Name: Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2021-08-12T15:00:00.000+00:00
Duration: 9 min 55 s
Description: Aprenda a usar sequenciamento de inserção de transposon para identificar genes essenciais na colonização de insetos por Burkholderia gladioli. Este método revela fatores genéticos cruciais para simbioses bacterianas.

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Agradecemos a Junbeom Lee por fornecer a cepa E. coli WM3064+pRL27 para conjugação e orientação no procedimento, Kathrin Hüffmeier por ajudar na solução de problemas durante a geração de bibliotecas mutantes, e prof. André Rodrigues para apoiar a coleta de insetos e a aquisição de licenças. Agradecemos também a Rebekka Janke e Dagmar Klebsch pelo apoio na coleta e criação dos insetos. Reconhecemos as autoridades brasileiras para a concessão das seguintes autorizações de acesso, coleta e exportação de espécimes de insetos: autorização do SISBIO Nº 45742-1, 45742-7 e 45742-10, processo CNPq nº 01300.004320/2014-21 e 01300.0013848/2017-33, IBAMA Nº 14BR016151DF e 20BR035212/DF). Esta pesquisa foi apoiada por financiamento da German Science Foundation (DFG) Research Grants FL1051/1-1 e KA2846/6-1.

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Os autores declaram que não têm conflito de interesses relativos ao estudo.

Uma biblioteca mutante B. gladioli transposon foi gerada para identificar importantes fatores de colonização hospedeira na interação simbiótica entre besouros L. villosa e bactérias B. gladioli. Os principais passos do protocolo foram conjugação, infecção por hospedeiro, preparação da biblioteca de DNA e sequenciamento.
Como muitas cepas de Burkholderia são favoráveis à modificação genética por conjugação24,25, o plasmídeo que carrega o transposon e de inserção de antibióticos foi conjugado com sucesso na cepa B. gladioli Lv-StA da E. coli. Tentativas anteriores de transformação por eletroporação renderam-se muito baixas a quase nenhum transformador B. gladioli. É aconselhável otimizar a técnica de transformação do organismo alvo para produzir eficientemente um grande número de transformadores.
Uma rodada de conjugação e 40 pontos de conjugação interromperam 3.736 genes em B. gladioli Lv-StA. Em retrospectiva, múltiplas rodadas de conjugação seriam necessárias para interromper a maioria dos 7.468 genes e obter uma biblioteca saturada. Notavelmente, o tempo de incubação durante a conjugação não foi permitido exceder 12-18 h, que é o fim da fase de crescimento exponencial de B. gladioli. Permitir a conjugação além da fase exponencial de crescimento das células bacterianas reduz as chances de sucesso da obtenção de transconjugantes26. Portanto, o período de conjugação deve ser ajustado de acordo com o crescimento das espécies bacterianas.
Para realizar com sucesso um experimento envolvendo a infecção de bibliotecas mutantes em um hospedeiro, é importante avaliar o tamanho do gargalo populacional bacteriano durante a colonização e a diversidade de mutantes na biblioteca antes da infecção1,2,27. Em preparação para o experimento, estimamos o número mínimo de besouros que devem ser infectados para ter uma grande chance de que cada mutante na biblioteca seja amostrado e autorizado a colonizar. Também foram calculados o tempo aproximado de geração bacteriana in vivo e o número de gerações durante a duração do experimento. A cultura in vitro foi então cultivada a um número comparável de gerações, ajustando o tempo de incubação. Para um experimento de infecção semelhante em outros hospedeiros não-modelos, a capacidade de manter uma cultura de laboratório e uma fonte constante dos organismos hospedeiros é desejável.
Após o crescimento da biblioteca mutante in vivo e in vitro e coleta de amostras, foi realizado um protocolo modificado de preparação da biblioteca de DNA para sequenciamento de inserção transposon. A modificação no protocolo envolveu a concepção de primers PCR personalizados e a adição de etapas pcr para selecionar para fragmentos de DNA contendo o de inserção. Como o protocolo foi personalizado, ciclos adicionais de PCR no protocolo aumentaram o risco de superamplificação e obtenção de fragmentos de adaptador-adaptador hibridizado nas bibliotecas finais. Assim, recomenda-se uma etapa final de limpeza (sem seleção de tamanho) após os dois PCRs, pois ajuda na remoção desses fragmentos. A distribuição de tamanho das bibliotecas de DNA ainda era mais ampla do que o esperado. No entanto, o aumento da profundidade de sequenciamento forneceu dados suficientes que foram filtrados durante a análise bioinformática, obtendo resultados satisfatórios.
Como a mutagênese mediada pela transposon gera milhares de inserções aleatórias em um único experimento, é possível gerar uma biblioteca saturada de mutantes que contém todos, exceto aqueles mutantes onde genes essenciais para o crescimento bacteriano foram interrompidos. Provavelmente não trabalhamos com uma biblioteca mutante saturada, dadas as estimativas de genes essenciais em outros estudos sobre Burkholderia sp. 28,29. Uma biblioteca não saturada, no entanto, ajuda a explorar vários genes candidatos para estudos adicionais usando mutagênese direcionada. Antes dos experimentos, também é importante lembrar que alguns transposons têm locais-alvo de inserção específicos que aumentam a abundância de mutantes em certos loci no genoma30. Os transposons mariner são conhecidos por atingir os locais AT para inserção31, e os transposons Tn5 têm um viés GC32,33. Incluir etapas durante a análise de bioinformática para reconhecer hotspots para inserções transposon ajudará na avaliação de qualquer viés de distribuição.
Embora propenso a contratempos, um experimento de sequenciamento de inserção transposon bem projetado pode ser uma ferramenta poderosa para identificar muitos genes condicionalmente importantes em bactérias dentro de um único experimento. Por exemplo, uma dúzia de genes em Burkholderia seinalis importantes para a supressão da necrose da folha de orquídeas foram identificados pela combinação de mutagênese transposon e genômica34. Além da Burkholderia,vários genes e transportadores de adesão e motilidade foram identificados como importantes fatores de colonização em Snodgrassella alvi symbionts de Apis mellifera (Honeybee)22, e nos symbionts vibrio fischerii de euprymna scolopes (lula de bobtail havaiano)23 usando a abordagem mutagense transposon-inserção.
Como uma abordagem alternativa, a mutagênese transposon pode ser seguida pela triagem de mutantes individuais usando mídia seletiva em vez de sequenciamento. A triagem fenotípica ou os bioensatórios para identificar deficiências, como motilidade, produção de metabólitos secundários bioativos ou auxotropicais específicos, são viáveis. Por exemplo, a triagem de um inseto burkholderia (redesignado para o gênero Caballeronia35) a biblioteca mutante transposon tem sido fundamental para identificar que os simmbiontos empregam genes de motilidade para colonizar pedestris Riptortus, seu hospedeiro de insetos36. Além disso, utilizando mutagênese transposon e triagem fenotípica, o aglomerado genético biossintético para a cariomicenária bioativa secundária metabolite foi identificado em Burkholderia caryophylli37. Um mutante auxotrófico de Burkholderia pseudomallei foi identificado após mutagênese transposon e triagem e é um possível candidato à vacina atenuada contra a melioidose, uma doença perigosa em humanos e animais38. Assim, a mutagênese e sequenciamento transposon é uma abordagem valiosa no estudo dos traços moleculares das bactérias que são importantes para as interações com seus respectivos hospedeiros em associações patogênicas ou mutualistas.

