Um protocolo pré-analítico de biópsia líquida padronizada para aplicações de DNA sem circulação a jusante

A biópsia líquida revolucionou nossa abordagem para estudos translacionais em oncologia, com coleta de amostras, qualidade e armazenamento sendo passos cruciais para sua aplicação clínica bem sucedida. Aqui descrevemos um protocolo padronizado e validado para aplicações de DNA sem circulação a jusante que podem ser aplicados na maioria dos laboratórios de pesquisa translacional.

Este é um protocolo padrão para o processamento e armazenamento de amostras de sangue para aplicações de biópsia líquida a jusante com base na circulação de DNA livre. Este é o primeiro protocolo padrão publicado, embora a técnica esteja em uso há vários anos. É fácil de seguir com equipamentos padrão disponíveis na maioria dos laboratórios translacionais ou científicos.

O protocolo pode ser realizado por todos os funcionários do laboratório. O protocolo ajuda a padronizar a forma como coletamos e armazenamos amostras, o que, em última análise, impactará na clínica e reduzirá a variabilidade entre diferentes centros realizando a mesma ou similar análise a jusante onde a precisão é de extrema importância. Este método é particularmente útil na pesquisa oncológica e também em aplicações clínicas.

No entanto, também pode ser aplicado em outras doenças não cancerígenas onde a biópsia líquida também é usada. Depois que a amostra de sangue foi centrifuada, saber quanto plasma ou soro remover pode ser difícil, mas seguir essas diretrizes específicas ajudará com isso. O resto do protocolo é muito fácil de seguir com pouca experiência em laboratório.

Demonstrando o procedimento estará Jorge, um técnico do nosso laboratório. Para começar, centrifufique o tubo contendo sangue fresco à temperatura ambiente por 10 minutos a 1600 vezes g, com a quebra máxima aplicada. Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga.

A fase superior do supernante sérico parecerá clara e amarelada. Verifique se a amostra apresenta sinais de hemólise e regissou a presença de hemólise quando apropriado. Em um armário de biossegurança classe II, transfira o soro para tubos de coleta como alíquotas de 250 microliter.

As alíquotas devem ser corretamente rotuladas. Congele imediatamente o soro vertical na caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius e registe o tempo de armazenamento da amostra. Verifique se as amostras foram processadas dentro do prazo de quatro horas exigido.

Centrifugar o tubo EDTA à temperatura ambiente por 10 minutos a 1600 vezes g, com a quebra máxima aplicada. Após a centrifugação, o supernatante de plasma parecerá claro e amarelado. Verifique se a amostra mostra sinais de hemólise e transfira o plasma para um tubo de centrífuga de 15 mililitros sem perturbar a camada celular usando uma pipeta sorológica descartável.

Deixe um pequeno volume residual de plasma acima da camada celular a aproximadamente cinco milímetros. Se for observada hemólise, descarte a amostra para análise posterior. Centrifugar o plasma e um tubo de centrífuga de 15 mililitros para remover quaisquer células sanguíneas intactas residuais transportadas da primeira etapa de centrifugação.

Remova cuidadosamente o tubo da centrífuga, não a pelota celular na parte inferior do tubo, e transfira de um a quatro mililitros de plasma para um a quatro mililitros de bio criogenia de polipropileno ou Eppendorfs usando uma pipeta sorológica descartável. Um volume residual de plasma deve ser deixado na parte inferior do tubo para evitar contaminar o plasma com células sanguíneas. Congele imediatamente o plasma ereto na caixa de armazenamento a menos 80 graus Celsius, e regise o tempo de armazenamento da amostra.

Verifique se as amostras estão corretamente rotuladas e processadas dentro do prazo de quatro horas exigido. Colete a camada celular usando uma ponta P1000 e filtrada e transfira-a para um tubo de dois mililitros. Congele imediatamente e armazene a menos 80 graus Celsius.

Um exemplo de extração de CFDNA de alta qualidade que pode ser usada para aplicações a jusante é mostrado aqui, enquanto esta imagem gráfica representa um exemplo de uma amostra inadequada com um alto nível de contaminação genômica. A fração de plasma ou soro deve ser de cor amarela. Isso pode variar dependendo da amostra individual.

As amostras com hemólise devem ser descartadas. Tenha cuidado para não remover nenhuma pelota celular ao remover a fração de plasma. Este protocolo também pode ser usado para outras aplicações à base de ácido nucleico e proteínas, como a detecção de RNAs não codificantes ou proteínas em amostras de soro e plasma usando técnicas de detecção de imunoss.

Esta é uma técnica muito padrão usada em muitos laboratórios. Este protocolo ajuda os pesquisadores a padronizar a forma como realizamos nossa análise, pois este é um aspecto crucial, necessário para futuras aplicações clínicas.