Name: Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2022-08-04T14:45:00.000+00:00
Duration: 10 min 30 s
Description: Aprenda a avaliar a contratilidade e eletrofisiologia de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Este método aprimora a precisão das avaliações de segurança cardíaca em desenvolvimento de medicamentos.

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Agradecemos a Blake Wu pela revisão do manuscrito. Este trabalho foi apoiado pelos Institutos Nacionais de Saúde (NIH) R01 HL113006, R01 HL141371, R01 HL163680, R01 HL141851, U01FD005978 e NASA NNX16A069A (JCW), e AHA Postdoctoral Fellowship 872244 (GMP).

1. Preparação de meios e soluções
<ol><li>Prepare o meio de manutenção hiPSC-CM misturando um frasco de 10 mL de suplemento de 50x B27 e 500 mL de meio RPMI 1640. Conservar o meio a 4 °C e utilizá-lo no prazo de um mês. Equilibre a temperatura média a temperatura ambiente (RT) antes de usar.</li>
	<li>Preparar o meio de semeadura hiPSC-CM misturando 20 mL de reposição sérica e 180 mL de meio de manutenção hiPSC-CM (diluição a 10%, v/v). Embora o meio de semeadura recém-preparado seja preferido, ele pode ser armazenado a 4 °C por não mais de 2 semanas. Equilibre o meio para RT antes de usar.</li>
	<li>Preparar a solução de revestimento da matriz extracelular descongelando um frasco (10 mL) de matriz de membrana basal a 4 °C durante a noite e alíquota de 500 μL de matriz de membrana basal em tubos estéreis de 1,5 mL. Conservar a -20 °C para posterior utilização. Misture 500 μL de matriz de membrana basal e 100 mL de meio DMEM/F12 gelado (diluição 1:200, v/v) para fazer uma solução de revestimento de matriz de membrana basal.</li>
	<li>Preparar 50 ml de solução de Tyrode contendo 135 mM de NaCl, 5,4 mM de KCl, 1 mM de MgCl 2, 1,8 mM de CaCl2, 5 mM de glucose e 10 mM de HEPES. Ajuste o pH para 7,4 com NaOH. Prepare a solução fresca de Tyrode no dia da experiência.</li>
	<li>Preparar 50 mL de solução de pipeta intracelular contendo 120 mM KCl, 1 mM MgCl2, 10 mM EGTA e 10 mM HEPES. Ajuste o pH para 7,2 com KOH. Aliquotar a solução de pipeta intracelular em tubos estéreis de 5 ml e armazená-la a -20 °C. No dia do experimento, adicionar MgATP à solução para atingir uma concentração final de 3 mM.</li>
	<li>Preparar 1 mL de solução de carga de Fura-2 AM contendo 2 μM de Fura-2 AM e F-127 Plurônico a 0,1%. Prepare uma solução de carregamento fresca no dia do experimento e proteja-a da luz.</li>
</ol>2. Medição do movimento de contração hiPSC-CM
<ol><li>Prepare placas revestidas de matriz de membrana basal adicionando 100 μL de solução de revestimento de matriz extracelular a cada poço de placas de 96 poços. Incubar as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>Dissociação enzimática de hiPSC-CMs<ol><li>Solicite hiPSCs do Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank (http://med.stanford.edu/scvibiobank.html). Gerar hiPSC-CMs de acordo com as publicações anteriores 8,9. Observe os CMs hiPSC cultivados em placas de seis poços sob um microscópio com ampliação de 10x. NOTA: Não dissociar as células quando elas ainda estiverem proliferativas. Caso contrário, as células crescerão demais nos poços após o replating e levarão a resultados imprecisos dos ensaios funcionais. Normalmente, os CMs hiPSC param a proliferação nos dias 18-23.</li>
		<li>Certifique-se de que os hiPSC-CMs estão batendo fortemente e têm uma pureza de mais de 95%. Avaliar a pureza por imunomarcação contra troponina T cardíaca, um marcador específico de cardiomiócitos 8,9.</li>
		<li>Aspirar o meio de manutenção e lavar as células com 1x DPBS duas vezes. Adicionar 1 ml de solução de descolamento celular a cada alvéolo das placas de seis poços e incubar durante 10 min a 37 °C. NOTA: A duração da incubação deve ser monitorizada regularmente. Certifique-se de não digerir excessivamente as células, pois isso reduzirá a viabilidade celular.</li>
		<li>Pipete suavemente hiPSC-CMs para cima e para baixo várias vezes usando uma pipeta de 5 mL para gerar uma suspensão de célula única. Adicione um volume igual de meio de semeadura hiPSC-CMs para neutralizar a solução de descolamento celular.</li>
		<li>Centrífuga hiPSC-CMs a 300 x g por 3 min no RT. Aspirar o sobrenadante e ressuspender o pellet celular em 1-2 mL de meio de semeadura hiPSC-CM.</li>
		<li>Quantifique a densidade celular e a viabilidade usando um método de exclusão de azul de tripano. Resumidamente, misture 10 μL de suspensão celular com um volume igual de azul de tripano, transfira para uma lâmina de contagem de células e, em seguida, conte usando um contador de células, conforme descrito anteriormente21.</li>
	</ol></li>
	<li>Semeadura hiPSC-CMs<ol><li>Remova a solução de revestimento da matriz extracelular das placas de 96 poços.</li>
		<li>Semear 50.000 células por poço em 100 μL de meio de semeadura hiPSC-CM e colocar as placas de 96 poços em uma incubadora de cultura celular umidificada a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.</li>
		<li>Substitua o meio de semeadura hiPSC-CM por 100 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias até a gravação.</li>
	</ol></li>
	<li>Aquisição de dados<ol><li>Meça o movimento de contração do hiPSC-CM pelo menos 10 dias após o plaqueamento (recomendado).</li>
		<li>Ligue o controlador de temperatura e defina 37 °C como a temperatura preferida. Ligue o microscópio, a câmera e a fonte de CO2 .</li>
		<li>Encher a camisa de água do suporte da placa com uma quantidade adequada de água desionizada estéril (Figura 2A). Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa e permita que as células se aclimatem por pelo menos 5 minutos.</li>
		<li>Abra o software de visualização, defina a taxa de quadros da câmera para 75 quadros por segundo (fps) e a resolução de vídeo/imagem para 1024 × 1024 pixels. Aplique as funções de foco automático e brilho automático. Grave vídeos e imagens de hiPSC-CMs. NOTA: Evite a vibração da mesa do microscópio durante a gravação.</li>
		<li>Abra o software analisador para análise automática.</li>
	</ol></li>
</ol>3. Medição do potencial de campo hiPSC-CM
<ol><li>Preparação de placas revestidas de matriz de membrana basal<ol><li>Coloque cuidadosamente uma gota de 8 μL de solução de revestimento de matriz extracelular sobre a área do eletrodo de gravação de cada poço das placas de matriz de microeletrodos (MEA) de 48 poços. Consulte a Figura 3A para a área apropriada do eletrodo para a colocação de gotículas. Esta etapa é fundamental para manter a monocamada hiPSC-CM concentrada nos eletrodos. Evite tocar nos eletrodos em qualquer circunstância.</li>
		<li>Adicionar 3 mL de água desionizada estéril à área ao redor dos poços (Figura 3A) das placas MEA de 48 poços para evitar a evaporação da solução de revestimento. Incubar placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 por 45-60 min. NOTA: Não incube por muito tempo para evitar que a matriz da membrana basal seque.</li>
	</ol></li>
	<li>Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.</li>
	<li>Semeadura hiPSC-CMs<ol><li>Remova a maior parte do meio da matriz extracelular da superfície do poço sem tocar nos eletrodos usando uma ponta de pipeta de 200 μL dentro da mesma linha ou coluna única.</li>
		<li>Semear 50.000 células por poço em uma gota de 8 μL de meio de semeadura hiPSC-CM sobre a área do eletrodo de registro de cada poço da mesma linha ou coluna.</li>
		<li>Repita os dois últimos passos até que todos os poços tenham sido banhados com células. Verifique ao microscópio se todos os poços têm a suspensão hiPSC-CM. Para a densidade desejada, consulte a Figura 3B. NOTA: A fixação de hiPSC-CMs será comprometida se a matriz da membrana basal estiver completamente seca, tornando a fixação celular subótima.</li>
		<li>Incubar as placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 por 60 min.</li>
