Name: Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-06-01T12:30:00.000+00:00
Duration: 9 min 19 s
Description: Aprenda a extrair compostos orgânicos voláteis microbianos de amostras humanas usando extração sorbent assistida a vácuo (VASE) e cromatografia gasosa-espectrometria de massas. Este método sensível e livre de solventes permite identificar biomarcadores metabólicos em fezes, saliva e escarro.

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Agradecemos a Heather Maughan e Linda M. Kalikin pela edição cuidadosa deste manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelo NIH NHLBI (grant 5R01HL136647-04).

1. Headspace Sorbent Pen (HSP) e considerações de análise de amostras
NOTA: O HSP contendo o sêrbent Tenax TA foi selecionado para capturar uma ampla gama de voláteis. Tenax tem uma menor afinidade com a água em comparação com outros sorbents, o que lhe permite capturar mais VOCs de amostras de maior umidade. Tenax também tem um baixo nível de impurezas e pode ser condicionado para reutilização. A seleção sorbent também foi feita em consideração com a coluna instalada no GC-MS (ver a Tabela de Materiais).
<ol><li>Gerar controles negativos extraindo mídia e/ou amostrar em branco com as mesmas condições utilizadas para extração de amostras.</li>
	<li>Analise um HSP em branco (previamente confirmado como limpo e livre de fundo significativo) no GC-MS antes de analisar amostras extraídas. Passar em branco entre os tipos de amostra (por exemplo, três réplicas de bactérias monocultura, em branco, três réplicas de co-cultura de bactérias, em branco, etc.).</li>
	<li>Limitar o uso de itens de cuidados pessoais perfumados ou o consumo de alimentos fedidos antes da extração e análise da amostra. O ideal é preparar amostras em um capuz de biossegurança que não tenha sido limpo por álcool ou outros produtos de limpeza voláteis por pelo menos 30 minutos. Ligue o fluxo de ar no capô da biossegurança por 30-60 minutos antes da preparação da amostra.</li>
	<li>Mantenha amostras no gelo para limitar a liberação volátil durante a preparação da amostra.</li>
</ol>2. Preparação mono e co-cultura
<ol><li>No capô da biossegurança, culturas inoculadas de A. baumannii, S. aureus e P. aeruginosa na mídia de crescimento de Todd Hewitt. Incubar durante a noite a 37 °C com agitação de 200 rpm.</li>
	<li>Após a incubação da noite para o dia, realize o manuseio da cultura no capô da biossegurança. Diluir cada cultura à densidade óptica 0,05 a 500 nm.</li>
	<li>Misture co-culturas em partes iguais, e pipeta 200 μL de mídia de controle, mono-, ou co-cultura em cada poço de uma placa de 96 poços, e coloque em incubadora de 37 °C por 24 horas. Prepare uma segunda placa para uma incubação de 48 h.</li>
	<li>Ao final do período de incubação, prepare amostras para extração na seção 4. Culturas líquidas pipetas em tubos de microcentrifuuuagem e armazenam a -80 °C. NOTA: Neste ponto, as amostras podem ser armazenadas a -80 °C para extrair mais tarde, se necessário.</li>
</ol>3. Sondagem de isótopos estáveis na preparação de amostras biológicas
NOTA: As fezes e amostras de saliva foram doadas de doadores anônimos com aprovação do Conselho de Revisão Institucional irvine da Universidade da Califórnia (HS# 2017-3867). O esgoto veio de San Diego, CA. As amostras de escarro foram coletadas de sujeitos com fibrose cística como parte de um estudo maior aprovado pelo Conselho de Revisão Institucional da Faculdade de Medicina da Universidade de Michigan (HUM00037056).
<ol><li>Realize todas as preparações de amostras biológicas no capô da biossegurança.<ol>
<li>Para preparar amostras fecais, adicione 1 mL de água deionizada a 100 mg de fezes em um tubo de microcentrifuge de 1,5 mL e vórtice por 3 min. Coloque no gelo quando não estiver em uso.<ol>
<li>A 15 μL de mistura fecal e de água, adicione 485 μL de meio de Infusão cerebral (BHI) com 20 mM 13C de glicose, ou BHI com 30% de deutério (D2O). Certifique-se de que o volume final da amostra seja de 500 μL. Prepare amostras em triplicados técnicos.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Para preparar amostras de esgoto, adicione 500 μL de esgoto a 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose ou BHI com 30% D2O para um volume total de 1 mL. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso.</li>
