Name: Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-05-05T14:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 40 s
Description: Aprenda a capturar e analisar complexos proteicos nativos de lisados teciduais usando eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida. Este método estabiliza associações proteicas lábeis em condições próximas às nativas para identificação.

ai_agent_IP

ai_agent

maintenance

instantTrialDurationMinutes

isBiopharma

enableNewMyJoveSectionDesign

educationFeatures

seoMetaApi

ai_copilot_institution_blacklist

ai_chat_institution_blacklist

freeAccessWindow

ssoRoleCapture

scheduledMaintenanceBanner

joveLabsFeatures

disable_autoplay_for_bots

extended_trial_duration

5 minutes

playerTrialDesktop

Compatível com o DA034783 NIH / NIDA. Agradecemos Bryan A. Killinger de assistência técnica com o multimero-PAGE.

1. Preparação do Tecido <ol><li> Preparar 10 ml de 4x tamp de amostra BN-PAGE (Bis 200 mM (2-hidroxietil) metano amino-tris (hidroximetil) (Bis-Tris), NaCl 200 mM, 40% w / v de glicerol, 0,004% de Ponceau S, pH 7,2 ). NOTA: esta solução pode ser feita com antecedência e guardadas a 4 ° C. </li><li> Dilui-se 250 uL de tampão de amostra 4x em 750 uL de dH2O contendo mistura de inibidores de protease comercial 1x. Vortex e frio no gelo. </li><li> Homogeneizar 20 mg de tecido alvo no tampão de amostra de 1 mL de 1x gelada BN-PAGE com 30 movimentos de um homogeneizador Dounce limpo. NOTA: Para este experimento de demonstração, o tecido alvo é tecido cerebral de ratos todo. Ap homogeneizao, as amostras podem ser tratadas com detergente suave, tal como 2% de digitonina para solubilizar e permitir a electroforese de proteínas de membrana. </li><li> Transferir o homogeneizado para um tubo de microcentrífuga de 1,5 ml, e centrifugar a 14000 xg durante 30 min para sedimentar os conteúdos celulares insolúveis. after centrifugação, decanta-se o sobrenadante para um tubo limpo em gelo. </li><li> Seguir as instruções do fabricante para medir a concentração de proteína sobrenadante utilizando ácido bicinchonínico (BCA) ou um ensaio de quantificação de proteína semelhante. </li><li> Se a amostra (s) de homogenado conter detergente, adicionar uma quantidade de 5% de Coomassie Blue G-250 em solução aquosa suficiente para levar a solução homogeneizado a 0,25% de Coomassie. </li></ol> 2. BN-PAGE <ol><li> Dilui-se 25 ml de 20x azul nativa (BN) electroforese estoque de tampão (1,0 M de Bis-Tris, 1,0 M de tricina, pH 6,8) em 475 mL de dH2O contendo 0,002% de Azul de Coomassie para fazer 500 ml de tamp de corrida 1x. <ol><li> Se as amostras contêm detergente, em vez disso fazer 250 ml de tamp de corrida 1x contendo 0,02% de Coomassie e mais 250 mL contendo nenhum. </li></ol></li><li> tampão (s) frio a 4 ° C. </li><li> Limpar e montar um gel de poliacrilamida que derrama Cassete de acordo com as instruções do fabricante. </li><li&gt; Despeje o gel de poliacrilamida BN (3% de camada de empilhamento em T, 6% de camada de resolução T) de acordo com uma receita padrão 7 e coloque o pente de poço. </li><li> Após a polimerização dos géis, enxágüe a cassete com dH2O e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Remova o pente do poço e encha os poços com 1x buffer de execução BN-PAGE. Evite encher toda a câmara interna com tampão