		<li>Adicione lenta e suavemente 150 μL de meio de semeadura hiPSC-CM a cada poço das placas MEA de 48 poços. Para adicionar o meio sem dispersar os hiPSC-CMs previamente semeados, segure a placa em um ângulo de 45°, incline a ponta da pipeta contra a parede de cada poço e solte o meio lentamente. NOTA: Adicionar meio muito rapidamente ou com alta pressão irá desalojar os cardiomiócitos aderidos. Evite o contato direto com a suspensão de queda hiPSC-CM.</li>
		<li>Incubar as placas MEA de 48 poços em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.</li>
		<li>Atualizar o meio de semeadura hiPSC-CM com 300 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.</li>
	</ol></li>
	<li>Aquisição de dados<ol><li>Realizar a medição de MEA pelo menos 10 dias após o revestimento (recomendado). No dia 10 pós-plaqueamento, verificar a densidade da monocamada de hiPSC-CM de batimento espontâneo sob um microscópio com ampliação de 10x, que deve ser como mostrado na Figura 3C.</li>
		<li>Coloque a placa MEA de 48 poços no instrumento de gravação. O ecrã táctil permite observar o estado da temperatura (37 °C) e do CO2 (5%).</li>
		<li>Abra o software do navegador. Na janela de configuração experimental, selecione Configuração em tempo real cardíaca e gravações de potencial de campo. Aplique configurações de batida espontâneas ou cadenciadas.</li>
		<li>Nos parâmetros de detecção de batimento, defina o limiar de detecção para 300 μV, o período mínimo de batimento para 250 ms e o período de batimento máximo para 5 s. Selecione Regressão polinomial para o cálculo da duração potencial do campo (FPD).</li>
		<li>Verifique se o sinal de atividade elétrica de linha de base está maduro e estável. NOTA: As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo da placa MEA de múltiplos poços devem refletir o potencial do campo cardíaco com características facilmente identificáveis que coincidem com o pico de despolarização cardíaca e a fase de repolarização, como mostra a Figura 3D-F.</li>
		<li>Adquira as atividades cardíacas basais por 1-3 min. Se o tratamento medicamentoso for necessário, adicione compostos aos poços após o registro basal. Coloque a placa em uma incubadora por pelo menos 30 minutos antes da próxima gravação.</li>
	</ol></li>
</ol>4. Medição do potencial de ação hiPSC-CM
<ol><li>Preparar pratos revestidos de matriz de membrana basal colocando 500 μL de solução de revestimento de matriz extracelular na parte de fundo de vidro de placas de 35 mm (Figura 4A). Incubar as placas de 35 mm em incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.</li>
	<li>Semeadura hiPSC-CMs<ol><li>Remova a solução de revestimento de matriz extracelular das placas de 35 mm. Semeia 50.000 células por poço em 500 μL de meio de semeadura hiPSC-CM na parte inferior de vidro de placas de 35 mm.</li>
		<li>Incubar as placas de 35 mm em incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite. Remova o meio de semeadura hiPSC-CM e adicione 2 mL de meio de manutenção hiPSC-CM às placas de 35 mm. NOTA: Recomenda-se colocar uma ponta não filtrada de 200 μL sobre a pipeta de aspiração de 2 mL para remover o meio gasto para evitar o toque nas células.</li>
		<li>Altere o meio de cultura hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.</li>
	</ol></li>
	<li>Aquisição de dados<ol><li>Realizar a medição do potencial de ação pelo menos 10 dias após o chapeamento (recomendado). Preparar a solução fresca de Tyrode, conforme descrito no passo 1.4. Descongelar uma alíquota de solução de pipeta intracelular e adicionar MgATP a uma concentração final de 3 mM.</li>
		<li>Puxe as micropipetas dos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipeta. NOTA: É preferível uma resistência de 2-5 MΩ das micropipetas.</li>
		<li>Substitua o meio de manutenção hiPSC-CM pela solução de Tyrode e deixe que as células se acostumem à solução de Tyrode por 15 minutos (Figura 4C). Insira os sensores de temperatura na câmara, coloque o prato de 35 mm na câmara, como mostrado na Figura 4C, e ajuste a temperatura para 37 °C (Figura 4D).</li>
		<li>Encher as micropipetas com solução intracelular e inseri-las no suporte ligado ao headstage do amplificador patch-clamp (Figura 4E). Abra o software de estimulação/aquisição, carregue o protocolo de gravação do potencial de ação e selecione a configuração de pinça de tensão.</li>
		<li>Insira a micropipeta na solução de banho, selecione os hiPSC-CMs únicos apropriados e ajuste e diminua a posição da micropipeta ao lado da célula selecionada usando um micromanipulador. Quando a ponta da pipeta for inserida na solução de banho, verifique se há resistência da pipeta que pode ser observada no monitor do osciloscópio.</li>
		<li>Posicione a pipeta perto da célula e os pulsos de corrente diminuirão ligeiramente para refletir a crescente resistência à vedação. Aplique uma sucção suave com pressão negativa para aumentar a resistência, que formará um gigaseal. Aplique a função Selar .</li>
		<li>Aplique sucção adicional para quebrar a membrana para obter uma configuração de gravação de célula inteira. Uma vez que a porção da membrana dentro da área da pipeta é rompida por sucção, a solução interna está em equilíbrio com o citoplasma celular. Neste ponto, mude do modo de grampo de tensão (grampo em V) para o modo de grampo de corrente ou sem injeção de corrente (C-Clamp) usando a caixa de diálogo do amplificador. Pressione o botão Gravar para gerar e salvar os possíveis arquivos de gravação da ação. NOTA: A mudança de modo fornece um registro contínuo dos potenciais de ação espontânea de hiPSC-CMs através de nenhum gatilho e nenhum protocolo de gravação de estimulação, que pode ser monitorado na saída V-mon do amplificador patch-prancha.</li>
	</ol></li>
</ol>5. Medição do transiente hiPSC-CM Ca2+
<ol><li>Consulte o protocolo anterior para preparar câmaras celulares personalizadas para imagens Ca 2+ 21. Para a preparação da câmara celular revestida de matriz de membrana basal, coloque 200 μL de solução de revestimento de matriz extracelular nas câmaras celulares. Incubar as câmaras celulares em uma incubadora de cultura de células umidificadas a 37 °C, 5% de CO2 durante a noite.</li>
	<li>Realizar dissociação enzimática de hiPSC-CMs conforme descrito na etapa 2.2.</li>
	<li>Semeadura hiPSC-CMs<ol><li>Remova a solução de revestimento da matriz extracelular das câmaras celulares. Semear 20.000 células por poço em 200 μL de meio de semeadura hiPSC-CM.</li>
		<li>Substitua o meio de semeadura hiPSC-CM por 200 μL de meio de manutenção hiPSC-CM 1 dia após o revestimento. Altere o meio de manutenção hiPSC-CM a cada 2 dias antes da gravação.</li>
	</ol></li>
	<li>Aquisição de dados<ol><li>Realize a medição transitória de Ca2+ pelo menos 10 dias após o revestimento (recomendado). Preparar a solução fresca de Tyrode, conforme descrito no passo 1.4. Preparar a solução de carregamento Fura-2 AM fresca, conforme descrito no passo 1.6.</li>
		<li>Aspirar o meio de manutenção hiPSC-CM e lavar com a solução de Tyrode's duas vezes. Aplicar 100 μL de solução de carregamento Fura-2 AM e incubar por 10 min no RT.</li>
		<li>Substitua a solução de carregamento Fura-2 AM pela solução da Tyrode e aguarde pelo menos 5 minutos para a desesterificação completa da Fura-2 AM.</li>
		<li>Adicione uma gota de óleo de imersão na objetiva de 40x de um microscópio de epifluorescência invertida equipado com uma objetiva de imersão em óleo de 40x (0,95 NA). Coloque a câmara celular no adaptador de palco do microscópio (Figura 5A).</li>
		<li>Instale os fios do controlador de temperatura na câmara de banho e defina-a para 37 °C. Instale os eletrodos de estimulação de campo elétrico e ajuste os pulsos em 0,5 Hz com uma duração de 20 ms.</li>
		<li>Ligue a fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra-alta velocidade e configure-a para o modo de comutação rápida de 340 nm e 380 nm, de acordo com as instruções do instrumento.</li>
		<li>Aplique um tempo de exposição de 20 ms para ambos os comprimentos de onda e um tempo de gravação de 20 s no software. Grave o vídeo refletindo as mudanças em tempo real do transiente Ca2+ em CMs hiPSC. Exporte os dados para uma planilha e analise os dados conforme descrito anteriormente23.</li>
	</ol></li>
</ol>