		<li>Para preparar amostras de saliva, adicione 50 μL de saliva a 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose ou BHI com 30% D2O para um volume total de 550 μL. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso.</li>
		<li>Para preparar amostras de escarro para comparar os voláteis presentes na amostra antes e depois da colheita, realize uma primeira extração com 15 μL de escarro. Prepare amostras em triplicado. Coloque no gelo quando não estiver em uso. Prossiga para a seção 4 para extração amostral e extraia por 18 h a 37 °C com agitação de 200 rpm.</li>
		<li>Após a conclusão da primeira extração das amostras de escarro nãoculturadas, salve os frascos com escarro. Adicione 500 μL de BHI com 20 mM 13C de glicose aos frascos com escarro de 3,5,1. Coloque no gelo quando não estiver em uso.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Prossiga para a seção 4 para extração amostral.</li>
</ol>4. Extração da amostra
<ol><li>Coloque frascos de análise orgânica volátil vazio (VOA) (20 mL) na placa fria e coloque a placa fria no gelo no capô da biossegurança.</li>
	<li>Ligue a unidade de extração de caneta sorbent 5600 (SPEU) e ajuste à temperatura desejada conforme necessário para cada método. NOTA: Para experimentos de sondagem de isótopos estáveis a 37 °C, atingir o ponto de setpoint pode levar até 15 min. Para experimentos mono e co-cultura a 70 °C, chegar ao setpoint pode levar até 60 min.</li>
	<li>Colete HSPs limpos que sejam iguais ao número de amostras preparadas, incluindo HSPs para controles de mídia ou amostra.</li>
	<li>Rotular frascos VOA de 20 mL de acordo com amostras, réplicas e IDs HSP conforme necessário. Use um marcador que resista à água no caso de condensação se formar na parte externa do frasco enquanto estiver no gelo.</li>
	<li>Dentro do capô de biossegurança, desaparafusar a tampa branca no frasco, rapidamente tubos amostrado no frasco, e montar a tampa preta, forro de tampa e HSP. NOTA: As amostras não devem entrar em contato com o HSP, e o volume da amostra dependerá do tipo de amostra.</li>
	<li>Coloque o frasco contendo a amostra e o HSP de volta na placa fria.</li>
	<li>Repita as etapas 4.5 e 4.6 para cada amostra. Execute essas etapas por amostra em vez de todas de uma vez para evitar o aquecimento da amostra e, portanto, a liberação volátil prematura.</li>
	<li>Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas nos frascos de vidro, realize os seguintes passos fora do capô de biossegurança no banco. Ligue a bomba de vácuo, coloque os frascos sob vácuo até 30 mmHg e remova a fonte de vácuo. NOTA: Os frascos não precisam estar na bandeja fria após a aplicação do vácuo ter sido concluída.</li>
	<li>Verifique novamente a pressão depois de colocar todas as amostras sob vácuo usando o medidor de pressão. Se um frasco tiver um vazamento, certifique-se de que a tampa está aparafusada firmemente, e que os anéis O brancos do HSP e dos forros da tampa estejam corretamente no lugar. NOTA: Um selo comprometido pode resultar em diminuição da detecção volátil em comparação com um frasco sob vácuo.</li>
	<li>Coloque frascos na SPEU para o tempo e temperatura otimizados com agitação a 200 rpm. Extrair culturas por 1h a 70 °C. Extrair experimentos de sondagem de isótopos estáveis com amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro por 18 h a 37 °C.</li>
	<li>Coloque a placa fria a -80 °C para uso após o período de extração estiver completo.</li>
	<li>Quando a extração estiver completa, coloque amostras na placa fria por 15 minutos para extrair vapor de água do HSP e do espaço para a cabeça do frasco.</li>
	<li>Transfira os HSPs para as mangas. NOTA: O experimento pode ser pausado aqui por até ~1 semana em temperatura ambiente antes de perder os compostos mais altamente voláteis dos HSPs.</li>
</ol>5. Analisar amostras na cromatografia gasosa - espectrômetro de massa (GC-MS)
<ol><li>Use as seguintes configurações GC-MS (veja a Tabela de Materiais): 35 °C com uma carga de 5 minutos, rampa de 10 °C/min a 170 °C e uma rampa de 15 °C/min para 230 °C com uma proporção de 20:1 e um tempo total de execução de 38 min.</li>
	<li>Defina o método de desorção da seguinte forma: 2 min, 70 °C pré-aqueça; 2 min 260 °C desorção; 34 min, 260 °C bakeout; e 2 min, 70 °C pós assado.</li>
	<li>Configure a sequência de amostras e inicie a execução de acordo com a instrumentação.<ol>