Burkholderia gladioli pode se envolver em uma associação simbiótica com besouros Lagria villosa, desempenhando um papel importante na defesa contra antagonistas microbianos do hospedeiro4,5,6. Besouros fêmeas abrigam várias cepas de B. gladioli em glândulas especializadas acessório ao sistema reprodutivo. Após a colocação de ovos, as fêmeas mancham células B. gladioli na superfície dos óvulos onde compostos antimicrobianos produzidos por B. gladioli inibem infecções por fungos entomopatômicos4,6. Durante o desenvolvimento embrionário tardio ou cedo após a escotilha das larvas, as bactérias colonizam invaginações cuticulares na superfície dorsal das larvas. Apesar dessa localização especializada e da rota de transmissão vertical dos symbionts, l. villosa pode presumivelmente também adquirir B. gladioli horizontalmente a partir do ambiente4. Além disso, pelo menos três cepas de B. gladioli foram encontradas em associação com L. villosa4,6. Entre eles, b. gladioli Lv-StA é o único que é favorável ao cultivo in vitro.
B. gladioli Lv-StA tem um tamanho genoma de 8,56 Mb6 e contém 7.468 genes. Qual desses genes são importantes para as bactérias B. gladioli colonizar o hospedeiro do besouro? Para responder a essa pergunta, utilizou-se o sequenciamento transposon-inserção (Tn-seq), método exploratório para identificar genes microbianos condicionalmente essenciais1,2,3. Uma biblioteca mutante de B. gladioli Lv-StA foi criada usando um transposon Tn5. Através da conjugação das células doadoras de Escherichia coli para B. gladioli Lv-StA, foi transferido um plasmid pRL27 que carrega o transposon Tn5 e um de resistência a antibióticos ladeado por repetições invertidas (Figura 1). Assim, foi gerado um conjunto de mutantes que carregam individualmente interrupções de 3.736 genes simbiontes(Figura 2).
A piscina mutante foi infectada em ovos de besouro para identificar os fatores de colonização e, como controle, também foi cultivada in vitro no meio B do Rei (KB). Após permitir tempo suficiente para colonização, larvas eclodidas foram coletadas e agrupadas para extração de DNA. Fragmentos de DNA contendo a inserção transposon e a região genômica flanqueada de B. gladioli Lv-StA foram selecionados usando um protocolo de preparação de biblioteca de DNA modificado para sequenciamento. A leitura do processamento de qualidade seguida de análise com o DESeq2 foi realizada para identificar genes específicos cruciais para b. gladioli Lv-StA colonizar larvas L. villosa quando transmitidas através da superfície do ovo.