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<li>Ng, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((High-throughput+phenotyping+of+heteromeric+human+ether-a-go-go-related+gene+potassium+channel+variants+can+discriminate+pathogenic+from+rare+benign+variants%5BTitle%5D)+AND+%22Heart+Rhythm%22%5BJournal%5D)">High-throughput phenotyping of heteromeric human ether-a-go-go-related gene potassium channel variants can discriminate pathogenic from rare benign variants.</a> Heart Rhythm. 17 (3), 492-500 (2020).</li>
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<li>Li, W., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Establishment+of+an+automated+patch-clamp+platform+for+electrophysiological+and+pharmacological+evaluation+of+hiPSC-CMs%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Establishment of an automated patch-clamp platform for electrophysiological and pharmacological evaluation of hiPSC-CMs.</a> Stem Cell Research. 41, 101662(2019).</li>
<li>Li, W., Luo, X., Ulbricht, Y., Guan, K. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Blebbistatin+protects+iPSC-CMs+from+hypercontraction+and+facilitates+automated+patch-clamp+based+electrophysiological+study%5BTitle%5D)+AND+%22Stem+Cell+Research%22%5BJournal%5D)">Blebbistatin protects iPSC-CMs from hypercontraction and facilitates automated patch-clamp based electrophysiological study.</a> Stem Cell Research. 56, 102565(2021).</li>
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</ol>