até as amostras serem carregadas. <ol><li> Se as amostras contiverem detergente, encher os poços com o tampão contendo 0,02% de Azul de Coomassie. NOTA: Execute os passos 2.7-2.9 a 4 ° C. </li></ol></li><li> Usando pontas de carga de gel, pipetar um volume de homogeneizado contendo 20 μg de proteína nos poços desejados. Pipetar um volume equivalente de 1x tampão de amostra BN-PAGE em poços não utilizados. NOTA: Utilizar a concentração de proteína determinada a partir do ensaio de BCA para calcular o volume apropriado de homogeneizado a adicionar aos poços. </li><li> Depois as amostras são carregadas, encher a câmara interior com tampão 1x BN-PAGE em execução. Certifique-se o gel é inteiramente submerso em tampão. Em seguida, encher a câmara exterior com 1x tampão de corrida para o nível indicado pelo fabricante. <ol><li> Se as amostras contêm detergente, encher a câmara interior com o tampão 1x contendo 0,02% de azul de Coomassie, e a câmara exterior com tampão de corrida 1x isento de corante. </li></ol></li><li> Ligar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese as proteínas no gel a 150 V até que a banda de corante progride ~ 2 centímetros em resolver camada. Parar e desligar a alimentação eléctrica. </li></ol> 3. A reticulação NOTA: Efectuar os Passos 3,1-3,6 a 4 ° C. <ol><li> Desmontar o aparelho de electroforese, e separar as vidraças da cassete de gel. Remover e descartar a camada de empilhamento. </li><li> Corte cuidadosamente o gel apenas abaixo da aresta inferior da frente do corante. Levaro cuidado de fazer este corte tão lisa e direita quanto possível, e, em seguida, descartar a peça não utilizada do gel. Isto deixará uma ~ 2 cm de largura, tira horizontal em gel de poliacrilamida, que contêm toda a proteína na amostra de homogenato. </li><li> Aparar quaisquer porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel. </li><li> Cuidadosamente colocar a tira em 10 mL de tampão fosfato salino (PBS), em um recipiente pequeno, e misturar suavemente por nutação durante 30 minutos para equilibrar. </li><li> Após equilíbrio, descartar e substituir o PBS com mais 10 ml. Pipetar 500 L de 25 mM de DSP dissolvido em sulfóxido de dimetilo na PBS, e continuar a misturar como anteriormente (passo 3.4), durante 30 min. </li><li> Decantar a solução de DSP. Adicionar 10 ml de 0,375 M de tris (hidroximetil) aminometano (Tris-HCl), pH 8,8, contendo 2% de dodecilsulf ato de sódio (SDS) para extinguir o DSP que não reagiu. Continuar nutação durante 15 minutos. </li></ol> 4. SDS-PAGE <ol><li> Enquanto tira de gel é têmpera, preparar SDS-PASoluções de gel GE de acordo com métodos padrão 9. Não adicione reagentes de polimerização. </li><li> Após terminar a reacção, voltar a tira de gel ΒΝ até à temperatura ambiente, e fundido a tira dentro de uma nova cassete de gel. <ol><li> Para fazer isso, cuidadosamente pegar o gel e colocá-lo sobre uma placa de gel de espaçador cassete limpo. </li><li> Oriente a tira de modo que a parte inferior da frente do corante é mais próximo à parte superior da nova cassete (ou seja, o lado que viajou mais distante durante BN-PAGE deve ser o mais próximo do topo da nova cassete, a tira de gel deve ser invertida a partir do seu prévio orientação). Ver Figura 3. </li><li> Colocar a tira de tal modo que o seu bordo superior encontra-se