A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

O objetivo geral deste procedimento é obter imagens de espinhas dendríticas de neurônios perais derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos e quantificá-las em três dimensões. Isso é feito primeiro tratando lamínulas em placas de seis poços com poliuretano e laminina para cultura de células-tronco neurais. Em seguida, células-tronco neurais diluídas em cultura.

Os meios são plaqueados, usando um movimento de pipeta rotativo suave e podem diferenciar até 70 dias em cultura. Ao renovar o meio regularmente, as células são transduzidas com lentivírus GFP coradas com anticorpos anti-GFP e visualizadas. Finalmente, as culturas são fixadas e as espinhas dendríticas são fotografadas usando microscopia confocal.

Em última análise, os dados de imagem das espinhas dendríticas humanas são reconstruídos em 3D para sua classificação e quantificação. Este protocolo fornece um procedimento passo a passo para obter neurônios glutamatérgicos da camada dois a quatro do córtex cerebral humano. Envolve o uso de células-tronco neurais derivadas de células-tronco pré-potentes induzidas por humanos que se originam de fibroblastos humanos com base no método publicado anteriormente.

A principal vantagem desta técnica de nossos métodos existentes é que permitem a segmentação automática de DON direito e PY em 3D. Isso com um ganho apreciável de tempo em relação aos softwares existentes, que normalmente se preparam apenas a partir de análises 2D. O donr e o espião nas classificações também são muito úteis e fáceis de usar.

Para preparar culturas neuronais, coloque lamínulas de vidro em seis placas de cultura de poço e adicione incubação de poliornitina durante a noite sob uma capa de fluxo no dia seguinte. Use DPBS para lavar as lamínulas três vezes e adicione lamina incubar sob uma capa de fluxo por pelo menos 10 horas. Preparar o meio de cultura que contenha os seguintes componentes.

Em seguida, use o meio para plaquear e despachar células-tronco neurais ou NSCS a uma densidade de 50.000 células por centímetro quadrado Pipetagem com movimentos rotativos lentos para reduzir o agrupamento de células para transduzir neurônios derivados de IPSC humano. Em qualquer fase da maturação, adicionar um microlitro de uma solução-mãe contendo 40 nanogramas de vetor lentiviral GFP por alvéolo de cultura contendo meio de cultura fresco e incubar a 37 graus Celsius durante 48 horas. Para preparar as células para a imunofluorescência, remova o meio de cultura e use formaldeído a 4% para fixar as células transduzidas em temperatura ambiente por 10 minutos.

Em seguida, use um XPBS para lavar as células três vezes por 10 minutos cada. Em seguida, mergulhe as lamínulas em PBS suplementado com 0,05% de Triton X 110% de soro de cavalo e incube em temperatura ambiente por uma hora. Em seguida, use PBS para lavar as lamínulas três vezes.

Adicione um anticorpo primário 1000º GFP em 100 microlitros de soro PBS 4% cavalo a cada lamínula. Incube em uma caixa escura a quatro graus Celsius durante a noite. Agora dilua o anticorpo conjugado Alexa Fluor 4 88 um a 200 em PBS 0,5% entre 20 e incube as células com a solução de anticorpos em temperatura ambiente por uma hora após usar PBS para lavar as lâminas três vezes.

Use o meio de montagem para montar as lâminas para microscopia de fluorescência. Sob um microscópio confocal, selecione pelo menos 10 neurônios saudáveis por condição com uma morfologia parametálica e uma arborização dendrítica de dobra para quantificar 60 a 100 micrômetros por dendrito. Adquira imagens com uma objetiva de 40 x na, 1,3 óleo e um laser de 488 nanômetros com uma potência de pico típica no nível da amostra em torno de 20 micro watts, defina o tamanho do pixel em torno de 80 nanômetros para espinhas dendríticas devidamente amostradas.

Para amostrar todo o volume do neurônio, adquira uma pilha Z com espaçamento Z de 150 a 300 nanômetros, produzindo 20 a 30 fatias Z para realizar a quantificação 3D das espinhas dendríticas. Use as configurações a seguir para o software de análise para pré-processamento. Use a filtragem gaussiana escolhendo o filtro gaussiano de suavização de processamento de imagem.

Defina a largura do filtro igual ao tamanho do pixel no plano XY para realizar um rastreamento semiautomático de dendritos a partir do módulo rastreador de filamento. Na guia de fatia, use a ferramenta de distância para estimar o diâmetro do dendrito. Em seguida, na guia superada, clique na ferramenta filamentos e escolha pular criação automática para melhor robustez na guia de desenho.

Agora apresentado, selecione o caminho automático como um método, o dendrito como um tipo e insira o diâmetro estimado do dendrito. Usando o modo de seleção do ponteiro, gire o cursor em uma caixa e escolha shift e clique com o botão direito do mouse no ponto inicial do dendrito. O software realizará os cálculos iniciais.

Agora mova o ponteiro ao longo do dendrito a partir do ponto inicial. Uma linha amarela representando o caminho dendrito mais provável é mostrada. Pressione shift e esquerda.

Clique no endpoint dendrito para realizar a segmentação automatizada da coluna vertebral na interface do módulo. Clique na guia de criação na lista suspensa de reconstrução. Escolha reconstruir o diâmetro do dendrito e marque a caixa manter dados.

Em seguida, clique em reconstruir. Defina o limite para que o volume segmentado corresponda ao volume real do dendrito. Como algoritmo, selecione a distância mais curta do mapa de distância.

Em seguida, clique no próximo botão na guia de fatia, determine a menor coluna, o diâmetro da cabeça e o comprimento máximo. Em seguida, na guia superar, insira os valores dos parâmetros em torno de 200 a 300 nanômetros para diâmetro mínimo e quatro micrômetros para comprimento máximo são bons Pontos de partida sem marcar a caixa permitir lombadas, clique no botão Avançar. Em seguida, ajuste o limite de pontos de semente para que os pontos azuis que representam espinhos localizados nas cabeças reais dos espinhos.

Em seguida, clique em Avançar. O cálculo do núcleo agora será realizado e pode levar algum tempo para classificar as lombadas na guia de ferramentas da interface do módulo, clique em classificar coluna. Depois de verificar que existem quatro classes, conforme descrito no protocolo de texto, a interface do módulo gerará quatro novos objetos de filamento com os resultados da classificação.

Por fim, exporte os dados estatísticos na guia de estatísticas clicando em exportar todas as estatísticas para o arquivo. Esta figura ilustra a cultura de neurônios humanos marcados como um anticorpo anti-beta três tubulina. A tendência para o agrupamento de células também é evidente aqui.

Aqui é mostrado um neurônio parametálico marcado com GFP 40 dias após a diferenciação de um progenitor cortical tardio. Das camadas corticais superficiais. A inserção mostra uma ampliação menor com o corpo celular aparente.

Esses painéis representam a reconstrução 3D de segmentos de espinhas dendríticas em diferentes estágios de maturação. A análise quantitativa da densidade da coluna vertebral e do volume da cabeça da coluna vertebral é mostrada aqui. Como esperado, esses dois parâmetros aumentam ao longo do período de cultivo.

Ao tentar o procedimento de cultura, é importante plaquear e despachar com muito cuidado as células-tronco neurológicas, adicionando células lentamente com um movimento de rotação suave para reduzir a colina celular. De fato, esse método requer a identificação de neurônios individuais.