Multímero-PAGE: Um método para capturar e Solução de proteína em amostras biológicas Complexos
May 5th, 2017
Um método para estabilizar e separando complexos de proteína nativa a partir de lisado de tecido não modificado utilizando uma proteína de reticulação reactivo com amina ligado a uma electroforese em gel de poliacrilamida bidimensional novo sistema (PAGE) é apresentada.
O objetivo geral deste protocolo é permitir que os pesquisadores capturem, separem e analisem complexos de proteínas nativas extraídos de lisados de tecidos usando eletroforese em gel de poliacrilamida. Este método pode ajudar os pesquisadores que estudam proteínas porque é capaz de estabilizar associações de proteínas lábeis em condições quase nativas, permitindo sua identificação e posterior análise. A principal vantagem dessa técnica é que ela usa métodos biológicos comuns, por isso é amplamente aplicável e pode ser adaptada aos objetivos do pesquisador individual.
Para iniciar este procedimento, prepare-se para a eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul, conforme descrito no protocolo de texto. Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e eletroforese as proteínas no gel a 150 volts até que a banda de corante progrida aproximadamente dois centímetros na camada de resolução. Neste ponto, pare e desconecte a fonte de alimentação.
Depois de desmontar o aparelho de eletroforese, separe os painéis de vidro do de gel. Remova e descarte a camada de empilhamento. Corte cuidadosamente o gel logo abaixo da borda inferior da frente do corante, tomando cuidado para tornar o corte o mais liso e reto possível.
Em seguida, descarte o pedaço de gel não utilizado. Apare todas as porções não utilizadas ao longo das bordas da tira de gel. Coloque cuidadosamente a tira em 10 mililitros de solução salina tamponada com fosfato em um pequeno recipiente e misture delicadamente por anotação por 30 minutos para equilibrar.
Após o equilíbrio, descarte e substitua o PBS por mais 10 mililitros. Pipete 500 microlitros de DSP 25 milimolares dissolvidos em dimetilsulfóxido no PBS e continue misturando como antes por 30 minutos. Após 30 minutos, despeje a solução DSP.
A 10 mililitros de HSCL 0,375 molar, pH 8,8, contendo 2% de dodecil sulfato de sódio para extinguir o DSP não reagido. Continue a notação por 15 minutos. Enquanto a tira de gel está resfriando, prepare as soluções de gel SDS-PAGE de acordo com os métodos padrão.
Não adicione os reagentes de polimerização. Após a têmpera, retorne a tira de gel nativo azul à temperatura ambiente e funda a tira em um novo de gel. Para fazer isso, pegue cuidadosamente o gel e coloque-o em uma placa espaçadora de de gel limpa.
Oriente a tira de forma que ela seja invertida de sua orientação anterior e a parte inferior da frente do corante fique mais próxima da parte superior do novo. Coloque a tira de forma que sua borda superior fique nivelada com a borda superior da placa de cobertura. Certifique-se de que a frente da tinta esteja paralela às bordas horizontais da placa de vidro.
Empurre um lado da tira excisada contra uma das paredes espaçadoras, deixando espaço do outro lado para o gel ser derramado e um padrão de proteína ou escada a ser carregado. Se a borda inferior da tira de gel contiver áreas irregulares ou irregulares, corte-as com cuidado. Assim que a tira de gel estiver posicionada corretamente, coloque a placa de cobertura sobre a placa espaçadora.
Aplique uma leve pressão para empurrar para fora as bolhas de ar presas. Continue a montar o aparelho de vazamento de gel de acordo com as instruções do fabricante. A tira de gel às vezes se desloca quando a placa superior está sendo colocada.
Ajuda deixar a tira pendurada um pouco na borda da placa superior para que possa ser ajustada com uma espátula para corrigir quaisquer deslocamentos. Adicione reagentes de polimerização ao tampão de gel de resolução e despeje-o no de gel preparado usando uma pipeta sorológica. Encha o de gel até aproximadamente dois centímetros abaixo da tira de gel nativa azul excisada PAGE para deixar espaço para a camada de empilhamento.