J.C.W. é co-fundador da Greenstone Biosciences, mas não tem interesses concorrentes, pois o trabalho apresentado aqui é completamente independente. Os demais autores declaram não haver interesses concorrentes.

A tecnologia iPSC humana emergiu como uma plataforma poderosa para modelagem de doenças e triagem de medicamentos. Aqui, descrevemos um protocolo detalhado para medir a contratilidade do hiPSC-CM, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+. Este protocolo fornece uma caracterização abrangente da contratilidade e eletrofisiologia do hiPSC-CM. Esses ensaios funcionais têm sido aplicados em múltiplas publicações do nosso grupo 12,13,18,24,25,26,27.<sup class="...

O desenvolvimento de medicamentos é um processo longo e caro. Um estudo de novos medicamentos terapêuticos aprovados pela Food and Drug Administration (FDA) dos EUA entre 2009 e 2018 relatou que o custo médio estimado de pesquisas capitalizadas e ensaios clínicos foi de US $ 985 milhões por produto1. A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito e retirada de drogas do mercado2. Notavelmente, a cardiotoxicidade é relatada entre as múltiplas classes de drogas terapêuticas3. Portanto, a avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. O paradigma atual para a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de modelos animais. No entanto, as diferenças de espécies em relação ao uso de modelos animais são cada vez mais reconhecidas como a principal causa de previsões imprecisas para a cardiotoxicidade induzida por drogas em pacientes humanos4. Por exemplo, a morfologia do potencial de ação cardíaca difere substancialmente entre humanos e camundongos devido às contribuições de diferentes correntes de repolarização5. Além disso, isoformas diferenciais de miosina cardíaca e RNAs circulares que podem afetar a fisiologia cardíaca têm sido bem documentadas entre as espécies 6,7. Para preencher essas lacunas, é imperativo estabelecer um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca.
A invenção inovadora da tecnologia de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSC) gerou plataformas sem precedentes de triagem de medicamentos e modelagem de doenças. Na última década, métodos para gerar cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) tornaram-se bem estabelecidos 8,9. Os CM-hiPSC têm atraído grande interesse em suas potenciais aplicações na modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Por exemplo, os CM-hiPSC têm sido utilizados para modelar os fenótipos patológicos de doenças cardíacas causadas por herança genética, como a síndrome do QT longo10, a cardiomiopatia hipertrófica 11,12 e a cardiomiopatia dilatada13,14,15. Consequentemente, foram identificadas as principais vias de sinalização implicadas na patogênese das doenças cardíacas, o que pode lançar luz sobre possíveis estratégias terapêuticas para um tratamento eficaz. Além disso, os CM-hiPSC têm sido utilizados para rastrear a cardiotoxicidade induzida por drogas associada a agentes anticancerígenos, incluindo doxorrubicina, trastuzumabe e inibidores da tirosina quinase16,17,18; estratégias para mitigar a cardiotoxicidade resultante estão sob investigação. Por fim, a informação genética retida nas CME-hiPSC permite a triagem e a predição da cardiotoxicidade induzida por fármacos tanto em nível individual quanto populacional19,20. Coletivamente, os hiPSC-CMs provaram ser uma ferramenta inestimável para a previsão personalizada da segurança cardíaca.
O objetivo geral deste protocolo é estabelecer metodologias para investigar de forma abrangente e eficiente as características funcionais dos CM-hiPSC, que são de grande importância na aplicação de CMhiPSC para modelagem de doenças, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão. Aqui, detalhamos uma série de ensaios funcionais para avaliar as propriedades funcionais dos CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio (Ca2+) (Figura 1).