ainda com que a borda superior da placa de cobertura será (ou seja, ele vai estar no topo do gel de novo). Certifique-se a frente de corante é paralela às bordas horizontais da placa de vidro. </li><li> Empurrar um lado da tira excisado contra uma das paredes do espaçador, deixando espaço no tele outro lado para o gel para ser vertida e um padrão de proteína, ou escada para ser carregado. </li><li> Se a borda inferior da tira de gel contém quaisquer áreas serrilhadas ou irregulares, cortá-los cuidadosamente distância. Se estiver presente, eles vão bolhas armadilha durante gel de vazamento. </li><li> Uma vez que a tira de gel está posicionada correctamente, colocar a placa de cobertura sobre a placa do espaçador. Aplique uma leve pressão para empurrar as bolhas de ar aprisionadas. </li><li> Continuar a montar o aparelho que derrama-gel de acordo com as instruções do fabricante. </li></ol></li><li> Adicionar reagentes de polimerização para o tampão de gel de resolução, e despeje-a cassete de gel preparada, usando uma pipeta serológica. Encher a cassete de gel a aproximadamente 2 cm abaixo da tira de gel BN-PAGE excisado, para deixar espaço para a camada de empilhamento. </li><li> Adicionar 100 mL de butanol sobre a parte superior do gel derramado, e permitir 30 min para a polimerização da camada de resolver. Decantar o butanol. </li><li> Adicionar reagentes de polimerização para a solução de gel de empilhamento. Usando um serologpipeta ical, verter a camada de empilhamento para preencher todo o espaço vazio que permanece na cassete de gel. <ol><li> Inclinar a cassete de gel, como a camada de empilhamento é derramado de modo a preencher o espaço abaixo da tira de gel, e as bolhas de ar não estão presos. </li><li> À medida que o tampão de gel de empilhamento preenche o espaço vazio por baixo da tira de gel, retornar gradualmente a cassete de gel a base de nível. </li><li> Continuar a preencher o espaço vazio ao lado da tira de gel excisado com o tampão do gel de empilhamento, até que quase transborda. </li></ol></li><li> Permitir que a camada de empilhamento para polimerizar durante 30 minutos. NOTA: Adicione 10x SDS-PAGE O tampão de corrida (Tris 250 mM (hidroximetil) aminometano (tris), 1.9 M de glicina, 1% de SDS), enquanto que o gel é a polimerização. Isso também pode ser feito com antecedência e armazenado à temperatura ambiente. </li><li> Dilui-se 50 mL de 10X de SDS-PAGE estoque tampão de corrida em 450 mL de dH2O para fazer tampão de trabalho 1x. </li><li> Depois da camada de empilhamento tem polimerizado, remover a cassete de gel da vertendoaparelho, lavar com dH 2 O, e montar o aparelho de electroforese de acordo com as instruções do fabricante. </li><li> Encher a câmara interior completamente com tampão de corrida SDS-PAGE 1x, em seguida, encher a câmara exterior para o nível indicado pelo fabricante. </li><li> Carregar o espaço ao lado da tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou padrão de proteína apropriada. </li><li> Anexar os eléctrodos para a fonte de alimentação, e electroforese das amostras a 120 V. Quando o corante de Coomassie corre fora do gel, parar e desligar a fonte de alimentação. </li><li> Analisar o gel, utilizando métodos padrão de eiectromancheamento e detecção da proteína através da ligação 10 anticorpo. </li></ol>