Em seguida, adicione 100 microlitros de butanol por cima do gel derramado e aguarde 30 minutos para a polimerização da camada de resolução antes de despejar o butanol. Em seguida, adicione os reagentes de polimerização à solução de gel de empilhamento. Usando uma pipeta sorológica, despeje a camada de empilhamento para preencher todo o espaço vazio restante no de gel.
Incline o de gel à medida que a camada de empilhamento é derramada para que ela preencha o espaço abaixo da tira de gel e as bolhas de ar não fiquem presas. À medida que o buffer de gel de empilhamento preenche o espaço vazio abaixo da tira de gel, retorne gradualmente o de gel para o nível da base. Continue a preencher o espaço vazio próximo à tira de gel excisada com o tampão de gel de empilhamento até que quase transborde.
Em seguida, deixe a camada de empilhamento polimerizar por 30 minutos. Após a polimerização da camada de empilhamento, remova o de gel do aparelho de vazamento, enxágue com água destilada e monte o aparelho de eletroforese de acordo com as instruções do fabricante. Encha a câmara interna completamente com 1x buffer de execução SDS-PAGE.
Em seguida, encha a câmara externa até o nível indicado pelo fabricante. Carregar o espaço junto à tira de gel excisada com uma escada de peso molecular ou com o padrão proteico adequado. Conecte os eletrodos à fonte de alimentação e eletroforese as amostras a 120 volts.
Quando o corante Coomassie sair do gel, pare a corrida e desconecte a fonte de alimentação. Analise o gel usando métodos padrão de eletroblotting e detecção de proteínas baseada em anticorpos. A validação do multímero-PAGE é mostrada aqui via immunoblot.
O complexo cinesina capturado é clivado por difio-3-itol, mostrando que os agregados de alto peso molecular são formados pela reticulação de substituintes menores. Descritos aqui, os lisados cerebrais tratados com concentrações crescentes de SDS ou Triton aumentaram a detecção de alfa-sinucleína monomérica enquanto diminuíam a detecção do oligômero tetromer solúvel. Aqui, são mostrados resultados representativos do multímero-PAGE usado para capturar complexos solúveis no lisado cerebral de ratos.
As proteínas foram detectadas via immunoblot. O peso monomérico esperado de cada proteína é mostrado abaixo das pistas. Da mesma forma, a captura de complexos ligados à membrana é mostrada aqui.
O Multimer-PAGE ocasionalmente falha em capturar um complexo, como é mostrado no complexo respiratório SDHA dois blot. Uma discussão de possíveis explicações para isso pode ser encontrada no protocolo de texto. Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em cerca de oito horas se for executada corretamente.
Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar a reticulação em gel de complexos de proteínas nativas, seguida de remoldagem em gel e separação por SDS-PAGE secundário. Não se esqueça de que trabalhar com acrilamida pode ser extremamente perigoso e o equipamento de proteção individual deve ser usado durante a fundição do gel. Após este procedimento, os complexos estabilizados separados podem ser eluídos ou cortados do gel e podem ser analisados por vários meios, incluindo imunodetecção ou espectrometria de massa, dependendo das necessidades do pesquisador.
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Visão Geral
Este protocolo apresenta um método para estabilizar e separar complexos proteicos nativos de lisados teciduais usando um sistema inovador de eletroforese em gel de poliacrilamida bidimensional (PAGE). Permite a análise de associações proteicas sob condições quase nativas.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Bioquímica
- Proteômica
- Eletroforese
Contexto
- Entender complexos proteicos é crucial para muitos estudos biológicos.
- Associações proteicas nativas podem ser lábeis e difíceis de analisar.
- Métodos biológicos comuns facilitam a aplicação desta técnica.
- Este método permite abordagens personalizadas para análise proteica.
Propósito do Estudo
- Capturar e analisar complexos proteicos nativos de lisados teciduais.