<table><tbody><tr><td>2,6- Ácido Diaminopimélico</td><td>Alfa Aesar</td><td>B22391</td><td>Para E.coli WM3064+ pRL27</td></tr><tr><td>Ágar - Ágar</td><td>Roth</td><td>5210</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Biozym</td><td>840004</td><td></td></tr><tr><td>AMPure grânulos XP (grânulos magentic + polietilenoglicol + sais)</td><td>Beckman Coulter</td><td>A63880</td><td>Seleção de tamanho na etapa 6.6</td></tr><tr><td>Alvejante (NaOCl) 12%</td><td>Roth</td><td>9062</td><td></td></tr><tr><td>Bowtie2 v.2.4.2</td><td></td><td></td><td>Ferramenta bioinfromática para mapeamento de leitura. Referência 10 no manuscrito principal.</td></tr><tr><td>Buffer-S</td><td>Peqlab</td><td>PEQL01-1020</td><td>Para PCRs</td></tr><tr><td>Raspador de células</td><td>Sarstedt</td><td>83.1830</td><td></td></tr><tr><td>Cutadapt v.2.10</td><td></td><td></td><td>Ferramenta de bioinformática para remover sequências adaptadoras específicas das leituras. Referência 8 no manuscrito principal.</td></tr><tr><td>Pacote DESeq2</td><td></td><td></td><td>RStudio para avaliar a abundância diferencial de mutantes. Geralmente usado para análise de RNAseq. Referência 12 no manuscrito principal.</td></tr><tr><td>Escada de DNA 100 bp</td><td>Roth</td><td>T834.1</td><td></td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Life Technology</td><td>R0182</td><td>PCR para confirmar o sucesso da conjugação</td></tr><tr><td>EDTA, sal dissódico</td><td>Roth</td><td>8043</td><td></td></tr><tr><td>Epicentre MasterPure Kit completo de purificação de DNA e RNA</td><td>Lucigen</td><td>MC85200</td><td></td></tr><tr><td>brometo de etídio</td><td>Roth</td><td>2218.1</td><td></td></tr><tr><td>FastQC v.0.11.8</td><td></td><td></td><td>Ferramenta de bioinformática para avaliação da qualidade dos dados de sequenciamento. Referência 7 no manuscrito principal.</td></tr><tr><td>FeatureCounts v.2.0.1</td><td></td><td></td><td>Ferramenta de bioinformática para obter contagens de leitura por recurso genômico. Referência 11 no manuscrito principal.</td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Roth</td><td>7530</td><td></td></tr><tr><td>K2HPO4</td><td>Roth</td><td>P749</td><td></td></tr><tr><td>Sulfato de canamicina</td><td>Serva</td><td>26899</td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Merck</td><td>4936</td><td></td></tr><tr><td>KH2PO4</td><td>Roth</td><td>3904</td><td></td></tr><tr><td>MgSO4.7H2O</td><td>Roth</td><td>PO27</td><td></td></tr><tr><td>Na2HPO4</td><td>Roth</td><td>P030</td><td></td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Merck</td><td>6404</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (conjunto de primers Index 1)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7335S</td><td></td></tr><tr><td>NEBNext Ultra II kit de preparação de biblioteca de DNA para Illumina</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td></td></tr><tr><td>Peptona (soja)</td><td>Roth</td><td>2365</td><td>Para Burkholderia gladioli Lv-StA KB-medium</td></tr><tr><td>peqGOLD 'Hot' Taq- DNA Polimerase</td><td>VWR</td><td>PEQL01-1020</td><td>PCR para confirmar o sucesso da conjugação Placas de</td></tr><tr><td>Petri - 145 x 20 mm</td><td>Roth</td><td>XH90.1</td><td>Para selecionar placas de Petri transconjugantes</td></tr><tr><td>- 90 x 16 mm</td><td>Roth</td><td>N221.2</td><td></td></tr><tr><td>Qiaxcel (StarSEQ GmbH, Alemanha)</td><td></td><td></td><td>Verificação de qualidade após a preparação da biblioteca</td></tr><tr><td>de DNA Grânulos de estreptavidina</td><td>Roth</td><td>HP57.1</td><td></td></tr><tr><td>Taq DNA polimerase</td><td>VWR</td><td>01-1020</td><td></td></tr><tr><td>Trimmomatic v.0.36</td><td></td><td></td><td>Ferramenta de bioinformática para aparar leituras de baixa qualidade e também sequências de adaptadores. Referência 9 no manuscrito principal.</td></tr><tr><td>Tris -HCl</td><td>Roth</td><td>9090.1</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Roth</td><td>2366</td><td>Para Escherichia coli WM3064+pRL27 LB médio</td></tr><tr><td>Ultrasonicator</td><td>Bandelin</td><td>GM 70 HD</td><td>Para cisalhamento</td></tr><tr><td>Enzima USUÁRIO (uracila DNA glicosilase + DNA glicosilase-liase Endonuclease VIII)</td><td>New England Biolabs</td><td>E7645S</td><td>Etapa de ligação 6.5.2</td></tr><tr><td>Extrato</td> <td>de leveduraRoth</td><td>2363</td><td></td></tr></tbody></table>

sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um birkholderia gladioli simbionte de besouros lagria villosa

Transposon-insertion Sequencing as a Tool to Elucidate Bacterial Colonization Factors in a Burkholderia gladioli Symbiont of Lagria villosa Beetles