<table><tbody><tr><td>Prato de fundo de vidro de 35 mm com vidro de cobertura de micropoço #1.5 de 20 mm</td><td>Cellvis</td><td>D35-20-1.5-N</td><td>Patch clamp</td></tr><tr><td>50x suplementos B27</td><td>Life Technologies</td><td>17504-044</td><td>hiPSC-CM meio de cultura</td></tr> de <tr><td>6 poços placa de cultura</td><td>E & K Scientific</td><td>EK-27160</td><td>hiPSC-CM cultura</td></tr><tr><td>96 poços fundo plano transparente poliestireno preto microplacas tratadas com TC</td><td>Corning</td><td>3603</td><td>Medição de movimento de contração</td></tr><tr><td>Accutase</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A6964</td><td>Dissociação enzimática</td></tr><tr><td>Axion's Integrated Studio (AxIS)</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>software de navegação</td></tr><tr><td>Capilares de vidro borossilicato</td><td>Harvard Apparatus</td><td>BF 100-50-10,</td> <td>Grampo de remendo</td></tr><tr><td>CaCl2 1 M in H2O</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>21115</td><td>Tyrode' s solução</td></tr><tr><td>Corrediças de câmara de contagem de células</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>C10228</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Placas MEA de 48 poços</td><td>Axion Biosystems</td><td>M768-tMEA-48B</td><td>MEA</td></tr><tr><td>DMEM/F12</td><td>Gibco/Life Technologies</td><td>12634028</td><td>Meio de matriz extracelular</td></tr><tr><td>DPBS, sem cálcio, sem magnésio</td><td>Fisher Scientific</td><td>14-190-250</td><td></td></tr><tr><td>EGTA</td> Solução de <td>pipeta intracelular</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>E3889</td></tr><tr><td>EPC 10 USB&nbsp; amplificador de patch clamp</td><td>Warner Instruments</td><td>89-5000</td><td>Patch clamp</td></tr><tr><td>Fura-2, AM, cell permeant</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>F1221</td><td>Ca2+ medição transitória</td></tr><tr><td>Glicose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G8270</td><td>Tyrode' solução HEPES</td></tr><tr><td></td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3375</td><td>Tyrode' solução</td></tr><tr><td>hiPSCs</td><td>Stanford Cardiovascular Institute iPSC Biobank</td><td></td><td></td></tr><tr><td>KCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>529552</td><td>Tyrode' s solução</td></tr><tr><td>KnockOut Serum Replacement</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>10828-028</td><td>hiPSC-CM meio de semeadura</td></tr><tr><td>KOH 8&nbsp; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P4494</td><td>Solução de pipeta intracelular</td></tr><tr><td>Lambda DG 4</td><td>Sutter Instrument Company</td><td></td><td>Ca2+ medição transitória; fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra-alta velocidade</td></tr><tr><td>Contador de células de fluorescência automatizado Luna-FL</td><td>WISBIOMED</td><td>LB-L20001</td><td>Contagem de células</td></tr><tr><td>Maestro Pro&nbsp; Sistema MEA</td><td>Axion Biosystems</td><td></td><td>MEA</td></tr><tr><td>Matrigel Fator de Crescimento Reduzido (TFG) Matriz da Membrana Basal</td><td>Corning</td><td>356231</td><td>Meio de matriz extracelular</td></tr><tr><td>MgATP</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>A9187</td><td>Solução de pipeta intracelular</td></tr><tr><td>MgCl2</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>M8266</td><td>Tyrode' s solução</td></tr><tr><td>NaCl</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S9888</td><td>Tyrode' s solução</td></tr><tr><td>NaOH 10&nbsp; M</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>72068</td><td>Tyrode' s</td></tr><tr><td>solução NIS Elements AR</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Pluronic F-127 (solução a 20% em DMSO)</td><td>ThermoFisher Scientific</td><td>P3000MP</td><td>Ca2+ medição transitória</td></tr><tr><td>RPMI 1640 meio</td><td>de cultura Life Technologies</td><td>11875-119</td><td>hiPSC-CM</td></tr><tr><td>Sony SI8000 Cell Motion Imaging System</td><td>Sony Biotechnology</td><td></td><td>Medição de movimento de contração</td></tr><tr><td>Extrator de micropipetas</td><td>Sutter Instruments</td><td>P-97</td><td>Patch clamp</td></tr><tr><td>Mancha azul tripano</td><td>Life Technologies</td><td>T10282</td><td>Contagem de células</td></tr></tbody></table>

aplicações técnicas de gravação de matriz de microeletrodos e braçadeiras de adesivos em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

