Protocolo para a Diferenciação de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas Humanas em Culturas Mistas de Neurônios e Glia para Teste de Neurotoxicidade

O objetivo geral deste procedimento é diferenciar células-tronco neurais derivadas de colônias de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos em culturas mistas de células neuronais e gliais. Este modelo é adequado para triagem de toxicidade química e medicamentosa. Este modelo in vitro pode ser aplicado para avaliar perturbações induzidas por produtos químicos de vias de sinalização que são ativadas durante o processo de diferenciação neuronal e glial.

A principal vantagem deste sistema é que utiliza um modelo humano derivado de células-tronco pluripotentes induzidas que representa alternativa às células cancerígenas tradicionalmente utilizadas e culturas primárias animais e permite estudar a neurotoxicidade em populações mistas de células neuronais e gliais. O procedimento será demonstrado por Francesca Pistollato, nossa pós-doutoranda, e Carolina Nunes, aluna de pós-graduação do nosso laboratório. Comece passando pelas colônias hiPSC.

Trabalhando sob um microscópio estereoscópico com ampliação de quatro X em um gabinete de fluxo laminar, use uma seringa de um mililitro com uma agulha de calibre 30. Corte as colônias de células-tronco em quadrados de cerca de 200 mícrons por 200 mícrons. Cortar as colônias requer boas habilidades manuais para obter fragmentos de tamanho igual.

O uso de ferramentas de corte disponíveis comercialmente pode ajudar. Em seguida, use uma pipeta de 200 microlitros para separar os fragmentos da colônia da superfície do prato, pipetando suavemente o meio por baixo para levantar os pedaços. Transfira cerca de 100 fragmentos de colônia para uma placa de 60 milímetros revestida com DMEM F12 de matriz qualificada preenchida com quatro mililitros de meio hiPSC completo.

Em seguida, incube o novo prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. Realize uma mudança total do meio todos os dias e inspecione a morfologia das colônias usando um microscópio de contraste de fase com ampliações de quatro X e 10X. No dia zero do procedimento de diferenciação, atualize o meio hiPSC adicionando três mililitros de meio por placa de Petri de 60 milímetros.

Em seguida, corte e destaque os fragmentos de 200 mícrons como antes. Pipetar os fragmentos destacados e o meio para um tubo de 15 mililitros. Lave o prato com dois mililitros de meio hiPSC completo e recupere todos os fragmentos.

Em seguida, centrifugue a 112 vezes G durante um minuto. Após a centrifugação, aspirar o sobrenadante e ressuspender suavemente os fragmentos em cinco mililitros de meio hiPSC EB completo. Coloque o volume total em uma placa de cultura de tecidos de ultrabaixa fixação de 60 milímetros.

Incube o prato durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, verifique as células com o microscópio invertido. Os corpos embrióides do dia um devem parecer arredondados e distintos uns dos outros, como visto aqui.

Em seguida, pipetar os corpos embrióides e o meio do prato e transferir para um tubo de 15 mililitros. Centrifugar os corpos embrióides a 112 vezes G durante um minuto. No segundo dia, aspire a solução de revestimento de matriz padrão de um prato de 60 milímetros previamente preparado e adicione cinco mililitros de meio de indução neuroepitelial completo, ou NRI, ao prato.

Trabalhando sob o microscópio estereoscópico com ampliação de quatro X e usando uma pipeta de 200 microlitros, colete cerca de 50 corpos embrióides flutuantes e transfira para um prato revestido. Em seguida, incube o prato a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia seguinte, terceiro dia do procedimento de diferenciação, verifique o prato ao microscópio com ampliação de 10X para garantir que os corpos embrióides estejam todos presos.

Em seguida, execute suavemente uma troca total do meio com o meio NRI completo. Troque o meio NRI a cada dois dias até o sétimo dia, quando os agregados neuroepiteliais semelhantes a rosetas devem estar visíveis. No sétimo dia, cubra uma placa de 96 poços pipetando 100 microlitros de matriz padrão diluída em meio de cultura em cada poço.

No oitavo dia, corte os agregados em forma de roseta em fragmentos sob um microscópio estereoscópico com ampliação de 10X em condições estéreis. Observe que as rosetas tendem a se soltar facilmente do prato quando tocadas com a agulha. Nesse caso, desagregue parcialmente a roseta destacada com a ponta da agulha.

Se as rosetas permanecerem parcialmente presas, use uma pipeta de 200 microlitros para completar o descolamento dos fragmentos da roseta. As estacas de roseta requerem boas habilidades manuais e precisão para evitar o corte de derivados neurexidérmicos. Em seguida, recolher os fragmentos de roseta e o seu meio para um tubo cónico de 15 mililitros.

Lave o prato com dois mililitros de meio NRI para recuperar todos os fragmentos. Em seguida, gire os fragmentos de roseta a 112 vezes G por um ou dois minutos. Depois de aspirar o sobrenadante, ressuspenda suavemente o pellet em um mililitro de um X DPBS pré-aquecido sem cálcio e magnésio.

Pipete suavemente os fragmentos de roseta para cima e para baixo para dissociá-los parcialmente. Em seguida, adicione quatro mililitros de meio NRI completo e conte as células usando azul de tripano e um contador de células automatizado. Em seguida, aspire a solução de revestimento de matriz padrão da placa de 96 poços e deposite as células nos poços a uma densidade de cerca de 15.000 células por centímetro quadrado em meio NRI.

Incube a placa durante a noite a 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono. No dia 10, execute uma mudança total do meio usando o meio de diferenciação neuronal completo. Esta imagem representativa mostra rosetas após 12 dias coradas in vitro para nestina em verde e beta três tubulina em vermelho.

Aqui, as células que foram cultivadas por 28 dias in vitro foram coradas para beta três tubulina em vermelho e NF200 em verde. Esta imagem representativa mostra células neuronais diferenciadas de NSCs após 21 dias in vitro coradas para NF200 em vermelho e duas em verde. Aqui, as células gliais da mesma cultura são coradas para GFAP em vermelho.

Este histograma compara a quantificação de nestina, MAP dois, GFAP, ácido gama-aminobutírico, transportador vesicular de glutamato um e células positivas para tirosina hidroxilase em derivados de IMR90 hiPSC e células diferenciadas de NSCs derivados de IMR90 hiPSC. Essas imagens de contraste de fase tiradas usando uma objetiva de 10X mostram células-tronco neuronais passando por diferenciação por 21 dias. Seguindo esses procedimentos, outras leituras, como PCR quantitativo em tempo real e reanálise multilateral, podem ser realizadas para avaliar a fisiologia e o fenótipo das células neuronais e gliais e avaliar o efeito dos produtos químicos.

Não se esqueça de que o trabalho com compostos químicos pode ser extremamente perigoso. É por isso que suas precauções relevantes devem ser sempre tomadas usando óculos de proteção, luvas ou máscara sob o capuz de fluxo, especialmente ao realizar tratamentos químicos. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como obter uma população mista diferenciada de neurônios e células gliais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos, que representa um modelo adequado, modelo in vitro, para desenvolvimento em testes de neurotoxicidade.