- Estabilizar associações proteicas para melhor identificação.
- Fornecer um método amplamente aplicável para pesquisadores.
Métodos Utilizados
- Preparação para eletroforese em gel de poliacrilamida nativa azul.
- Eletroforese de proteínas a 150 volts.
- Monitoramento do progresso da banda do corante no gel.
- Utilização de um agente de ligação proteica reativo a amina.
Principais Resultados
- Estabilização bem-sucedida de complexos proteicos nativos.
- Separaçã eficaz de proteínas em lisados teciduais.
- Identificação de associações proteicas sob condições quase nativas.
Conclusões
- Este método aprimora a análise de complexos proteicos.
- É adaptável a vários objetivos de pesquisa.
- A utilização de métodos comuns aumenta a acessibilidade para pesquisadores.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Multimer-PAGE enables biopharma R&D teams to stabilize and resolve native protein complexes from tissue lysates under near-native conditions, supporting target validation and mechanistic de-risking in early discovery. By preserving labile protein associations that are often lost in conventional purification, the method improves predictive confidence in pathway analysis and complex-based drug target identification. This approach enhances translational continuity from discovery through preclinical evaluation by providing reproducible, quantitative readouts of complex formation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses by capturing native protein interactions without perturbing non-covalent bindings.
- Operational Value: Uses accessible blue-native and SDS-PAGE techniques familiar to most molecular biology teams, reducing specialized training needs.
- Predictive Value: Supports functional target validation by stabilizing complexes for downstream identification via immunoblot or mass spectrometry.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Generates resolved complex profiles that can serve as quantitative biomarkers for assay standardization across screening campaigns.
- Operational Value: Relies on inexpensive, widely available reagents and equipment, enabling scalable implementation in core facilities.
- Assay Readiness: Produces SDS-PAGE-separated complexes compatible with downstream detection methods like immunodetection, supporting high-content screening integration.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Bridges discovery and preclinical workflows by preserving complex integrity for validation in disease-relevant systems.
- Mechanistic De-risking: Allows assessment of complex formation under varying conditions (e.g., detergent or SDS exposure), informing target robustness.
- Risk-Adjusted Advancement: Enables go/no-go decisions based on complex stability and abundance, reducing late-stage attrition due to mechanistic uncertainty.
Pipeline & Workflow Integration
Multimer-PAGE fits within the discovery continuum from target identification through lead optimization, providing a mechanistic bridge to preclinical validation by enabling analysis of native protein complexes in tissue-derived samples.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by capturing endogenous complexes from unmodified tissue lysates.
- Screening: Enables assay development through reproducible complex separation and detection, facilitating compound effect evaluation on target engagement.
- Analytics: Delivers quantitative separation of protein complexes via secondary SDS-PAGE, allowing comparison of conditions or treatments.
- Translational Research: Connects to preclinical continuity by maintaining complex stability for validation in disease models, supporting biomarker alignment.
- Enterprise Reuse: Functions as a reusable platform capability rather than a single-use assay, adaptable across multiple targets and disease areas.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity in protein interaction networks.
- Operational Value: Enhances reproducibility and standardization through standardized gel-based workflows and familiar electrophoresis techniques.
- Strategic Value: Improves capital efficiency by enabling early de-risking of targets, minimizing investment in poorly validated mechanisms.
- Portfolio Impact: Informs risk-adjusted prioritization by providing direct evidence of complex formation and stability in native contexts.
Implementation Considerations
- Requires expertise in native PAGE and SDS-PAGE techniques, including gel casting and electrophoretic separation.
- Depends on access to electrophoresis apparatus, power supplies, and standard reagents such as DSP crosslinker and SDS.
- Necessitates cross-team standardization for consistent complex capture and detection across discovery and preclinical groups.
- Involves adaptation considerations for different tissue types and complex sizes, as separation efficiency may vary with molecular weight.
- Limited by challenges in resolving extremely large complexes and potential variability in crosslinking efficiency, as noted in source material.