Technical Applications of Microelectrode Array and Patch Clamp Recordings on Human Induced Pluripotent Stem Cell-Derived Cardiomyocytes

A cardiotoxicidade induzida por drogas é a principal causa de atrito de drogas e retirada do mercado. Portanto, o uso de modelos adequados de avaliação de segurança cardíaca pré-clínica é uma etapa crítica durante o desenvolvimento do medicamento. Atualmente, a avaliação da segurança cardíaca ainda é altamente dependente de estudos em animais. No entanto, os modelos animais são atormentados pela baixa especificidade translacional para os seres humanos devido a diferenças específicas da espécie, particularmente em termos de características eletrofisiológicas cardíacas. Assim, há uma necessidade urgente de desenvolver um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para a avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro inestimável para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Os CMCs hiPSC podem ser obtidos de indivíduos com diversas origens genéticas e várias condições doentes, tornando-os um substituto ideal para avaliar a cardiotoxicidade induzida por drogas individualmente. Portanto, metodologias para investigar de forma abrangente as características funcionais dos CME-hiPSC precisam ser estabelecidas. Neste protocolo, detalhamos vários ensaios funcionais que podem ser avaliados em CM-hiPSC, incluindo a medição da contratilidade, potencial de campo, potencial de ação e manuseio de cálcio. No geral, a incorporação de hiPSC-CMs na avaliação pré-clínica da segurança cardíaca tem o potencial de revolucionar o desenvolvimento de medicamentos.

Este protocolo descreve como medir o movimento de contração, o potencial de campo, o potencial de ação e o transiente Ca2+ de CM-hiPSC. Um diagrama esquemático incluindo a digestão enzimática, a semeadura celular, a manutenção e a condução do ensaio funcional é mostrado na Figura 1. A formação da monocamada hiPSC-CM é necessária para a medição do movimento de contração (Figura 2B). Um traço representativo do movimento de contração-relaxamento dos CM-h...

Os cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos (hiPSC-CMs) emergiram como um modelo in vitro promissor para triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e modelagem de doenças. Aqui, detalhamos um protocolo para medir a contratilidade e eletrofisiologia dos CM-hiPSC.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

Drug-induced cardiotoxicity is the leading cause of drug attrition and withdrawal from the market. Therefore, using appropriate preclinical cardiac safety ...