<li>Para configurar uma sequência no Software Entech, abra o programa. Nas opções à direita do menu suspenso do instrumento, selecione 5800 | Sequência.</li>
		<li>Observe a tabela de sequência no software Entech semelhante ao do software GC-MS. Nomeie a coluna Sample ID de acordo com o número de date_vial atual. Tenha em mente que o nome é análogo ao nome na tabela de sequência GC-MS, e o método 5800 determina a taxa de rampa de temperatura, tempos de retenção, etc. (abre um menu para selecionar o método gerado na etapa 5.2).</li>
		<li>Tenha em mente que as colunas Bandeja e Posição determinam para onde o Trilho de Preparação de Amostras (SPR) irá para pegar os HSPs.<ol>
<li>Observe as duas bandejas com 30 pontos cada para a esquerda imediata, dispostas como seis colunas com cinco pontos cada. A posição da bandeja que é mais esquerda e mais próxima do usuário (frente) é a posição 1, enquanto a mais à direita, mais distante é a posição 30.</li>
			<li>Observe que essas bandejas são HSP A ou B, onde HSP B é a bandeja mais próxima da SPR (bandeja mais interna), e logo atrás do HSP B está HSP Blank. Coloque as amostras extraídas nas bandejas e selecione o local na sequência de acordo.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Salve a tabela de sequência, selecione Executar no lado esquerdo e , em seguida, Comece com branco em desorber se o HSP em branco estiver no desorber (denotado por um HSP marcado por rótulo amarelo).</li>
	</ol>
</li>
	<li>Observe que os HSPs serão manipulados pelo SPR para cada amostra na sequência. Deixe o SPR aquecer, então uma mensagem aparecerá na parte superior da tela para confirmar se o espaço em branco está no desorber. Clique em Skip para confirmar se a caneta está lá. Permita que o SPR execute todas as amostras automaticamente, e a sequência no lado GC-MS gravará automaticamente os dados em arquivos separados.</li>
</ol>6. Análise de dados
<ol><li>Dados de filtro de qualidade no software GC-MS (Tabela de Materiais).<ol>
<li>Revise cada pico no cromatógrafo e anote picos que correspondem à biblioteca do Instituto Nacional de Padrões & Tecnologia (NIST) (ou com outra biblioteca disponível).</li>
		<li>Adicione picos de cromatograma anotados ao método de processamento. Defina os critérios para a seleção de picos para incluir compostos com maior probabilidade superior a 75%, e garantir que o alinhamento de cada íon identificador do composto esteja dentro do centro do pico.<ol>
<li>Para adicionar um pico ao método de processamento, selecione Calibrar | Editar | composto Nome | inserir composto sob composto padrão externo. Adicione o nome do composto, tempo de retenção, Quant Signal Target Ion. Adicione os três maiores picos. Para salvar, selecione ok | | de método Salve.</li>
		</ol>
</li>
		<li>Uma vez que o método de processo seja configurado, proceda a Quantitate | Calcule e veja | Resultado de QEdit Quant.</li>
		<li>Inspecione cada composto para garantir que os picos estejam alinhados com seus tempos de retenção esperados e estejam acima do ruído de fundo.</li>
		<li>Uma vez que o QEdit tenha sido concluído, selecione Saída | Sim , para salvar os QEdits e voltar ao cromatógrafo principal. Exporte as integrações da área abrindo o arquivo no lado esquerdo. Selecione | quantitato Gerar Relatório.</li>
		<li>Para exportar arquivos para uso no DExSI, selecione | de arquivos Dados de exportação para | de formato AIA Crie novo diretório e selecione um local para o arquivo ou use diretório existente.</li>
		<li>Observe uma nova janela se abrindo para selecionar arquivos para exportação. Mova os arquivos para o lado direito da janela e clique em Process. Aguarde alguns segundos a alguns minutos, dependendo do número de arquivos sendo convertidos.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Corrija a abundância de isótopos no DExSI de acordo com as instruções para o software DExSI (https://github.com/DExSI/DExSI) e realize a análise com um software ou programa favorito (por exemplo, R). Os scripts usados para gerar as figuras estão localizados em <a data-saferedirecturl="https://www.google.com/url?q=https://github.com/joannlp/VOC_SIP&source=gmail&ust=1646398895210000&usg=AOvVaw18Jx-lKhdf3eNanCnF4OhQ" href="https://github.com/joannlp/VOC_SIP" target="_blank">https://github.com/joannlp/ VOC_SIP</a>.</li>
</ol>