<ol><li>Alberts, B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+cell+as+a+collection+of+protein+machines%3A+preparing+the+next+generation+of+molecular+biologists%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">The cell as a collection of protein machines: preparing the next generation of molecular biologists.</a> Cell. 92 (3), 291-294 (1998).</li>
<li>Pawson, T., Nash, P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions+define+specificity+in+signal+transduction%5BTitle%5D)+AND+%22Genes+Dev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions define specificity in signal transduction.</a> Genes Dev. 14 (9), 1027-1047 (2000).</li>
<li>Rual, J. F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Towards+a+proteome-scale+map+of+the+human+protein-protein+interaction+network%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Towards a proteome-scale map of the human protein-protein interaction network.</a> Nature. 437 (7062), 1173-1178 (2005).</li>
<li>Phizicky, E. M., Fields, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Protein-protein+interactions%3A+methods+for+detection+and+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22Microbiol+Rev%22%5BJournal%5D)">Protein-protein interactions: methods for detection and analysis.</a> Microbiol Rev. 59 (1), 94-123 (1995).</li>
<li>Ho, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+identification+of+protein+complexes+in+Saccharomyces+cerevisiae+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Systematic identification of protein complexes in Saccharomyces cerevisiae by mass spectrometry.</a> Nature. 415 (6868), 180-183 (2002).</li>
<li>Krogan, N. J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+landscape+of+protein+complexes+in+the+yeast+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Global landscape of protein complexes in the yeast Saccharomyces cerevisiae.</a> Nature. 440 (7084), 637-643 (2006).</li>
<li>Wittig, I., Braun, H. P., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blue+native+PAGE%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Blue native PAGE.</a> Nat Protoc. 1 (1), 418-428 (2006).</li>
<li>Schagger, H., Cramer, W. A., von Jagow, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+molecular+masses+and+oligomeric+states+of+protein+complexes+by+blue+native+electrophoresis+and+isolation+of+membrane+protein+complexes+by+two-dimensional+native+electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Biochem%22%5BJournal%5D)">Analysis of molecular masses and oligomeric states of protein complexes by blue native electrophoresis and isolation of membrane protein complexes by two-dimensional native electrophoresis.</a> Anal Biochem. 217 (2), 220-230 (1994).</li>
<li>Laemmli, U. K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Cleavage+of+structural+proteins+during+the+assembly+of+the+head+of+bacteriophage+T4%5BTitle%5D)+AND+%22Nature%22%5BJournal%5D)">Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4.</a> Nature. 227 (5259), 680-685 (1970).</li>
<li>Beisiegel, U. <a target="_blank" href="http://onlinelibrary.wiley.com/doi/10.1002/elps.1150070102/abstract">Protein Blotting.</a> Electrophoresis. 7 (1), 1-18 (1986).</li>
<li>Killinger, B. A., Moszczynska, A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+alpha-Synuclein+Multimer+Stoichiometry+in+Complex+Biological+Samples+by+Electrophoresis%5BTitle%5D)+AND+%22Anal+Chem%22%5BJournal%5D)">Characterization of alpha-Synuclein Multimer Stoichiometry in Complex Biological Samples by Electrophoresis.</a> Anal Chem. 88 (7), 4071-4084 (2016).</li>
<li>Newman, A. J., Selkoe, D., Dettmer, U. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+new+method+for+quantitative+immunoblotting+of+endogenous+alpha-synuclein%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A new method for quantitative immunoblotting of endogenous alpha-synuclein.</a> PLoS One. 8 (11), e81314(2013).</li>
<li>Wong, S. S. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=author%3aWong%2C+SS+%22Chemistry+of+protein+conjugation+and+cross-linking%22">Chemistry of protein conjugation and cross-linking</a>. , CRC Press. Boca Raton. (1991).</li>
<li>Seddon, A. M., Curnow, P., Booth, P. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Membrane+proteins%2C+lipids+and+detergents%3A+not+just+a+soap+opera%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Membrane proteins, lipids and detergents: not just a soap opera.</a> Biochim Biophys Acta. 1666 (1-2), 105-117 (2004).</li>
<li>Tanford, C., Reynolds, J. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Characterization+of+membrane+proteins+in+detergent+solutions%5BTitle%5D)+AND+%22Biochim+Biophys+Acta%22%5BJournal%5D)">Characterization of membrane proteins in detergent solutions.</a> Biochim Biophys Acta. 457 (2), 133-170 (1976).</li>
<li>Peters, K., Richards, F. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+cross-linking%3A+reagents+and+problems+in+studies+of+membrane+structure%5BTitle%5D)+AND+%22Annu+Rev+Biochem%22%5BJournal%5D)">Chemical cross-linking: reagents and problems in studies of membrane structure.</a> Annu Rev Biochem. 46, 523-551 (1977).</li>
<li>Lomant, A. J., Fairbanks, G. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Chemical+probes+of+extended+biological+structures%3A+synthesis+and+properties+of+the+cleavable+protein+cross-linking+reagent+%5B35S%5Ddithiobis%28succinimidyl+propionate%29%5BTitle%5D)+AND+%22J+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Chemical probes of extended biological structures: synthesis and properties of the cleavable protein cross-linking reagent [35S]dithiobis(succinimidyl propionate).</a> J Mol Biol. 104 (1), 243-261 (1976).</li>
<li>Sun, F., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Crystal+structure+of+mitochondrial+respiratory+membrane+protein+complex+II%5BTitle%5D)+AND+%22Cell%22%5BJournal%5D)">Crystal structure of mitochondrial respiratory membrane protein complex II.</a> Cell. 121 (7), 1043-1057 (2005).</li>
<li>Wittig, I., Schagger, H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Native+electrophoretic+techniques+to+identify+protein-protein+interactions%5BTitle%5D)+AND+%22Proteomics%22%5BJournal%5D)">Native electrophoretic techniques to identify protein-protein interactions.</a> Proteomics. 9 (23), 5214-5223 (2009).</li>
</ol>