Inferir a função dos genes manipulando sua atividade é uma ferramenta essencial para entender os fundamentos genéticos da maioria dos processos biológicos. Os avanços na microbiologia molecular têm visto o surgimento de diversas técnicas de mutagênese para a manipulação de genes. Entre eles, o sequenciamento transposon-inserção (Tn-seq) é uma ferramenta valiosa para avaliar simultaneamente a funcionalidade de muitos genes candidatos de forma não alvo. A técnica tem sido fundamental para identificar mecanismos moleculares para a colonização de hospedeiros eucarióticos em vários micróbios patogênicos e alguns simbiontes benéficos.
Aqui, Tn-seq é estabelecido como um método para identificar fatores de colonização em um simbionte mutualista birmanês gladioli do besouro Lagria villosa. Por conjugação, a inserção mediada por Tn5 de um de resistência a antibióticos é realizada em locais genômicos aleatórios em B. gladioli. Para identificar o efeito das interrupções genéticas na capacidade das bactérias de colonizar o hospedeiro do besouro, a biblioteca gerada B. gladioli transposon-mutante é inoculada nos ovos de besouro, enquanto um controle é cultivado in vitro em um meio de cultura líquida. Depois de permitir tempo suficiente para colonização, o DNA é extraído das bibliotecas in vivo e in vitro cultivadas. Seguindo um protocolo de preparação da biblioteca de DNA, as amostras de DNA são preparadas para sequenciamento transposon-inserção. Fragmentos de DNA que contêm a borda de inserção transposon e o DNA bacteriano de flanqueamento são selecionados, e os locais de mutação são determinados por sequenciamento longe da borda de inserção transposon. Finalmente, analisando e comparando as frequências de cada mutante entre as bibliotecas in vivo e in vitro, pode-se prever a importância de genes simbiontes específicos durante a colonização do besouro.