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</ol>

V. L. V e S.J.B. D. foram ex-funcionários da Entech Instruments Inc., e K. W. é membro do Programa Universitário da Entech. J.P., J.K., e C.I.R. não têm conflitos de interesse para declarar.

Para identificar a produção volátil em culturas in vitro e amostras associadas ao homem, foram realizadas análises voláteis de monoculturas de P. aeruginosa, S. aureus e A. baumanii e isótopos estáveis de diferentes amostras biológicas. Na análise para as monoculturas e coculturas, os voláteis foram detectados realizando uma extração curta por 1h a 70 °C. A análise volátil das monoculturas e coculturas permitiu o levantamento dos compostos produzidos tanto por espécies individuais quanto duran...

Compostos orgânicos voláteis (VOCs) têm grande promessa de detecção e identificação bacteriana porque são emitidos de todos os organismos, e diferentes micróbios têm assinaturas exclusivas de VOC. Moléculas voláteis têm sido utilizadas como uma medida não invasiva para a detecção de várias infecções respiratórias, incluindo doença pulmonar obstrutiva crônica1, tuberculose2 na urina3 e pneumonia associada ao ventilador4, além de distinguir indivíduos com fibrose cística (CF) de indivíduos de controle saudável 5,6. Assinaturas voláteis têm sido usadas até mesmo para distinguir infecções específicas de patógenos em CF (Staphylococcus aureus7, Pseudomonas aeruginosa 8,9 e S. aureus vs. P. aeruginosa10). No entanto, com a complexidade dessas amostras biológicas, muitas vezes é difícil identificar a fonte de VOCs específicos.
Uma estratégia para desembaraçar os perfis voláteis de micróbios infecciosos múltiplos é realizar a análise do espaço da cabeça de microrganismos tanto na mono-quanto na cocultura11. A análise do headspace examina os analitos emitidos no "headspace" acima de uma amostra em vez daqueles incorporados na própria amostra. Metabólitos microbianos têm sido frequentemente caracterizados em monoculturas devido à dificuldade em determinar a origem dos metabólitos microbianos em amostras clínicas complexas. Ao traçar perfis voláteis de monoculturas bacterianas, os tipos de voláteis que um micróbio produz in vitro podem representar uma linha de base de seu repertório volátil. A combinação de culturas bacterianas, por exemplo, a criação de co-culturas e o perfil das moléculas voláteis produzidas podem revelar as interações ou a alimentação cruzada entre as bactérias12.
Outra estratégia para identificar a origem microbiana de moléculas voláteis é fornecer uma fonte de nutrientes que é rotulada com um isótopo estável. Isótopos estáveis são formas não radioativas de átomos com um número diferente de nêutrons. Em uma estratégia que vem sendo utilizada desde o início da década de 1930 para traçar o metabolismo ativo em animais13, o microrganismo se alimenta da fonte de nutrientes rotulado e incorpora o isótopo estável em suas vias metabólicas. Mais recentemente, um isótopo estável na forma de água pesada (D2O) tem sido usado para identificar S. aureus metabolicamente ativo em uma amostra clínica de escarro CF14. Em outro exemplo, a glicose com 13C foi usada para demonstrar a alimentação cruzada de metabólitos entre os isolados clínicos cf de P. aeruginosa e Rothia mucilaginosa12 .
Com o avanço das técnicas de espectrometria de massa, os métodos de detecção de pistas voláteis passaram de observações qualitativas para medidas mais quantitativas. Usando espectrometria de massa cromatografia gasosa (GC-MS), o processamento de amostras biológicas tornou-se ao alcance da maioria dos ambientes laboratoriais ou clínicos. Muitos métodos para levantamento de moléculas voláteis têm sido usados para traçar o perfil de amostras como alimentos, culturas bacterianas e outras amostras biológicas, e ar e água para detectar contaminação. No entanto, vários métodos comuns de amostragem volátil com alto rendimento exigem solvente e não são realizados com as vantagens proporcionadas pela extração a vácuo. Além disso, volumes ou quantidades maiores (superiores a 0,5 mL) de materiais amostrados são frequentemente necessários para análisede 15,16,17,18,19, embora isso seja específico do substrato e exija otimização para cada tipo e método de amostra.
Aqui, a extração sorbent assistida a vácuo (VASE) seguida de desorção térmica em um GC-MS foi empregada para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e coculturas e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro (Figura 1). Com quantidades amostrais limitadas, os VOCs foram extraídos de apenas 15 μL de escarro. Experimentos de sondagem de isótopos com amostras humanas exigiram a adição de uma fonte estável de isótopos, como glicose de 13C, e mídia para cultivar o crescimento da comunidade microbiana. A produção ativa de voláteis foi identificada como uma molécula mais pesada pelo GC-MS. A extração de moléculas voláteis sob um vácuo estático permitiu a detecção de moléculas voláteis com maior sensibilidade 20,21,22.