Os autores não têm nada a revelar.

interações proteína-proteína são importantes para cada tarefa seres vivos realizar. Devido a isso, eles são objecto de intenso escrutínio e pesquisa. Multímero-PAGE é um novo método para a captura, separar, e a análise de uma grande variedade de complexos de proteínas. Foi anteriormente demonstrado a sua aplicabilidade ao estudo oligimerization da doença associada à proteína α-sinucleína 11. No entanto, é extensível para muitos complexos de proteína, tal como demonstrado na Figura 2.</str...

<html> Função celular normal é dependente de interacções proteína-proteína de 1, 2. Como resultado, as doenças humanas são frequentemente caracterizadas por perturbações na montagem e comportamento de vários complexos de proteínas 3. A capacidade de caracterizar essas interacções é, por conseguinte, crítica. meios actuais de detecção destas interacções requerem purificação de proteínas alvo, muitas vezes seguidos por suspenso de seus parceiros interactuantes. Clássica de purificação é realizado por centrifugação diferencial, precipitação e / ou cromatograf ia em 4. Estes métodos são demorados, deve ser alterado para cada proteína alvo, e muitas vezes resultam em baixos rendimentos. Modernos métodos de purificação envolvem a fusão de sinais peptídicos a proteínas alvo, seguido de imunoprecipitação ou de extracção em colunas carregadas com esferas ligadas a uma molula de captura 5,&quot;&gt; 6. Embora esta seja extensível para muitas proteínas, que exige modificação da sequência do alvo, potencialmente resultando em construções que diferem na afinidade para os seus parceiros de ligação usuais. A natureza delicada de algumas interacções proteína-proteína significa que este método pode não ser aplicável para muitos cenários. Além disso, os ensaios de pull-down utilizadas para mapear as interações proteína-proteína pode não capturar uma imagem celular precisa, devido à graus restritos de liberdade e os níveis de não-nativos da proteína isca. Idealmente, os complexos de proteína podia ser detectada nos seus estados nativos, sem a necessidade de purificação ou suspenso. Electroforese em gel de poliacrilamida nativa azul (BN-PAGE) foi desenvolvido como uma alternativa menos desnaturante a electroforese em gel de poliacrilamida dodecil sulfato de sódio (SDS-PAGE), e permite a separação de algumas proteínas e complexos a partir de amostras biológicas 7. No entanto, as proteínas em BN-PAGE separadas com base em um large número de variáveis, incluindo tamanho, carga, estrutura tridimensional, e associação com outras moléculas. As interacções destes factores resultam frequentemente em co-separação de proteínas, formação de agregados, e pobre resolução banda de proteína. Electroforese em gel nativo de poliacrilamida bidimensional resolve alguns, mas não todos, estes problemas 8. Para contornar as complicações associadas com a separação nativa, alguns autores utilizam reagentes reactivos de amina de reticulao, tais como ditiobis (propionato de succinimidilo) (DSP), para capturar os complexos de proteína em lisados de tecido 4. Estes lisados ​​tratados pode então ser desnaturado e separadas por SDS-PAGE, preservando ao mesmo tempo o tamanho nativo e a composição de complexos de proteínas. No entanto, uma vez que os reagentes de reticulação reagir com base na proximidade de uma molécula para outra, e proteínas em lisados ​​de tecido tem muitos graus de liberdade e pode interagir estocasticamente, inespecífica transversal fundo-linking pode ser elevado, especialmente em amostras concentradas. Isso pode levar a resultados difíceis de interpretar. Aqui, demonstramos a utilização de um método híbrido BN-PAGE / SDS-PAGE, denominada electroforese em gel de poliacrilamida-multero (multímero-PAGE), para separar e detectar os conjuntos de proteínas em misturas complexas. Inicialmente, lisado de células é suspenso em gel de poliacrilamida através BN-PAGE. O gel contendo o lisado é então feito reagir com o reagente DSP reticulação. e ligeiramente separadas no gel imobilizada-pseudo, as proteínas são muito menos susceptíveis de reagir de forma não específica, o que significa que a reactividade cruzada de fundo ligante é reduzida. Após a reticulação, as bandas de gel são excisadas e separados por meio de SDS-PAGE. O gel resultante pode então ser analisada por quaisquer meios tipicamente associados com electroforese em gel de poliacrilamida. Este método permite a separação e a detecção de complexos de proteínas nativas em lisado de tecido não modificada, sem a necessidade de purificação adicional ou puxar-Down.

