nossa abordagem nos permite realizar a análise quantitativa de uma distribuição Aspergillus fumigatus Conidia em pulmão de camundongos limpos opiátricos em todo o estado. Aspergillus fumigatus Conidia pode penetrar no trato respiratório e causar doenças fatais em pacientes imunocomprometidos. O trato respiratório dos mamíferos é um sistema de vias aéreas de diferentes gerações.

Cada geração é caracterizada pelas diferentes estruturas de paredes das vias aéreas e populações de células imunes. Nos ramos brônquicos, aspergillus fumigatus Conidia são eliminados por liberação mucocilia. No entanto, no espaço disponível, o despejo mucocilia não funciona e conidia deve ser limpa pelas células imunes, como macrófagos alveolares e neutrófilos.

Assim como os aspectos temporais espaciais da distribuição de Conidia nas vias aéreas são importantes. No entanto, não foi devidamente investigado a questão na compreensão dos mecanismos da doença. Aqui apresentamos uma configuração experimental para a análise quantitativa da distribuição Aspergillus fumigatus Conidia nas vias aéreas de camundongos infectados.

Aplico 50 microliters de Aspergillus fumigatus Conidia ao rato. Seis horas depois, colhe o pulmão. Corrija durante a noite em 2% de formaldeído e colorisse com conjugado Streptavidin rotulado.

Em seguida, submia o espécime à limpeza óptica. Coloque o espécime na garrafa de vidro cheia com solução de água de 50% de metanol e coloque-o na batedeira de amostra em temperatura ambiente por uma hora. Substitua 50% de metanol por 100% de metanol e coloque-o sob o misturador de amostras por duas horas.

Prepare uma mistura composta por uma parte de álcool benzílico, e duas partes de benzílico-benzoato. Transfira o espécime para ele 24 placas de poço e cubra-o com a mistura benzílada-benzoato por pelo menos 30 minutos. A amostra está pronta para a imagem.

Coloque a amostra no suporte da amostra. E coloque o suporte no microscópio. Depois de ligar o sistema de microscópio e abrir o software, acenda a luz de transmissão e selecione um objetivo X.

Localize visualmente sua amostra na luz de transmissão e prossiga para a guia de aquisição. Selecione o modo Lambda a laser confocal. Ligue os lasers apropriados.

Defina a faixa espectral do detector e selecione o espelhodicróico. Ajuste o ganho do detector e reduza o orifício para uma unidade de área. Defina a resolução do pixel para 512 por 512.

Ligue o modo zed-stack e inicie imagens ao vivo. Encontre o plano focal onde ambos os dados são visíveis. Expanda o painel de pilha de zed.

Usando a roda de foco, encontre e selecione os planos mais baixos e mais altos da amostra. Posicione o plano focal ao lado da parte inferior da amostra. Desligue o modo zed-stack e disque o modo de digitalização.

Se necessário, ajuste a posição X, Y e o número de telhas. Ligue os modos de pilha de zed e disque-se. Defina a etapa de secção de zed para cinco mícrons.

Defina a velocidade de digitalização. Comece a experiência. A imagem normalmente leva várias horas dependentes do tamanho da terra e da velocidade de varredura.

A imagem obtida é então espectralmente descomprida. Para descompração espectral, use opção linear de desmixing. Selecione as regiões correspondentes às áreas terrestres rotuladas com streptavidin e Conidia.

Comece a se descomprto. Depois de descompridar salvar o arquivo não misturado. Para stich telhas da imagem obtida, abra a imagem.

Selecione métodos, costura geométrica. Selecione a imagem na janela de entrada. Nas opções de costura, selecione nova opção de saída e azulejos de fusíveis.

Use o modo de referência com canal selecionado correspondente à fluorescência das vias aéreas. Abra a imagem em uma exibição 3D excedente. Se necessário, mude as cores usadas para sua apresentação.

Aqui mostramos o canal das vias aéreas em tons cinzas e canal Conidia em roxo. Para criar uma máscara de vias aéreas, use adicionar nova ferramenta de superfície. Selecione o canal das vias aéreas e escolha o parâmetro de suavização de 10 mícrons.

Vários filtros podem ser usados para excluir o sinal das vias aéreas. Primeiro, inspecione visualmente a superfície e defina o limiar de intensidade. Filtros adicionais, como a superfície, também podem ser aplicados em vias aéreas exclusivamente selecionadas, mas não em pleura ou vasos sanguíneos.

Em seguida, exclua manualmente o fragmento de superfície selecionado que não pertence às vias aéreas. Agora você pode observar a superfície criada e investigar as peças faltantes para corrigi-las mais tarde. Crie uma máscara para a superfície das vias aéreas usando opções editar e mascarar tudo.

Selecione o canal das vias aéreas e defina células de trabalho fora da superfície para 0,001. Aqui mostramos a máscara resultante em laranja. Salve o canal Conidia e a máscara das vias aéreas em duas pastas separadas, como série T de F.

Abra o arquivo com a imagem da máscara das vias aéreas. Faça a imagem binária. Siga o processo binário, faça binário.

Para se assemelhar à espessura da máscara, aplique várias funções 3D dilatados. Siga plugins, processo, dilatar 3D. Você também pode usar a funcionalidade de macros para fazer isso.

Após vários ciclos de processo de dilatação, use a função de furos de preenchimento. Siga o processo, binário, faça buracos. Para preencher os orifícios residuais na máscara manualmente, abra a região do gerente de juros.

seguir análise, ferramentas, gerente de ROI. Usando a ferramenta de seleção de polígonos selecione uma área que deve ser preenchida em uma projeção específica. Faça isso várias vezes para poucas projeções em zed-stack para que você possa interpolar formas das regiões de interesse.

Para interpolar as formas selecionadas, selecione todas elas e pressione mais, interpolar ROIs. Em seguida, encha todos os ROIs com branco. Use o procedimento de orifícios de enchimento mais uma vez.

Para remontar a espessura da máscara de volta após encher os orifícios, aplique a função 3D de erosão. Siga plugins, processe, corroa 3D. Você também pode usar micros para isso.

O número de iterações em erode 3D e LA 3D deve ser igual. Inicie o aplicativo de contagem Conidia. Pressione o botão adicionar arquivos e selecione as pastas com arquivos DIFF com a máscara de via aérea preparada e as imagens de fluorescência conidia.

Estabeleça um limite personalizado entre zero e um. Pressione OK e veja os resultados. Usando esta abordagem, realizamos a análise quantitativa da Conidia dentro e fora da árvore brônquica de camundongos seis horas após a aplicação de Conidia.

Os dados sugerem que, em nossa aplicação original, a maioria da Conidia penetra o espaço alveola e alocada lá no início da resposta imune inflamatória. A imagem tridimensional dos pulmões do camundongo com microscopia de varredura a laser confocal permite a identificação de Aspergillus fumigatus Conidia nas vias aéreas. O processamento de imagens tridimensionais usando este protocolo permite realizar análise quantitativa da distribuição conidia dentro e fora dos ramos brônquicos.

Nossa abordagem também pode ser utilizada para estimar a cinética da eliminação conidia dos afastamentos dos camundongos e comparar a distribuição anatômica da Conidia nos camundongos imunocompetuntes e imunocomprometidos. Além disso, usando essa abordagem, pode-se analisar a distribuição das micropartículas ou nano partículas aglomeradas nas vias aéreas.