<table><tbody><tr><td>13C glicose</td> Bomba de Diaph <td>Sigma-Aldrich</td><td>389374-1G</td><td></td></tr><tr><td>2-Stg</td><td>Entech Instruments</td><td>01-10-20030</td><td></td></tr><tr><td>Frascos VOA de 20 mL</td><td>Fisher Scientific</td><td>5719110</td><td></td></tr><tr><td>24 mm Tampas pretas com furo, sem septo</td><td>Entech Instruments</td><td>01-39-76044B</td><td>mantém o revestimento da tampa no lugar no frasco</td></tr><tr><td>Revestimento do frasco de 24 mm para canetas sorventes</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-L024S</td><td>permite que as canetas façam uma vedação a vácuo na parte superior do frasco</td></tr><tr><td>5600 Unidade de extração de caneta sorvente (SPEU)</td><td>Entech Instruments</td><td>5600-SPES</td><td>5600 Unidade de extração de caneta sorvente -120 VAC</td></tr><tr><td>96-well placas de ensaio</td><td>Genesee</td><td>25-224</td><td></td></tr><tr><td>Mídia de infusão de coração cerebral (BHI)</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>53286-500G</td><td></td></tr><tr><td>ChemStation Stofware</td><td>Coluna Agilent</td><td></td><td></td></tr><tr><td>DB-624</td><td>Agilent</td><td>122-1364E</td><td>60 m, 0,25 mm de diâmetro, espessura de filme de 1,40 mícron, em GC-MS</td></tr><tr><td>Óxido de deutério</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>151882-1L</td><td></td></tr><tr><td>Dexsi software</td><td>Dexsi (código aberto)</td><td></td><td></td></tr><tr><td>GC-MS (7890A GC e 5975C inerte XL MSD com detector de triplo eixo)</td><td>Agilent</td><td></td><td>7890A GC e 5975C inerte XL MSD com eixo triplo </td></tr><tr><td>Headspace Bundle HS-B01, 120VA</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-B01</td><td>Itens para extração de headspace incluídos no pacote</td></tr><tr><td>Caneta sorvente Headspace (HSP) - em branco</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-0</td><td></td></tr><tr><td>Caneta sorvente Headspace (HSP) Tenax TA (35/60 Mesh)</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-HS-T3560</td><td></td></tr><tr><td>Tubos de microcentrífuga (2 mL)</td><td>VWR</td><td>53550-792</td><td></td></tr><tr><td>O-rings</td><td>Entech Instruments</td><td>SP-OR-L024</td><td></td></tr><tr><td>Trilho de Preparação de Amostras</td><td>Entech Instruments</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Caneta Sorvente condicionador térmico</td><td>Entech Instruments</td><td>3801-SPTC</td><td></td></tr><tr><td>Todd Hewitt (TH) mídia</td><td>Sigma</td><td>T1438-500G</td><td></td></tr></tbody></table>

capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo

Capturing Actively Produced Microbial Volatile Organic Compounds from Human-Associated Samples with Vacuum-Assisted Sorbent Extraction

Compostos orgânicos voláteis (VOCs) de amostras biológicas têm origens desconhecidas. Os VOCs podem se originar do hospedeiro ou de diferentes organismos de dentro da comunidade microbiana do hospedeiro. Para desembaraçar a origem dos VOCs microbianos, foram realizadas análises voláteis do espaço da cabeça de monoculturas bacterianas e co-culturas de Staphylococcus aureus, Pseudomonas aeruginosa e Acinetobacter baumannii, e testes estáveis de isótopos em amostras biológicas de fezes, saliva, esgoto e espito. Monoculturas foram utilizadas para identificar a produção volátil de espécies bacterianas individuais ou em combinação com a sondagem de isótopos estáveis para identificar o metabolismo ativo dos micróbios das amostras biológicas.
A extração sorbent assistida a vácuo (VASE) foi empregada para extrair os VOCs. O VASE é um método de extração de espaço livre de solventes fácil de usar, comercializado e livre de solventes para compostos semi-voláteis e voláteis. A falta de solventes e as condições de quase vácuo utilizadas durante a extração tornam o desenvolvimento de um método relativamente fácil e rápido quando comparado a outras opções de extração, como tert-butylation e microextração de fase sólida. O fluxo de trabalho descrito aqui foi usado para identificar assinaturas voláteis específicas de mono-e co-culturas. Além disso, a análise da sondagem estável de isótopos de amostras biológicas associadas humanas identificou CODs comumente ou exclusivamente produzidos. Este artigo apresenta o fluxo de trabalho geral e considerações experimentais do VASE em conjunto com a sondagem estável de culturas microbianas vivas.