A avaliação da segurança cardíaca é um componente crucial durante o processo de desenvolvimento de medicamentos. Os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos provaram ser um modelo confiável, eficiente e baseado em humanos para avaliação pré-clínica da segurança cardíaca. Estabelecemos metodologias para investigar de forma abrangente a característica funcional dos cardiomiócitos derivados de iPSC humanos, que são de modelagem de doenças realmente importantes, triagem de cardiotoxicidade induzida por drogas e medicina de precisão.A crescente incorporação de cardiomiócitos derivados de iPSC humanos no processo padrão de avaliações de segurança pré-clínicas tem o potencial de melhorar a precisão da previsão de toxicidade dos compostos de um candidato. Comece por cultivar os cardiomiócitos derivados de iPSC humanos por pelo menos 10 dias antes de fazer a medição. Ligue o controlador de temperatura e defina-o a 37 graus Celsius.Ligue o microscópio, a câmera e o suprimento de dióxido de carbono. Encha a camisa de água do suporte da placa com uma quantidade apropriada de água deionizada estéril. Coloque a placa de 96 poços no suporte da placa e incube as células por pelo menos cinco minutos.Abra o software de visualização e, em seguida, defina a taxa de fotogramas da câmara para 75 fotogramas por segundo e a resolução do vídeo ou da imagem para 1024 x 1024 píxeis. Aplique as funções de foco automático e brilho automático, grave vídeos e imagens de cardiomiócitos derivados de iPSC humanos. Coloque cuidadosamente uma gota de oito microlitros de solução de revestimento de matriz celular extra sobre a área do eletrodo de gravação de cada poço das placas de matriz de microeletrodos de 48 poços.Em seguida, adicione três mililitros de água desionizada estéril à área ao redor dos poços para evitar a evaporação da solução de revestimento. Usando uma ponta de pipeta de 200 microlitros, remova a maior parte do meio da matriz celular extra da superfície do poço dentro da mesma fileira ou coluna sem tocar nos eletrodos. Semee 50.000 células por poço em uma gota de oito microlitros de meio de semeadura sobre a área do eletrodo de gravação.Repita até que todos os poços tenham sido banhados com células. Em seguida, incube as placas de matriz de microeletrodos em uma incubadora de cultura de células umidificadas. Adicione lentamente 150 microlitros de meio de semeadura a cada poço das placas de matriz de microeletrodos.No dia 10 pós-plaqueamento, verifique a densidade de batimento espontâneo humano iPSC CM monocamada sob um microscópio. Coloque a placa de matriz de microeletrodos de 48 poços no instrumento de gravação. Certifique-se de que a temperatura é de 37 graus Celsius e dióxido de carbono é de 5%Abra o software do navegador.Na janela de configuração experimental, selecione a configuração cardíaca em tempo real e os registros de potencial de campo. Aplique configurações de batida espontâneas ou coladas. Nos parâmetros de detecção de batimento, defina o limite de detecção para 300 micro volts, o período mínimo de batimento para 250 milissegundos e o período máximo de batimento para cinco segundos.Selecione regressão polinomial para o cálculo da duração potencial do campo. Verifique se o sinal de atividade elétrica basal está maduro e estável e adquira as atividades cardíacas basais por um a três minutos. Realizar a gravação 10 dias pós-plaqueamento.Substitua o meio de manutenção iPSC CM humano pela solução de tyrode e permita que as células se aclimatem por 15 minutos. Insira os sensores de temperatura na câmara e coloque o prato de 35 milímetros dentro. Ajuste a temperatura para 37 graus Celsius.Puxe as micropipetas dos capilares de vidro borossilicato usando um puxador de micropipeta. Encha as micropipetas com a solução intracelular e insira-as no suporte ligado à fase principal do amplificador de braçadeira de patch. Abra o software de aquisição, carregue o protocolo de gravação do potencial de ação e selecione a configuração da braçadeira de tensão.Insira a micropipeta na solução de banho e selecione CMs iPSC humanos únicos apropriados. Ajuste e abaixe a posição da micropipeta ao lado da célula selecionada usando um micromanipulador. Quando a ponta da pipeta for inserida na solução de banho, verifique a resistência da pipeta no monitor do osciloscópio.Posicione a pipeta perto da célula e os pulsos de corrente diminuirão ligeiramente para refletir a crescente resistência à vedação. Aplique uma sucção suave com pressão negativa para aumentar a resistência. Isso formará um gigaseal.Em seguida, aplique a função de vedação. Aplique sucção adicional para quebrar a membrana para obter uma configuração de gravação de célula inteira. Neste ponto, mude do modo de pinça de tensão para o modo de braçadeira de corrente ou nenhuma injeção de corrente usando o diálogo do amplificador.Pressione o botão de gravação para gerar e salvar os arquivos de gravação em potencial de ação. Realizar a medição do transiente de cálcio pelo menos 10 dias após o plaqueamento. Prepare a solução de tiro fresco e a solução de carregamento Fura-2 AM.Aspirar o meio de manutenção iPSC CM humano e lavar as câmaras com a solução de tiro duas vezes. Aplicar 100 microlitros de solução de carregamento Fura-2 AM e incubar durante 10 minutos à temperatura ambiente. Substitua a solução de carregamento de Fura-2 AM pela solução de tyrode e incube por pelo menos cinco minutos para desesterificação completa de Fura-2 AM. Adicione uma gota de óleo de imersão na objetiva de imersão em óleo 40x de um microscópio de epifluorescência invertida.Coloque a câmara celular no adaptador de estágio do microscópio. Instale os fios do controlador de temperatura na câmara de banho e configure-o para 37 graus Celsius. Instale os eletrodos de estimulação de campo elétrico e defina os pulsos em 0,5 hertz com uma duração de 20 milissegundos.Ligue a fonte de luz de comutação de comprimento de onda de ultra alta velocidade e defina-a para o modo de comutação rápida de 340 nanômetros e 380 nanômetros. Aplique um tempo de exposição de 20 milissegundos para ambos os comprimentos de onda e um tempo de gravação de 20 segundos. Grave o vídeo refletindo as mudanças em tempo real do transiente de cálcio, exporte os dados para uma planilha para análise.A monocamada de cardiomiócitos derivados de iPSC humano foi utilizada para a mensuração do movimento de contração. A análise de um traço do movimento de relaxamento da contração usando o software analisador detectou o início das contrações, o pico de contração, o fim da contração, o pico de relaxamento e o fim do relaxamento. A cobertura total da monocamada de cardiomiócitos derivados de iPSC humano foi observada em todos os eletrodos dentro das placas de matriz de microeletrodos.As formas de onda maduras registradas por cada eletrodo refletiram o potencial do campo cardíaco com características identificáveis. Após a análise, obtiveram-se o período de batimento, a duração do potencial de campo e a amplitude do pico. Registros de pinça de remendo de células inteiras no modo de pinçamento atual registraram os potenciais de ação espontânea de cardiomiócitos únicos.Após a análise, vários parâmetros, incluindo a amplitude, o potencial diastólico máximo e a duração do potencial de ação foram obtidos. Após a análise da imagem de cálcio, obteve-se a relação F340 por F380 ao longo do tempo e plotaram-se vestígios brutos de transientes de cálcio estimulados. Além disso, parâmetros como amplitude, cálcio diastólico e tau de decaimento de cálcio foram obtidos.É importante usar os cardiomiócitos derivados da iPSC humana que estão em boas condições de batimento, bem como garantir a alta pureza dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana. Este protocolo inclui quatro técnicas específicas para estudar a funcionalidade dos cardiomiócitos derivados da iPSC humana, outra configuração ou o estudo automático das correntes iônicas cardíacas que desempenham um papel crucial no coração

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Research

JoVE Journal

Medicine

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A caracterização eletrofisiológica de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes humanas (hPSC-CMs) é crucial para a modelagem de doenças cardíacas e para a determinação de respostas de fármacos. Este protocolo fornece as informações necessárias para dissociar e plaquear hPSC-CMs em matrizes de múltiplos eléctrodos, medir o seu potencial de campo e um método para analisar os intervalos QT e RR.