As bactérias associadas ao hospedeiro podem empregar vários fatores para estabelecer uma associação, incluindo aquelas que mediam a adesão, motilidade, quimiotaxis, respostas ao estresse ou transportadores específicos. Embora fatores importantes para as interações patógenos-hospedeiros tenham sido relatados para várias bactérias13,14,15,16,17,18, incluindo membros do gênero Burkholderia19,20, menos estudos exploraram os mecanismos moleculares usados por simbiontos benéficos para colonização21,22,23 . Utilizando o sequenciamento da inserção transposon, o objetivo foi identificar fatores moleculares que permitem que B. gladioli colonize besouros L. villosa.
A mutagênese mediada pela Transposon foi realizada usando o plasmídeo pRL27, que carrega um transposon Tn5 e um de resistência à kanamicina ladeado por locais repetidos. O plasmídeo foi introduzido nas células B. gladioli Lv-StA por conjugação com o doador plasmídeo E. coli WM3064 (como mostrado na Figura 1). Após a conjugação, a mistura de conjugação contendo b. gladioli receptor e células doadoras E. coli foram banhadas em placas de ágar seletiva contendo kanamicina. A ausência de DAP nas placas eliminou as células E. coli doador, e a presença de kanamicina selecionada para os transconjugantes B. gladioli Lv-StA bem sucedidos. A biblioteca mutante B. gladioli Lv-StA obtida na colheita das 100.000 colônias transconjugantes foi preparada para sequenciamento usando um kit de preparação de biblioteca de DNA modificado e primers personalizados. A Figura 2 destaca as etapas de preparação da biblioteca de DNA. Sequenciamento rendeu 4 leituras emparelhadas mio; 3.736 genes de 7.468 genes em B. gladioli Lv-StA foram interrompidos.
Para identificar mutantes defeituosos na colonização, a biblioteca mutante B. gladioli Lv-StA foi infectada nos ovos de besouro e cultivada in vitro no meio KB como controle. O tamanho do gargalo de colonização in vivo foi calculado antes do experimento. Um número conhecido de células B. gladioli Lv-StA foi infectado em ovos de besouro, e o número de células colonizadoras em larvas recém-eclodidas foi obtido por chapeamento de uma suspensão de cada larva e contando unidades formadoras de colônias por indivíduo. Esses cálculos foram feitos para garantir que o número de células colonizadoras seja suficiente para avaliar todos ou uma alta porcentagem dos mutantes na biblioteca por sua capacidade de colonizar o hospedeiro. Além disso, o tempo de crescimento entre condições in vitro e in vivo foi normalizado com base no número de gerações bacterianas para tornar essas amostras comparáveis.
Após a eclosão dos ovos, 1.296 larvas foram coletadas em 13 piscinas. As culturas mutantes in vitro correspondentes foram cultivadas e armazenadas como estoques de glicerol. O DNA das bibliotecas mutantes in vivo e in vitro cultivadas foi extraído e fragmentado em um ultrassônico. A Figura 3 mostra a distribuição de tamanho do DNA desarquiado, onde a maioria dos fragmentos se estende entre 100 e 400 bp, como esperado. Esta etapa foi seguida pelo protocolo modificado de preparação da biblioteca de DNA para sequenciamento. Em cada etapa do protocolo, a concentração do DNA restante foi verificada para garantir que as etapas fossem executadas corretamente e para rastrear perdas de DNA. Uma verificação de qualidade (veja a Tabela de Materiais) antes do sequenciamento revelou que as bibliotecas de DNA continham fragmentos de DNA inesperadamente grandes (&gt;800 bp), e isso foi mais pronunciado nas bibliotecas in vivo. Dada a dificuldade em otimizar o agrupamento de fragmentos nas pistas de sequenciamento, foi necessário aumentar a profundidade de sequenciamento para 10 leituras emparelhadas de Mio nas bibliotecas in vivo para atingir o número desejado de leituras. A análise dos resultados do sequenciamento revelou que uma média de 4 Mio lê nas bibliotecas in vivo e 3,1 Mio lê nas bibliotecas in vitro continha a borda Transposon no final de 5' da Tabela9, o que foi satisfatório para este experimento. A distribuição das 24.224 inserções únicas em todo o genoma B. gladioli na biblioteca original é mostrada na Figura 4. Uma análise realizada por meio do DESeq2 revelou que as abundâncias de 271 mutantes eram significativamente diferentes entre as condições in vivo e in vitro. 
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig03.jpg"> Figura 3: Géis agarose de uma biblioteca de mutante e DNA. (A) Gel de agarose com DNA descomproxido de um mutante na pista x e uma escada de 1 kbp para escala. (B) Gel com biblioteca de DNA desarquiada. Os tamanhos da banda da escada na primeira pista são indicados no lado esquerdo. As três primeiras pistas a, b e c contêm fragmentos de DNA desarmados das bibliotecas in vivo. As pistas d, e, f e g contêm fragmentos de DNA das bibliotecas in vitro. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig03large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/62843/62843fig04.jpg"> Figura 4: Localização de locais de inserção únicos na biblioteca original através dos quatro replicons no genoma Burkholderia gladioli Lv-StA. Cada barra ao longo do eixo x está localizada em um local de inserção. A altura de uma barra ao longo do eixo y corresponde ao número de leituras associadas a esse local. Observe que os dois cromossomos e dois plasmídeos são mostrados em comprimento total e, portanto, têm escalas diferentes no eixo x. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/62843/62843fig04large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">M de B do rei/ ágar</td>
		</tr>
<tr>
<td>Peptone (soja)</td>
			<td>20 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>K2HPO4
</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgSO4.7H2O</td>
			<td>1,5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Ágar</td>
			<td>15 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Dissolvido em água destilada</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Meio/ágar LB</td>
		</tr>
<tr>
<td>Triptona</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extrato de levedura</td>
			<td>5 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td>NaCl</td>
			<td>10 g/L</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Dissolvido em água destilada</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Componentes de mídia.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Não.</td>
			<td>Primers</td>
			<td colspan="2">Seqüenciar</td>
			<td>PcR annealing temp. (°C)</td>
		</tr>
<tr>
<td>1</td>
			<td>tpnRL17-1RC</td>
			<td colspan="2">5'-CGTTACATCTGGCTTGTT-3'</td>