Mono-e co-culturas de S. aureus, P. aeruginosa, e A. baumannii As monoculturas consistiam das espécies bacterianas S. aureus, P. aeruginosa e A. baumannii. Estes são patógenos oportunistas comuns encontrados em feridas humanas e infecções crônicas. Para identificar as moléculas voláteis presentes nas monoculturas e coculturas, foi realizada uma pequena extração de 1 h a 70 ...

Este protocolo descreve a extração de compostos orgânicos voláteis de uma amostra biológica com o método de extração sorbent assistido a vácuo, cromatografia gasosa juntamente com espectrometria de massa usando o Entech Sample Preparation Rail e análise de dados. Também descreve a cultura de amostras biológicas e sondagem de isótopos estáveis.

Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo

Volatile organic compounds (VOCs) from biological samples have unknown origins. VOCs may originate from the host or different organisms from within the ...

Este protocolo nos permite concentrar e identificar facilmente metabólitos voláteis e produzir ativamente voláteis de organismos microbianos em uma variedade de amostras biológicas. O VASE é um método mais fácil de usar para concentrar voláteis de baixa abundância. Tudo que você precisa é de uma amostra sob quase vácuo, e deixe a física fazer o resto.O acesso à análise volátil de amostras clínicas tem implicações importantes para a descoberta de biomarcadores metabólicos em vários estados diferentes da doença. Por exemplo, a condução e infecção do patógeno ou o sucesso da terapia antibacteriana poderiam ser detectados com análise volátil de saliva, saliva ou amostras de respiração. Para preparar amostras fecais, adicione um mililitro de água deionizada a 100 miligramas de fezes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e vórtice por três minutos.Mantenha as amostras no gelo quando não estiver em uso. Adicione 485 mililitros de bhi médio com 20 mililitros de glicose 13C ou BHI com 30% de deutério a 15 microliters de mistura fecal e de água, garantindo que o volume final da amostra seja de 500 microliters. Prepare amostras em triplicados técnicos.Para preparar amostras de esgoto, adicione 500 microliters de esgoto a 500 microliters de meio BHI com glicose de 13C ou 30% deutério para um volume total de um mililitro. Prepare amostras em triplicados e mantenha-as no gelo. Para preparar amostras de saliva, adicione 50 microliters de saliva a 500 microliters de meio BHI com glicose de 13C ou 30% deutério para um volume total de 550 microliters.Prepare amostras em triplicados e mantenha-as no gelo. Para preparar amostras de escarro, adicione 15 microliters de escarro em um frasco. Prepare amostras em triplicado e mantenha-as no gelo.Coloque frascos VOA vazios na placa fria e coloque a placa fria no gelo no capô da biossegurança. Ligue o SPEU 5600 e ajuste-o à temperatura necessária. Rotular frascos VOA de 20 mililitros de acordo com amostras, réplicas e IDs HSP usando um marcador resistente à água que resiste à água no caso de formas de condensação nas partes externas do frasco enquanto estiver no gelo.Dentro do capô de biossegurança, desaparafusar a tampa branca no frasco, rapidamente pipeta amostra no frasco, e montar o forro da tampa, tampa preta e HSP. Coloque o frasco contendo a amostra e o HSP de volta na placa fria. Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas nos frascos de vidro, ligue a bomba de vácuo, coloque os frascos sob vácuo e remova a fonte de vácuo.Verifique duas vezes a pressão depois de colocar todas as amostras sob vácuo usando o medidor de pressão. Se um frasco estiver vazando, certifique-se de que a tampa está aparafusada firmemente e que os anéis O brancos do HSP e dos forros da tampa estejam corretamente no lugar. Coloque frascos na SPEU para o tempo e temperatura otimizados com agitação a 200 RPM.Extrair culturas por uma hora a 70 graus Celsius e extrair experimentos estáveis de sondagem de isótipo com amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro por 18 horas a 37 graus Celsius. Coloque a placa fria a menos 80 graus Celsius para uso após o período de extração estiver completo. Quando a extração estiver completa, coloque amostras na placa fria por 15 minutos para retirar vapor de água do HSP e do espaço para a cabeça do frasco e, em seguida, transfira os HSPs para suas mangas.Configure a sequência de