<table><tbody><tr><td><forte>Produtos Químicos</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&epsilon;-Ácido aminocapróico</td><td>Sigma</td><td>A2504</td><td></td></tr><tr><td>Acrilamida</td><td>Acros Organics</td><td>164855000</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>Acrilamida / bisacrilamida 37,5: 1 (solução estoque de 40% T)</td> <td>BioRad</td><td>161-0148</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>Persulfato de amônio</td><td>Sigma</td><td>A3678</td><td></td></tr><tr><td>Anti coelho IgG-HRP de cabra</td><td>Santa Cruz Biotecnologia</td><td>sc-2004</td><td></td></tr><tr><td>Kit de ensaio de ácido bicinchonínico</td><td>Thermofisher</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Bis-tris</td><td>Sigma</td><td>B9754</td><td></td></tr><tr><td>Albumina de soro bovino</td><td>Sigma</td><td>A9647</td><td></td></tr><tr><td>Butanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A399-1</td><td></td></tr><tr><td>Kit de substrato de quimioluminescência</td><td>ThermoFisher</td><td>24078</td><td></td></tr><tr><td>Coomassie blue G-250</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>B0770</td><td></td></tr><tr><td>Digitonin</td><td>Sigma</td><td>D141</td><td>Toxic.</td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido Fisher</td><td>Scientific</td><td>D128-1</td><td></td></tr><tr><td>Dithiobis (succinimidilpropionato)</td> <td>Thermo Scientific</td><td>22585</td><td></td></tr><tr><td>Leite desnatado seco</td><td>LabScientific</td><td>M0841</td><td></td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Sigma</td><td>G9012</td><td></td></tr><tr><td>Glicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP381-5</td><td></td></tr><tr><td>Halt Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Thermofisher</td><td>78430</td><td></td></tr><tr><td>Ácido clorídrico</td><td>Fisher Scientific</td><td>A144SI-212</td><td>Para titulação. Cáustico.</td></tr><tr><td>Metanol</td><td>Fisher Scientific</td><td>A412-4</td><td>Para ativação de membrana PVDF. Tóxico.</td></tr><tr><td>Monoclonal anti &alfa;-sinucleína IgG de coelho</td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-7011-R</td><td></td></tr><tr><td>N,N,N',N'-tetrametiletilenodiamina</td><td>Sigma</td><td>T9281</td><td></td></tr><tr><td>N,N'-metilenobisacrilamida</td><td>Acros Organics</td><td>16479</td><td>Tóxico.</td></tr><tr><td>NP40</td><td>Boston Bioproducts</td><td>P-872</td><td></td></tr><tr><td>Polissorbato 20 (tween-20)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP337-500</td><td></td></tr><tr><td>Membranas de transferência de fluoreto de polivinilideno</td><td>Thermo Scientific</td><td>88518</td><td></td></tr><tr><td>Ponceau S</td><td>Sigma</td><td>P3504</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de potássio</td><td>Fisher Scientific</td><td>P217-3</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de potássio coquetel de</td> inibidor de protease monobásico <td>Sigma</td><td>P9791</td><td></td></tr> Solução SDS <tr><td></td><td>Thermo Scientific</td><td>88265</td><td></td></tr><tr><td>(10% p / v)</td> <td>BioRad</td><td>161-0416</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP358-212</td><td></td></tr><tr><td>Dodecil sulfato de sódio</td><td>Sigma</td><td>L37771</td><td></td></tr><tr><td>Fosfato de sódio monobásico</td><td>Fisher Scientific</td><td>BP329-1</td><td></td></tr><tr><td>Tricine</td><td>Sigma</td><td>T0377</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris Fisher</td><td>Scientific</td><td>BP152-500</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (tampão de 0,5 M, pH 6,8)</td> <td>BioRad</td><td>161-0799</td><td></td></tr><tr><td>Tris-HCl (tampão de 1,5 M, pH 8,8)</td> <td>BioRad</td><td>161-0798</td><td></td></tr> <tr><td>< forte > Nome< / forte ></td> <td>< forte > Empresa < / forte ></td> <td>< forte> Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Instruments</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>GE Imagequant LAS 4000</td><td>GE Healthcare</td><td>28-9558-10</td><td></td></tr><tr><td>Software ImageJ</td><td>NIH</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Synergy H1 leitor de microplacas</td><td>BioTek</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Gel Former + Stand</td><td>Biorad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga Microfuge 22R</td><td>Beckman Coulter</td><td></td><td></td></tr><tr><td>2 mL homogeneizador</td><td></td><td></td><td></td>de dounce</tr><tr><td>Misturador de vórtice</td><td>Fisher Scientific</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Homogeneizador de tecidos ultrassônico</td><td>Fisher Scientific</td><td>FB120220</td><td></td></tr></tbody></table>