			<td rowspan="2">58.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>2</td>
			<td>tpnRL13-2RC</td>
			<td colspan="2">5'-TCGTGAAGAAGGTGTTGCTG-3'</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Primers para confirmar o sucesso da conjugação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Componente</td>
			<td>Volume (μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Água purificada pelo HPLC</td>
			<td>4.92</td>
		</tr>
<tr>
<td>10x Buffer S (alta especificidade)</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>MgCl2 (25 mM)</td>
			<td>0.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>dNTPs (2 mM)</td>
			<td>1.2</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 1 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer 2 (10 pmol/μL)</td>
			<td>0.8</td>
		</tr>
<tr>
<td>Taq (5 U/μL)</td>
			<td>0.08</td>
		</tr>
<tr>
<td>Mastermix total</td>
			<td>9</td>
		</tr>
<tr>
<td>Modelo</td>
			<td>1</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 3: Mistura mestre pcr para confirmar o sucesso da conjugação. Abreviaturas: HPLC = cromatografia líquida de alto desempenho; dNTPs = triphosfato desoxiconucleosídeo.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passos</td>
			<td>Temperatura °C</td>
			<td>Hora</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturação Inicial</td>
			<td>95</td>
			<td>3 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturação</td>
			<td>95</td>
			<td>40 s</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Recozimento</td>
			<td>58.2</td>
			<td>40 s</td>
			<td>30 a 35</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensão</td>
			<td>72</td>
			<td>1-2 min</td>
			<td></td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensão Final</td>
			<td>72</td>
			<td>4 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Segurar</td>
			<td>4</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 4: Condições de PCR para confirmar o sucesso da conjugação.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Primers</td>
			<td colspan="2">Seqüenciar</td>
			<td>Tm °C</td>
			<td>Usar</td>
			<td>Fonte</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer biotinilado específico para transposon</td>
			<td colspan="2">5'-Biotin-ACAGGAACACTTAACGGCTGACATG -3'</td>
			<td>63.5</td>
			<td>6.7.1. PCR I</td>
			<td>Costume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer Universal PCR modificado</td>
			<td colspan="2">5'- AATGATACGGCGACCACCGAGATC TACACTCTCTCTACACGACGCTC TTCCGATCTGAATTCATCGATGAT GGTTGAGATGTGT – 3'</td>
			<td>62</td>
			<td>6.10.1. PCR II</td>
			<td>Costume</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer de índice</td>
			<td colspan="3">Consulte o manual do fabricante</td>
			<td>6.7.1. PCR I &amp; 6.10.1. PCR II</td>
			<td>NEBNext Multiplex Oligos para Illumina (Primers de índice definidos 1)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Adaptador</td>
			<td colspan="3">Consulte o manual do fabricante</td>
			<td>6.5. Ligadura do adaptador</td>
			<td>Kit de preparação da biblioteca de DNA NEBNext Ultra II para Illumina</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 5: Primers e adaptador para PCR I e II durante a preparação da biblioteca de DNA. 
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mistura PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>Fragmentos de DNA ligados por adaptador</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer de índice (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer biotinilado específico transposon (10 pmol/ μL)</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 6: Preparação da biblioteca de DNA-PCR I master mix.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Passos</td>
			<td>Temperatura</td>
			<td>Hora</td>
			<td>Ciclos</td>
		</tr>
<tr>
<td>Denaturação Inicial</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>30 s</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Desnaturação</td>
			<td>98 °C</td>
			<td>10 s</td>
			<td rowspan="3">6 a 12</td>
		</tr>
<tr>
<td>Recozimento</td>
			<td>65 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensão</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>30 s</td>
		</tr>
<tr>
<td>Extensão Final</td>
			<td>72 °C</td>
			<td>2 min.</td>
			<td>1</td>
		</tr>
<tr>
<td>Segurar</td>
			<td>16 °C</td>
			<td colspan="2">∞</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 7: Preparação da biblioteca de DNA-Condições PCR I e II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td>Mistura PCR</td>
			<td>(μL)</td>
		</tr>
<tr>
<td>DNA selecionado por contas</td>
			<td>15</td>
		</tr>
<tr>
<td>NEBNext Ultra II Q5 master mix</td>
			<td>25</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer de índice</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Primer universal pcr modificado</td>
			<td>5</td>
		</tr>
<tr>
<td>Volume total</td>
			<td>50</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 8: Preparação da biblioteca de DNA-MIX MESTRE PCR II.
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always"><tbody>
<tr>
<td colspan="2">Bibliotecas</td>
			<td>Invivo-1</td>
			<td>Invivo-2</td>
			<td>Invivo-3</td>
			<td>Invitro-1</td>
			<td>Invitro-2</td>
			<td>Invitro-3</td>
			<td>Biblioteca original</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Não. de leituras (PE)</td>
			<td>56,57,710</td>
			<td>39,19,051</td>
			<td>30,65,849</td>
			<td>35,73,494</td>
			<td>28,83,440</td>
			<td>36,61,956</td>
			<td>46,09,410</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Não. de leituras contendo Tn – borda no final de 5' de Read-1</td>
			<td>54,15,880</td>
			<td>37,31,169</td>
			<td>29,36,247</td>
			<td>33,00,499</td>
			<td>27,35,705</td>
			<td>33,50,402</td>
			<td>41,53,270</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Taxa de alinhamento global bowtie2 (%) (somente leitura-1)</td>
			<td>95.53%</td>
			<td>83.71%</td>
			<td>89.87%</td>
			<td>80.79%</td>
			<td>78.00%</td>
			<td>73.06%</td>
			<td>74.92%</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Número de inserções únicas</td>
			<td>8,539</td>
			<td>4,134</td>
			<td>7,183</td>
			<td>18,930</td>
			<td>18,421</td>
			<td>20,438</td>
			<td>24,224</td>
		</tr>
<tr>
<td colspan="2">Número de genes atingidos</td>
			<td>1575</td>
			<td>993</td>
			<td>1450</td>
			<td>2793</td>
			<td>2597</td>
			<td>3037</td>
			<td>3736</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 9: Resumo da saída de sequenciamento e frequência de inserção transposon por biblioteca. Abreviação: PE = ponta emparelhada.