amostras no software Entech. Abra o programa e selecione 5800 e Sequência nas opções à direita do menu suspenso do instrumento. Salve a tabela de sequência, selecione Executar no lado esquerdo e, em seguida, Começar com Blank em Desorber se o HSP em branco não for o desorber.Observe que os HSPs serão manipulados pelo SPR para cada amostra na sequência. Deixe o SPR aquecer. Permita que o SPR execute todas as amostras automaticamente.A sequência no lado GC-MS gravará automaticamente os dados em arquivos separados. Adicione um pico ao método de processamento selecionando Calibrar seguido de Editar composto, nome e composto de inserção sob composto padrão externo. Adicione o nome dos compostos, o tempo de retenção e o íon alvo do sinal quântico.Adicione os três maiores picos, que incluem compostos com maior probabilidade superior a 75%, garantindo que o alinhamento de cada íon identificador do composto esteja dentro do centro do pico. Salve-o selecionando OK, seguido de Method e Save. Uma vez que o método de processo seja configurado, proceda para Quantitate e Calcule, então Exibir e QEDIT Quant Result para quantificar os dados.Aqui, a extração de sorbent assistida a vácuo foi seguida por desorção térmica em um GC-MS para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e co-culturas, e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro. As monoculturas consistiam das espécies bacterianas staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa e acinetobacter baumannii. 43 moléculas voláteis anotadas foram detectadas a partir das monoculturas em pontos de tempo de 24 e 48 horas.Houve mais incorporação de 13C em moléculas voláteis totalmente rotuladas em comparação com o deutério. 13C foi incorporado em 2-butanone, 3-hidroxi, 2, 3-butanedione diacetil, ácido acético e fenol para todas as amostras fecais, de esgoto e saliva. Acetona, ácido butanoico e ácido propanoico foram detectados como rotulados em saliva e esgoto.enquanto dimetil trissulfeto e dimetil de dissulfeto foram enriquecidos em amostras fecais e saliva. Os voláteis 1-propanol, 2-butanona, benzofenona, etanol e acetato de metiltígiol foram enriquecidos apenas em esgoto e 2, 3-pentanedione na saliva. O deutério foi incorporado ao ácido acético volátil, benzaldeído, trissulfeto de 4 metila-dimetil, e fenol de amostras de saliva ou esgoto.Ácido acético, trissulfeto de dimetila, acetona e propanol 2-metil foram mais abundantes nas amostras de escarro cultivadas do que amostras de escarro não cultivadas. Uma análise multivariada permutada de variantes, uma PERMANOVA, foi realizada em uma matriz de distância Bray-Curtis das abundâncias voláteis das amostras de escarro de fibrose cística. Verificou-se que o sujeito que doou a amostra explica 51% da variação na escarro cultivada com rótulo 13C e 33% da variação da escarro não cultivada.Aqui, mostra-se o sucesso da rotulagem estável de isótopos com glicose de 13C em voláteis de amostras de escarro cultivadas coletadas de sete pessoas com fibrose cística. Os voláteis que possuem maior incorporação de 13C para a maioria das amostras são mostrados no painel 5A, aqueles com incorporação de 13C de menor percentual na maioria das amostras de escarro estão no painel 5B, e moléculas com menor conversão de 13C em uma minoria das amostras de escarro são mostradas no painel 5C. Verifique sempre as pressões do frasco depois de cerca de um minuto.Um vácuo quebrado derrota a sensibilidade e a velocidade do método VASE. Após este procedimento, se for realizada a sondagem de isótopos estáveis, o DNA pode ser extraído do material restante para identificar organismos microbianos ou espécies que possam ter contribuído para a produção das moléculas voláteis. Este método também é útil na detecção de voláteis de qualquer tipo de amostra sem sondagem de isótopos.Com vantagens de sensibilidade e baixo volume amostral, muitas aplicações podem se beneficiar dessa técnica.

capturing-actively-produced-microbial-volatile-organic-compounds-from

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Secundário de ionização electrospray espectrometria de massa (SESI-MS) permite a detecção de compostos orgânicos voláteis (VOCs) sem a necessidade de qualquer pré-tratamento da amostra. Este protocolo fornece instruções para a caracterização (dentro de minutos) rápida de VOCs bacteriana usando SESI-MS.