multímero-page: um método para capturar e solução de proteína em amostras biológicas complexos

Multimer-PAGE: A Method for Capturing and Resolving Protein Complexes in Biological Samples

Existem muitos métodos bem desenvolvidos para purificar e estudar proteínas individuais e peptídeos. No entanto, a maioria das funções celulares são realizados por redes de complexos de proteínas que interagem, que são muitas vezes difíceis de investigar, porque a sua ligação é não-covalente e facilmente perturbado por técnicas de purificação. Este trabalho descreve um método de estabilização e separando complexos de proteína nativa a partir de tecido não modificado utilizando electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional. lisado de tecido é carregado num gel de poliacrilamida nativo azul-n desnaturante, em seguida, uma corrente eléctrica é aplicada até que a proteína migra uma curta distância dentro do gel. A tira de gel contendo a proteína migrado é então excisada e incubadas com as ditiobis reactivos de amina reagente de ligação cruzada (propionato de succinimidilo), que estabiliza covalentemente complexos de proteínas. A tira de gel contendo complexos de ligação cruzada é então moldada num gel de poliacrilamida de sulfato de dodecilo de sódio, e tele complexos são separados completamente. O método baseia-se em técnicas e materiais familiares para a maioria dos biólogos moleculares, o que significa que é barato e fácil de aprender. Enquanto que é limitada na sua capacidade para separar adequadamente extremamente grandes complexos, e não tem sido universalmente bem sucedida, o método foi capaz de capturar uma grande variedade de complexos bem estudadas, e é provavelmente aplicável a muitos sistemas de interesse.

Neste experimento de demonstração, multero-PAGE foi realizada em toda lisado cérebro de rato. As proteínas resultantes separadas foram transferidas para membranas de difluoreto de polivinilideno (PVDF), e em seguida sondadas com anticorpos contra proteínas que são conhecidas por formar complexos. A Figura 1 mostra uma validação do protocolo por dois meios. Em primeiro lugar, demonstra-se que as proteínas de ligação cruzada são susceptíveis ao corte por adição de um agent...

Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

There are many well-developed methods for purifying and studying single proteins and peptides. However, most cellular functions are carried out by ...

O objetivo geral deste protocolo é permitir que pesquisadores capturem, separem e analisem complexos proteicos nativos extraídos de lisados teciduais utilizando eletroforese em gel de poliacrilamida. Este método pode auxiliar pesquisadores que estudam proteínas, pois é capaz de estabilizar associações proteicas normalmente lábeis em condições próximas às nativas, permitindo sua identificação e análise subsequente. A principal vantagem desta técnica é que utiliza métodos biológicos comuns, sendo amplamente aplicável e podendo ser adaptada às metas de cada pesquisador.Para iniciar este procedimento, prepare-se para a eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul conforme descrito no protocolo textual. Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e realize a eletroforese das proteínas no gel a 150 volts até que a faixa de corante progrida aproximadamente dois centímetros na camada de resolução. Neste ponto, pare e desconecte a fonte de alimentação.Após desmontar o aparelho de eletroforese, separe as lâminas de vidro da cassete do gel. Remova e descarte a camada de empilhamento. Corte cuidadosamente o gel logo abaixo da borda inferior da frente do corante, tomando cuidado para torna

multimer-page-method-for-capturing-resolving-protein-complexes

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

A célula permeável reticulador DSP [dithiobis (succinimidyl propionato)] estabiliza interações transitória e...