Análise eletrofisiológica de cardiomiócitos humanos derivados de células-tronco pluripotentes (hPSC-CMs) usando matrizes de múltiplos eletrodos (MEAs)

Aqui nós apresentamos um método de potenciais de ação opticamente imagem, especificamente em pluripotentes induzidas ventricular, como células-tronco derivadas cardiomyocytes. O método baseia-se na expressão de uma proteína fluorescente sensível à tensão orientado para o promotor.

Potencial de ação óptico subtipo específico gravações em humanos induzida pluripotentes células-tronco derivadas de Cardiomyocytes Ventricular

Este artigo contem um jogo dos protocolos para o desenvolvimento de redes pluripotentes induzidas humanas do cardiomiócito (hipsc-cm) cultivadas em placas de de mea para electroporate reversivelmente a membrana de pilha para medidas do potencial da ação. Gravações de alta taxa de transferência são obtidas dos mesmos sites de célula repetidamente ao longo dos dias.

Redes humanas de cardiomiócitos derivadas de iPSC em matrizes de microeletrodos Multipoços para gravações em potencial de ação recorrente

Aqui descrevemos a aquisição óptica e a caracterização de potenciais de ação a partir de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos usando um sistema de fotometria modular de alta velocidade.

Medição potencial de ação óptica unicelular em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos

A análise de alterações na função contrátil e integridade celular de cardiomiócitos humanos derivados de iPSC é de imensa importância para o desenvolvimento de medicamentos não clínicos. Um sistema híbrido de análise celular de 96 poços aborda ambos os parâmetros de maneira fisiológica e em tempo real para obter resultados confiáveis e relevantes para o ser humano, necessários para uma transição segura para os estágios clínicos.

Sistema de Análise de Células Híbridas para Avaliação de Alterações Estruturais e Contráteis de Cardiomiócitos Derivados de iPSC Humanos para Avaliação Pré-Clínica de Risco Cardíaco

A combinação de poração a laser e matrizes de microeletrodos (MEA) permite registros semelhantes ao potencial de ação de cardiomiócitos primários cultivados e derivados de células-tronco. A forma de onda fornece uma visão superior do modo de ação dos compostos de teste do que as gravações padrão. Ele vincula patch-clamp e leitura de MEA para otimizar ainda mais a pesquisa de segurança cardiovascular no futuro.

Medições do Potencial de Ação Induzidas por Laser de Cardiomiócitos em Matrizes de Microeletrodos para Maior Previsibilidade da Farmacologia de Segurança

Aqui, demonstramos um método de avaliação da contratilidade de dispositivos médicos cardíacos não invasivos usando monocamadas de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D (hiPSC-CM), banhadas em um substrato flexível, juntamente com microscopia baseada em vídeo. Esta ferramenta será útil para a avaliação in vitro das propriedades contráteis de dispositivos de eletrofisiologia cardíaca.

Avaliação da Terapia de Modulação da Contratilidade Cardíaca em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Humanas 2D

Aqui, um método estabelecido é descrito para realizar medidas de contratilidade e cálcio em cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidos por humanos usando uma plataforma óptica. Esta plataforma permite aos investigadores estudar o efeito das mutações e a resposta a vários estímulos de forma rápida e reprodutível.

Medidas em Tempo Real de Parâmetros de Cálcio e Contratilidade em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidos Humanos

Para desvendar são desesperadamente necessários os primeiros mecanismos moleculares subjacentes câncer de próstata iniciação, romance e sistemas de modelos humanos e abordagens inovadoras. O potencial de pré-prostática seio urogenital mesênquima (UGSM) para induzir as populações de células estaminais pluripotentes para formar o epitélio da próstata humana é uma ferramenta poderosa na investigação experimental próstata.

Formação de Epithelium próstata humano utilizando Tissue Recombinação de Rodent Urogenital Mesênquima Sinus e células-tronco humanas

O conhecimento atual sobre a base celular de doenças cardíacas se baseia principalmente em estudos em modelos animais. Aqui nós descrevemos e validar um novo método para obter simples cardiomiócitos viáveis ​​a partir de pequenas amostras cirúrgicas do miocárdio ventricular humano. Miócitos ventriculares humanos podem ser usados ​​para estudos eletrofisiológicos e testes de drogas.

Isolamento e caracterização funcional de Ventricular Humano cardiomiócitos a partir de amostras cirúrgicas frescos

Aprenda a avaliar a contratilidade e eletrofisiologia de cardiomiócitos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas humanas. Este método aprimora a precisão das avaliações de segurança cardíaca em desenvolvimento de medicamentos.

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos (Vídeo) | JoVE Journal

Aplicações Técnicas de Gravação de Matriz de Microeletrodos e Braçadeiras de Adesivos em Cardiomiócitos Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas por Humanos

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