Este é um método adaptado para identificar fatores de colonização de insetos candidatos em um simbionte benéfico da Burkholderia. O hospedeiro de besouro é infectado por uma biblioteca mutante aleatória gerada via mutagênese transposon, e a complexidade da biblioteca após a colonização é comparada a um controle cultivado in vitro.

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa

Inferring the function of genes by manipulating their activity is an essential tool for understanding the genetic underpinnings of most biological ...

Este protocolo é útil para realizar manipulação genética em bactérias simbióticas, neste caso, especificamente na Burkholderia, e identificar os genes essenciais para colonizar um hospedeiro de insetos. O sequenciamento da inserção transposon é uma ferramenta poderosa para identificar um grande número de genes condicionalmente essenciais simultaneamente em um único experimento. Comece inoculando uma nova cultura de doadores de doadores de E.coli em 10 mililitros de meio LB suplementados com Kanamycin e DAP sob um capô estéril.Inoculada Burkholderia gladioli strain A células receptoras em cinco mililitros de meio KB. Incubar as culturas a 30 graus Celsius durante a noite em um shaker a 250 RPM. Após o crescimento da noite para o dia, centrífugas quatro mililitros de cada uma das culturas a 9.600 vezes G por seis minutos para pelotar as células e descartar o sobrenante.Sob um capô estéril, lave as culturas celulares pelleted em meio KB contendo DAP. E, finalmente, resuspense as culturas separadamente em quatro mililitros de KB mais meio DAP. Em um tubo fresco de 15 mililitros, misture 250 microliters das células doadoras E.coli lavadas com um mililitro da cepa de gladioli burkholderia lavada A células receptoras.Local 10 microliters desta mistura de célula de conjugação em placas de ágar KB contendo DAP. Deixe a placa descansar sem ser perturbada no capô estéril à temperatura ambiente por uma hora. Incubar as placas com os pontos de conjugação a 30 graus Celsius durante 12 a 18 horas.Após a incubação, adicione dois a quatro mililitros de 1X PBS nas placas sob um capô estéril e use um raspador de células para liberar os pontos de conjugação bacteriana cultivados do ágar. Em seguida, pipeta a célula conjugada mistura em dois tubos de microfuça mililitro. Pellet as células por centrifugação a 9.600 vezes G por dois minutos.Descarte o supernatante e lave a pelota duas vezes em um mililitro de 1X PBS, pipetando para cima e para baixo. Resuspense a última pelota em 1.200 microliters de 1X PBS. Misture bem e espalhe 100 microliters da mistura celular em grandes placas de ágar KB suplementadas com Kanamycin e incubar a 30 graus Celsius durante a noite.Conte o número total de colônias transconjugut nas três placas e extrapolule para calcular o número aproximado de mutantes obtidos em todas as placas. Para aumentar as chances de obter uma biblioteca representativa, certifique-se de que o número total de colônias seja várias vezes maior do que o número total de genes no genoma. Para confirmar o sucesso da conjugação, realize um PCR visando o de inserção usando 10 a 20 colônias de amostras como descrito no manuscrito.Sob um capô estéril, raspe as colônias das placas adicionando um a dois mililitros de 1X PBS no ágar. Misture a mistura celular raspada das placas em tubos de 50 mililitros. Vórtice a biblioteca para misturar completamente, e, em seguida, dividir um mililitro da biblioteca mutante agrupada em vários tubos criogênicos.Adicione um mililitro de 70% de glicerol aos tubos e armazene a menos 80 graus Celsius. Selecione uma embreagem de ovo L.villosa e conte o número de ovos continuando se a embreagem contiver mais de 100 ovos. Para esterilizar toda a embreagem do ovo, adicione 200 microlitadores de 70% de etanol e lave suavemente os ovos por cinco minutos, depois retire o etanol e lave os ovos duas vezes com água autoclavada.Adicione 200 microliters de 12% de alvejante e lave delicadamente os ovos por 30 segundos. Remova o alvejante imediatamente e lave os ovos novamente três vezes com 200 microliters de água autoclavada. Infecte os ovos na embreagem de ovos esterilizados usando duas vezes 10 para as seis células por microliter da biblioteca mutante lavada na PBS.Dois dias após a escotilha de larvas de besouro infectado, colete 100 larvas instar por tubo de microfuge de 1,5 mililitro e armazene a menos 80 graus Celsius. Para gerar a biblioteca de controle in vitro, inocular 250 microliters de duas vezes 10 para as seis células por microliter da biblioteca mutante em 10 mililitros de KB médio contendo Kanamicina. Depois de extrair DNA das bibliotecas mutantes in vivo e in vitro, compartilhe o DNA com um ultrassonador.Para verificar se o DNA foi cortado para a faixa de tamanho desejada, carregue cinco microliters do DNA descomproxido e cortado depois de misturar com corante de carregamento de gel em uma proporção de um para um em um gel de 1,6% agarose executado a 250 volts por 40 minutos. Para preparar as extremidades do fragmento necessárias para a ligadura do adaptador, comece adicionando três microliters da mistura de enzimas e sete microliters de tampão de reação a 50 microliters do DNA cortado e misture bem por pipetação. Coloque um termociclador com uma tampa aquecida maior ou igual a 75 graus Celsius e incubar as amostras por 30 minutos a 20 graus Celsius e 30 minutos a 65 graus Celsius, depois mantenha a temperatura em quatro graus Celsius.Para ligadura adaptador, adicione 30 microliters de mistura master de ligadura, um microliter de ligadura e 2,5 microlitres de adaptador diluído aos produtos da etapa final de preparação. Misture bem por pipetar e incubar a amostra por 15 minutos a 20 graus Celsius no termociclador com a tampa aquecida desligada. Após 15 minutos, adicione três microliters da enzima.Misture bem por pipetar e incubar a amostra por 15 minutos a 37 graus Celsius em um termociclador com a tampa aquecida a mais ou igual a 47 graus Celsius. Para selecionar o tamanho do adaptador ligado DNA visando fragmentos de 250 pares de base, comece por vórtice da solução de contas magnéticas e coloque-a em temperatura ambiente por 30 minutos antes do uso. Adicione 0,3 vezes de contas a 96,5 microliters da mistura de DNA ligada e misture completamente por pipeta.Incubar a mistura de contas por cinco minutos. Coloque os tubos em um suporte magnético para puxar as contas e remover fragmentos de DNA de tamanho indesejado. Deixe as contas se contentarem por cinco minutos e depois transfira o supernatante claro para um novo tubo de microfuça.Adicione 0,15 vezes de contas frescas ao supernatante e misture bem a pipetar bem. Incubar a mistura de contas por cinco minutos e, em seguida, colocar os tubos em um suporte magnético para puxar para baixo as contas ligadas ao DNA alvo. Espere por cinco minutos e depois descarte o supernatante, mantendo as contas.Com as contas no suporte magnético, adicione 200 microliters de 80% de etanol recém-preparado e espere 30 segundos antes de descartar o etanol sem perturbar as contas. Retire os tubos do suporte e adicione 17 microliters de 0,1X TE ou Low TE, depois misture por pipetar 10 vezes e incubar a mistura em temperatura ambiente por dois minutos. Coloque o tubo no suporte magnético e pegue 15 microliters do DNA selecionado para PCR-1.Vórtice streptavidin contas e colocá-los em temperatura ambiente por pelo menos 30 minutos. Pegue 32 microliters das contas e lave-as com 500 microliters de 1X bind and wash buffer. Adicione 32 microliters de 2X ligue e lave o buffer e resuspende as contas.Para isso, adicione 32 microliters dos produtos PCR-1 limpos. Misture bem e incubar à temperatura ambiente por 30 minutos. Coloque a mistura de DNA de contas em um suporte magnético por dois minutos.Pipeta fora do supernante como DNA marcado por biotina contendo a borda de inserção liga-se ao streptavidin nas contas. Lave as contas com 500 microliters de 1X ligue e lave o tampão e depois lave as contas com 200 microliters de Low TE. Resuspend as contas ligadas ao DNA em 17 microliters de Low TE. O DNA das bibliotecas mutantes in vivo e in vitro cultivadas extraídas e fragmentadas em um ultrassonônico mostrou que a maioria dos fragmentos abrange entre 100 e 400 pares de bases. A localização de inserções mediadas por transposon através dos quatro replicons da cepa de gladioli burkholderia A pode ser observada na cápsula.Um resumo da saída de sequenciamento e o número de inserções e genes únicos atingidos nas três bibliotecas involum e in vitro podem ser observados na tabela. O importante a lembrar é calcular o tamanho do gargalo populacional durante a colonização do hospedeiro para obter uma representação adequada da biblioteca durante a infecção. Além disso, ajuste para um número compatível de gerações bacterianas in vitro e no hospedeiro.Depois de gerar a biblioteca mutante transposon, ela pode ser exibida em mídia seletiva para recuperar mutantes com base em diferenças fenotípicas. Genes específicos importantes para uma condição podem, assim, ser identificados.