Isolamento de proteínas lábeis Multi-Complexos por In vivo Controlled Cellular Cross-Linking and Imuno-magnética cromatografia de afinidade

Neste vídeo, descrevemos a caracterização de complexos multiprotein (PPM) por eletroforese em gel de poliacrilamida nativo azul (BN-PAGE). Em uma primeira dimensão, dialisadas lisados ​​celulares são separados por BN-PAGE para identificar PPM individual. Em uma segunda dimensão SDS-PAGE, PPM de interesse são subdivididos para analisar os seus constituintes por immunoblotting.

Eletroforese em Gel de Poliacrilamida azul Nativo (BN-PAGE) para Análise de Complexos Multiproteicos de Lisados ​​Celular

Este vídeo descreve o PAGE multimérico para separar complexos de proteínas nativas de homogeneizados de tecidos. A técnica é um híbrido das técnicas PAGE e SDS-PAGE nativas azuis. Os complexos separados podem ser caracterizados e estudados por seu papel no funcionamento celular.

Multimer-PAGE para separação de complexos de proteínas nativas: uma técnica de separação híbrida que consiste em Blue Native-PAGE e SDS-PAGE para separar proteínas multiméricas intactas do lisado tecidual

Aqui descrevemos protocolos para romper as células de mamíferos por moagem em estado sólido a uma temperatura criogénica, produzem um extracto celular a partir do pó de células resultante, e isolar complexos proteína de interesse por captura de afinidade sobre esferas paramagnéticas escala mícron acoplado com anticorpo.

Proteína de captura por afinidade complexos a partir de células de mamíferos Cryomilled

Aqui apresenta-se os protocolos para a purificação por afinidade de complexos de proteínas e a sua separação por PAGE nativa azul, seguido pelo perfil correlação protea utilizando espectrometria de massa quantitativo livre etiqueta. Este método é útil para resolver interactoma em complexos de proteínas distintas.

Resolver purificada por afinidade complexos de proteínas por Azul Native PAGE e Proteína Correlação Profiling

A arquitetura de complexos de proteínas é essencial para a sua função. Combinar várias técnicas de espectrometria de massa provou poderosa para estudar seu assembly. Nós fornecemos protocolos para cross-linking química e espectrometria de massa nativa e mostrar como essas técnicas complementares ajudam a elucidar a arquitetura de assemblies multi o subunit da proteína.

Combinando reticulação química e espectrometria de massa de complexos de proteínas intactas para estudar a arquitetura de montagens de proteínas com multi- subunidades

Este manuscrito descreve o protocolo para a purificação de afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP). Este novo método facilita o isolamento específico e caracterização proteômica a jusante de algum duas proteínas interagindo, enquanto excluir un-complexado proteínas individuais, bem como os complexos formados com concorrentes parceiros de ligação.

Dissecando a proteínas multi sinalização complexos pela purificação da afinidade de complementação Bimolecular (BiCAP)

Interações da proteína-proteína e proteína-metabólito são cruciais para todas as funções celulares. Aqui, descrevemos um protocolo que permite a análise paralela dessas interações com uma proteína de escolha. Nosso protocolo foi otimizado para culturas de células de plantas e combina a purificação da afinidade com espectrometria de massa base de proteína e deteção do metabólito.

2 em 1: uma etapa de purificação da afinidade para a análise paralela de proteína-proteína e proteína-metabólito complexos

Um protocolo versátil de cryoslicing BN-MS usando um micrótomo é apresentado para o perfilamento complexome de alta resolução.

Perfilamento Complexome de alta resolução por Cryoslicing BN-MS Analysis

Este protocolo combina fotometria de massa com um novo sistema microfluídico para investigar interações proteína-proteína de baixa afinidade. Essa abordagem é baseada na rápida diluição de complexos altamente concentrados em solução, o que permite medições de baixa afinidade e amplia a aplicabilidade da fotometria de massa.

Análise da formação de complexos proteicos em concentrações micromolares por acoplamento de microfluídica com fotometria de massa

Aprenda a capturar e analisar complexos proteicos nativos de lisados teciduais usando eletroforese bidimensional em gel de poliacrilamida. Este método estabiliza associações proteicas lábeis em condições próximas às nativas para identificação.

Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos

Explorar mais vídeos