Capturando compostos orgânicos voláteis microbianos produzidos ativamente a partir de amostras associadas ao homem com extração sorbent assistida a vácuo

Este protocolo nos permite concentrar e identificar facilmente metabólitos voláteis e produzir ativamente voláteis de organismos microbianos em uma variedade de amostras biológicas. O VASE é um método mais fácil de usar para concentrar voláteis de baixa abundância. Tudo que você precisa é de uma amostra sob quase vácuo, e deixe a física fazer o resto.

O acesso à análise volátil de amostras clínicas tem implicações importantes para a descoberta de biomarcadores metabólicos em vários estados diferentes da doença. Por exemplo, a condução e infecção do patógeno ou o sucesso da terapia antibacteriana poderiam ser detectados com análise volátil de saliva, saliva ou amostras de respiração. Para preparar amostras fecais, adicione um mililitro de água deionizada a 100 miligramas de fezes em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro e vórtice por três minutos.

Mantenha as amostras no gelo quando não estiver em uso. Adicione 485 mililitros de bhi médio com 20 mililitros de glicose 13C ou BHI com 30% de deutério a 15 microliters de mistura fecal e de água, garantindo que o volume final da amostra seja de 500 microliters. Prepare amostras em triplicados técnicos.

Para preparar amostras de esgoto, adicione 500 microliters de esgoto a 500 microliters de meio BHI com glicose de 13C ou 30% deutério para um volume total de um mililitro. Prepare amostras em triplicados e mantenha-as no gelo. Para preparar amostras de saliva, adicione 50 microliters de saliva a 500 microliters de meio BHI com glicose de 13C ou 30% deutério para um volume total de 550 microliters.

Prepare amostras em triplicados e mantenha-as no gelo. Para preparar amostras de escarro, adicione 15 microliters de escarro em um frasco. Prepare amostras em triplicado e mantenha-as no gelo.

Coloque frascos VOA vazios na placa fria e coloque a placa fria no gelo no capô da biossegurança. Ligue o SPEU 5600 e ajuste-o à temperatura necessária. Rotular frascos VOA de 20 mililitros de acordo com amostras, réplicas e IDs HSP usando um marcador resistente à água que resiste à água no caso de formas de condensação nas partes externas do frasco enquanto estiver no gelo.

Dentro do capô de biossegurança, desaparafusar a tampa branca no frasco, rapidamente pipeta amostra no frasco, e montar o forro da tampa, tampa preta e HSP. Coloque o frasco contendo a amostra e o HSP de volta na placa fria. Uma vez que todas as amostras tenham sido preparadas nos frascos de vidro, ligue a bomba de vácuo, coloque os frascos sob vácuo e remova a fonte de vácuo.

Verifique duas vezes a pressão depois de colocar todas as amostras sob vácuo usando o medidor de pressão. Se um frasco estiver vazando, certifique-se de que a tampa está aparafusada firmemente e que os anéis O brancos do HSP e dos forros da tampa estejam corretamente no lugar. Coloque frascos na SPEU para o tempo e temperatura otimizados com agitação a 200 RPM.

Extrair culturas por uma hora a 70 graus Celsius e extrair experimentos estáveis de sondagem de isótipo com amostras fecais, de esgoto, saliva e escarro por 18 horas a 37 graus Celsius. Coloque a placa fria a menos 80 graus Celsius para uso após o período de extração estiver completo. Quando a extração estiver completa, coloque amostras na placa fria por 15 minutos para retirar vapor de água do HSP e do espaço para a cabeça do frasco e, em seguida, transfira os HSPs para suas mangas.

Configure a sequência de amostras no software Entech. Abra o programa e selecione 5800 e Sequência nas opções à direita do menu suspenso do instrumento. Salve a tabela de sequência, selecione Executar no lado esquerdo e, em seguida, Começar com Blank em Desorber se o HSP em branco não for o desorber.

Observe que os HSPs serão manipulados pelo SPR para cada amostra na sequência. Deixe o SPR aquecer. Permita que o SPR execute todas as amostras automaticamente.

A sequência no lado GC-MS gravará automaticamente os dados em arquivos separados. Adicione um pico ao método de processamento selecionando Calibrar seguido de Editar composto, nome e composto de inserção sob composto padrão externo. Adicione o nome dos compostos, o tempo de retenção e o íon alvo do sinal quântico.

Adicione os três maiores picos, que incluem compostos com maior probabilidade superior a 75%, garantindo que o alinhamento de cada íon identificador do composto esteja dentro do centro do pico. Salve-o selecionando OK, seguido de Method e Save. Uma vez que o método de processo seja configurado, proceda para Quantitate e Calcule, então Exibir e QEDIT Quant Result para quantificar os dados.

Aqui, a extração de sorbent assistida a vácuo foi seguida por desorção térmica em um GC-MS para examinar os perfis voláteis de monoculturas bacterianas e co-culturas, e identificar voláteis produzidos ativamente com isótopos estáveis sondando de fezes humanas, saliva, esgoto e amostras de escarro. As monoculturas consistiam das espécies bacterianas staphylococcus aureus, pseudomonas aeruginosa e acinetobacter baumannii. 43 moléculas voláteis anotadas foram detectadas a partir das monoculturas em pontos de tempo de 24 e 48 horas.

Houve mais incorporação de 13C em moléculas voláteis totalmente rotuladas em comparação com o deutério. 13C foi incorporado em 2-butanone, 3-hidroxi, 2, 3-butanedione diacetil, ácido acético e fenol para todas as amostras fecais, de esgoto e saliva. Acetona, ácido butanoico e ácido propanoico foram detectados como rotulados em saliva e esgoto.

enquanto dimetil trissulfeto e dimetil de dissulfeto foram enriquecidos em amostras fecais e saliva. Os voláteis 1-propanol, 2-butanona, benzofenona, etanol e acetato de metiltígiol foram enriquecidos apenas em esgoto e 2, 3-pentanedione na saliva. O deutério foi incorporado ao ácido acético volátil, benzaldeído, trissulfeto de 4 metila-dimetil, e fenol de amostras de saliva ou esgoto.

Ácido acético, trissulfeto de dimetila, acetona e propanol 2-metil foram mais abundantes nas amostras de escarro cultivadas do que amostras de escarro não cultivadas. Uma análise multivariada permutada de variantes, uma PERMANOVA, foi realizada em uma matriz de distância Bray-Curtis das abundâncias voláteis das amostras de escarro de fibrose cística. Verificou-se que o sujeito que doou a amostra explica 51% da variação na escarro cultivada com rótulo 13C e 33% da variação da escarro não cultivada.

Aqui, mostra-se o sucesso da rotulagem estável de isótopos com glicose de 13C em voláteis de amostras de escarro cultivadas coletadas de sete pessoas com fibrose cística. Os voláteis que possuem maior incorporação de 13C para a maioria das amostras são mostrados no painel 5A, aqueles com incorporação de 13C de menor percentual na maioria das amostras de escarro estão no painel 5B, e moléculas com menor conversão de 13C em uma minoria das amostras de escarro são mostradas no painel 5C. Verifique sempre as pressões do frasco depois de cerca de um minuto.

Um vácuo quebrado derrota a sensibilidade e a velocidade do método VASE. Após este procedimento, se for realizada a sondagem de isótopos estáveis, o DNA pode ser extraído do material restante para identificar organismos microbianos ou espécies que possam ter contribuído para a produção das moléculas voláteis. Este método também é útil na detecção de voláteis de qualquer tipo de amostra sem sondagem de isótopos.

Com vantagens de sensibilidade e baixo volume amostral, muitas aplicações podem se beneficiar dessa técnica.