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Research

JoVE Journal

Biology

Biologia

Fonte: Kazi, M. I., et. al., Gerando bibliotecas de inserção de transposons em bactérias Gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento. J. Vis. (2020)Este vídeo demonstra a seleção, quantificação e preservação de bactérias receptoras Gram-negativas portadoras de inserções de transposons com base na resistência à canamicina.

Isolamento de bactérias Gram-negativas com inserções de transposons genômicos

Enterobacter sp. YSU cresce em meio de sais mínimos de glucose. Auxotrofos são geradas através da transformação com um transposome qual se insere aleatoriamente no genoma do hospedeiro. Os mutantes são encontrados pela réplica de placas a partir de meio complexo para meio mínimo. Genes interrompidos são identificados por socorro e seqüenciamento genético.

Geração de Enterobacter Sp. YSU auxotrofos Usando Transposon Mutagênese

Coxiella burnetii é uma bactéria intracelular obrigatório Gram-negativa responsável pela febre Q doença zoonótica. Aqui, descrevemos métodos para a geração de mutantes por transposões Coxiella fluorescente, bem como a identificação e análise automatizada dos internalização, replicação e citotóxicos fenótipos resultantes.

Geração e Multi-fenotípica rastreio de alto teor de<em&gt; Coxiella burnetii</em&gt; mutantes por transposões

Aqui, o poder de uma inserção aleatória de um elemento de DNA não-codificante, mediada por transposon foi usado para resolver a sua posição ideal cromossômica.

Determinação da localização cromossômica ideal para um elemento de DNA em Escherichia coli usando uma nova abordagem mediada por Transposon

Apresentado aqui é um método simples para criar uma biblioteca de inserção alta densidade transposon em Escherichia coli ou Shigella flexneri usando conjugação bacteriana. Este protocolo permite a criação de uma coleção de centenas de milhares de mutantes exclusivos nas bactérias através da inserção de genômica aleatória de um transposon.

Criação de um denso Transposon inserção biblioteca usando bacteriana conjugação em entérobactérienne cepas tais como Escherichia Coli ou Shigella flexneri

Aqui descrevemos uma técnica que combina o mutagenesis transposon com sequenciamento de alto rendimento para identificar e quantificar os mutantes leptospiral de transposon em tecidos após um desafio de hamsters. Este protocolo pode ser usado para mutantes de tela para a sobrevivência e disseminação em animais e também pode ser aplicado aos estudos em vitro .

Elevado-throughput sequenciamento paralela à medida Fitness de Leptospira interrogans Transposon inserção mutantes durante a Golden sírio Hamster infecção

O hemizygosity recíproco através de arranjar em seqüência (RH-Seq) é um método novo poderoso para mapear a base genética de uma diferença do traço entre a espécie. As associações de hemizygotes são geradas pela mutagenese do transposon e sua aptidão é controlada com o crescimento competitivo usando o sequenciamento elevado-ao longo. A análise dos dados resultantes identifica genes subjacentes à característica.

Mapeamento genético de diferenças de termotolerância entre espécies de levedura Saccharomyces via análise de Hemizygosidade recíproca em todo o genoma

Descrevemos um método para gerar bibliotecas mutantes transposon saturadas em bactérias Gram-negativas e preparação subsequente de bibliotecas de amplicon de DNA para sequenciamento de alto rendimento. Como exemplo, focamos no patógeno ESKAPE, Acinetobacter baumannii,mas este protocolo é agradável para uma ampla gama de organismos Gram-negativos.

Gerando Bibliotecas de Inserção Transposon em bactérias gram-negativas para sequenciamento de alto rendimento

Micróbios intestinais, incluindo bactérias extracelulares e patógenos intracelulares como o vírus Orsay e microsporídios (fungos), são frequentemente associados a nematoides selvagens de Caenorhabditis . Este artigo apresenta um protocolo para detecção e quantificação de micróbios que colonizam e/ou infectam nematoides de C. elegans e para medir a carga de patógenos após infecções controladas em laboratório.

Hibridização in situ por fluorescência de RNA (FISH) para visualizar colonização microbiana e infecção em intestinos de Caenorhabditis elegans

O teste rotorod é usado para avaliar o estado do motor no movimento de caminhar de ratos hemi-Parkinson analógica.

Uso de Rotorod como um método de análise qualitativa de Walking in Rat

Aprenda a usar sequenciamento de inserção de transposon para identificar genes essenciais na colonização de insetos por Burkholderia gladioli. Este método revela fatores genéticos cruciais para simbioses bacterianas.

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa (Vídeo) | JoVE Journal

Sequenciamento transposon-inserção como uma ferramenta para elucidar fatores de colonização bacteriana em um Birkholderia gladioli Simbionte de Besouros Lagria villosa

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