Caracterizando Voláteis bacteriana secundária usando ionização Espectrometria de Massa (SESI-MS)

A espectrometria de massa de tempo de reação de transferência de prótons de voo permite a análise de alta sensibilidade, rápida e não invasiva de compostos orgânicos voláteis. Para demonstrar seu potencial, damos três exemplos: fermentação de ácido lático de iogurte (monitoramento on-line de bioprocessos), diferentes genótipos de maçã (triagem em larga escala) e espaço retronasal após beber café (análise do espaço nasal).

PTR-ToF-MS acoplado com um sistema automatizado da amostragem e uma análise costurada dos dados para estudos do alimento: Monitoração do Bioprocess, seleção e análise do espaço do nariz

Apresentamos o VacuSIP, um método simples, não intrusivo e confiável para amostragem pontual limpa e precisa de água. O sistema foi desenvolvido e avaliado para a coleta simultânea da água inalada e exalada por alimentadores de suspensão bentônica in situ, para medir de forma limpa a remoção e excreção de compostos particulados e dissolvidos.

VacuSIP, um método melhorado para Inex<em&gt; In Situ</em&gt; Medição de partículas e dissolvidos compostos Processado por alimentadores de suspensão ativa

A extração de Fizzy é uma nova técnica de laboratório para análise de compostos voláteis e semivoláteis. Um gás transportador é dissolvido na amostra líquida aplicando sobrepressão e agitando a amostra. A câmara de amostra é então descomprimida. As espécies de analito são liberadas para a fase gasosa devido à efervescência.

Extração efervescente de compostos orgânicos voláteis combinados com a espectrometria de massa de quadrupoolos de ionização química de pressão atmosférica

Um ânion trocar o método à base de resina, adaptado para amostragem de bioaerosol baseado em choque de vírus é demonstrada o líquido. Quando acoplado com deteção molecular a jusante, o método permite a fácil e sensível de detecção de vírus de Bioaerossóis.

Detecção de vírus de Bioaerossóis usando resina de troca de ânion

Aqui, apresentamos um protocolo para coletar os voláteis de fragrâncias florais de flores florescendo, usando um procedimento de amostragem não destrutivo.

Coleção rápida de voláteis florais da fragrância usando uma técnica da coleção do volatile do Headspace para a amostragem térmica da desorção de GC-MS

Desenvolvemos uma metodologia eficaz para amostragem e análise de sinais de odor, a fim de entender como eles podem ser usados na comunicação animal. Particularmente, usamos microextração de fase sólida do headspace, juntamente com espectrometria de massa cromatografia gasosa para analisar os componentes voláteis de odores animais e marcas de odor.

Amostragem e Análise de Sinais de Aroma Animal

A Microextração de Fase Sólida de Vaporização Total (TV-SPME) vaporiza completamente uma amostra líquida enquanto os analitos são sorbados em uma fibra SPME. Isso permite a particionamento do analito entre apenas o vapor solvente e o revestimento de fibra SPME.

Espectrometria de massa de cromatografia a gás emparelhada com microextração de fase sólida de vaporização total como ferramenta forense

Uma plataforma de microextração-gás-cromatografia em fase sólida do headspace é descrita aqui para identificação e quantificação volátil rápida, confiável e semi-automatizada em frutas de groselha madura. Essa técnica pode ser usada para aumentar o conhecimento sobre o aroma de frutas e selecionar cultivares com sabor aprimorado para fins de reprodução.

Perfil de compostos voláteis em frutas groselha usando microextração de fase sólida do headspace acoplado à espectrometria de massa de cromatografia gasosa

Este protocolo apresenta um fluxo de trabalho totalmente automatizado para a extração de geosmina e 2-metilisoborneol de tecidos de peixes ricos em água e lipídios. O método permite a detecção precoce dessas moléculas antes que atinjam os limiares de odor. São fornecidos dados representativos de um ambiente de aquicultura.

Extração e Detecção de Geosmina e 2-Metilisoborneol em Água e Peixes usando Sondas de Extração Sortiva de Alta Capacidade e GC-MS

Aprenda a extrair compostos orgânicos voláteis microbianos de amostras humanas usando extração sorbent assistida a vácuo (VASE) e cromatografia gasosa-espectrometria de massas. Este método sensível e livre de solventes permite identificar biomarcadores metabólicos em fezes, saliva e escarro.

Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo (Vídeo) | JoVE Journal

Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo

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