Mapeando a densidade absoluta de DNA em núcleos celulares usando microscopia de localização de molécula única

O presente método permite medições absolutas de densidade de DNA em núcleos celulares para investigar as restrições espaciais em estruturas de cromatina que, de outra forma, são caracterizadas apenas por modificações de histonas pós-tradução. A tesselação de Voronoi combinada com SMLM permite estimativas de densidade absoluta de DNA em termos de par de bases por micrômetro quadrado. O único conhecimento a priori necessário é o conteúdo total de DNA do núcleo celular medido.

Em experimentos futuros, seria interessante investigar se as diferenças absolutas de densidade se correlacionam com informações biológicas de outros métodos, como imunofluorescência de modificações epigenéticas ou dados de Hi-C. Comece reconstruindo a área digitalizada juntando as imagens individuais pré-gravadas. Abra o CellProfiler e carregue o pipeline cellcycleanalysis.cpproj.

Na primeira etapa de imagens do pipeline, arraste e solte as imagens, incluindo a imagem de referência. Em seguida, defina um local onde as imagens de referência serão armazenadas. Em seguida, clique no ícone Iniciar modo de teste seguido de Executar.

Uma vez exibido o histograma dos núcleos na imagem a ser analisada, determine os intervalos de intensidade para as fases G1, S e G2 e certifique-se de que eles sejam inseridos nas etapas subsequentes do objeto de filtro da tubulação e que essas etapas estejam ativas. Em seguida, clique no botão Executar novamente para continuar com a segunda metade do pipeline. Olhe para as três imagens com as sobreposições que representam os diferentes estágios do ciclo celular, G1, S ou G2, e selecione os núcleos em G1 ou G2 para obter mais imagens, de modo que a quantidade de DNA nos pares de bases dos núcleos da imagem seja conhecida.

Reposicione as células no microscópio de localização de molécula única e garanta o piscar adequado do processo FPALM. Primeiro, grave uma pilha 3D do núcleo escolhido usando apenas 500 quadros por fatia. Isso permite determinar a quantidade relativa de DNA na barriga, que é posteriormente fotografada com muito mais quadros para revelar sua ultraestrutura.

Comece a aquisição da série de imagens usando um tempo de exposição de 50 milissegundos, resultando em uma taxa de quadros de aproximadamente 20 quadros por segundo. Faça uma pilha Z através do núcleo com intervalos de passo de 200 nanômetros e apenas 500 quadros por seção óptica leve. Depois que a pilha foi adquirida, retorne à posição z inicial e adquira o conjunto de dados principal de 50.000 quadros com o mesmo tempo de exposição de 50 milissegundos.

Abra o conjunto de dados FPALM no ImageJ. Para otimizar as configurações para a detecção de sinais piscando, clique em ThunderSTORM e, em seguida, em Executar análise. Agora, escolha Configuração da câmera.

Insira o tamanho correto de pixels dos dados da imagem, a contagem A/D, a eficiência quântica da câmera usada, o nível base e o ganho EM e clique em OK. Escolha o algoritmo para determinar as coordenadas de localização ajustando os sinais piscando. Na seção Filtragem de imagem, use o filtro Wavelet B-Spline com uma ordem B-Spline 3 e uma escala B-Spline 2. Em seguida, defina o Método de localização aproximada de moléculas para o máximo local, defina o limite de intensidade de pico e a conectividade para 8 vizinhanças.

Na seção Localização de subpixel de moléculas, como um Método, escolha PSF integrado Gaussiano, defina Raio de ajuste px como 3, selecione Método de ajuste como Máxima verossimilhança e defina Sigma inicial como 1,6. Em seguida, clique em OK para iniciar a detecção dos sinais e a reconstrução da imagem. Se a aquisição for particionada em pilhas de imagens diferentes, concatene as tabelas de localização no ThunderSTORM.

Para fazer isso, clique em Importar na janela pop-up. Certifique-se de que a opção Acrescentar à tabela atual esteja ativada e que o número inicial correto seja usado para evitar a substituição de localizações na tabela. Em seguida, selecione o caminho do arquivo e clique em OK para importar um arquivo após o outro.

Para evitar a contagem excessiva de sinais em quadros consecutivos, mescle os dados de localização usando a distância máxima de 20 nanômetros, 1 quadro máximo desligado e 0 quadro máximo por molécula e clique em Mesclar. Para medir e corrigir o desvio correlacionando subseções de dados, abra o menu Correção de desvio e clique nas setas. Adicione 3 compartimentos e defina a Ampliação para 5.

Em seguida, clique em Aplicar e a janela mostrando o desvio x e y aparecerá. Para determinar a quantidade de sinal que é proporcional ao conteúdo de DNA em cada fatia da pilha 3D pré-gravada com 500 quadros para cada fatia, escolha Plug-ins, depois ThunderSTORM, seguido por Importar/Exportar e importe a tabela de resultados para a primeira fatia da pilha. Para evitar a contagem excessiva de sinais de outros planos de imagem da pilha 3D, os sinais de fora do intervalo de passo de 200 nanômetros em z entre as fatias precisam ser removidos.

Pressione Plotar histograma e, na caixa de diálogo Distribuição aberta, escolha z e pressione OK. Determine a posição do pico e use o campo de filtro para selecionar os sinais com o tamanho do passo óptico de 200 nanômetros. Clique em Visualização e escolha a opção Histogramas e, em seguida, clique em OK. Salve a imagem resultante em uma pasta no formato TIFF. Abra todas as fatias e combine-as usando Imagem seguida de Pilhas e, em seguida, Imagens para empilhar.

Depois de selecionar toda a área da imagem, vá para Analisar, clique em Ferramentas e selecione o ROI Manager. Clique em Adicionar, depois em Analisar, seguido de Definir Medidas e selecione Densidade integrada. Agora, escolha a opção Mais, selecione Multi Measure, marque Measure all stacks e One row per slice.

Clique em OK e os resultados serão exibidos. A soma das intensidades de todas as fatias é proporcional ao conteúdo de DNA de todo o núcleo, da mesma forma que as intensidades de fatias individuais são proporcionais à sua fração de todo o genoma. Depois de abrir a tabela de resultados do plano central que contém os sinais de 50.000 quadros, filtre-a para uma espessura de 100 nanômetros.

Crie o histograma dos sinais resultantes conforme demonstrado anteriormente e meça a densidade integrada da seção central. Converta a grande tabela de localização do ThunderSTORM contendo as informações ultraestruturais da seção central do formato csv para o formato ORTE executando o script MATLAB TS2orte. m, que transforma a tabela de localização em uma matriz MATLAB e a salva no formato mat.

Vá para a pasta LAND-voronoi e, na subpasta coreAlgorithm, abra o arquivo voronoicluster. m e ajustar o conteúdo de DNA, fração da seção central observada de todo o DNA da fração do núcleo e localizações, e o fator de conversão de acordo com o tipo de célula usado e o estágio do ciclo celular para os cálculos de densidade absoluta. Edite o script que inicia a análise voronoi.m.

Ajuste o caminho do arquivo para os dados de localização do orte e a pasta de saída para os arquivos de resultado. Especifique as coordenadas que definem a área na qual a suavização de serrilhado deve ser feita. Defina várias áreas para calcular no mesmo conjunto de dados de entrada.

Depois de executar o script, procure a imagem que mostra as densidades absolutas de DNA junto com outros arquivos contendo gráficos que mostram o histograma da distribuição de área e as densidades. m contendo as densidades de cada célula Voronoi calculada na pasta de saída. A medição FPALM consistindo em 50.000 quadros resultou em 2,68 vezes 10 elevado a 6 localizações detectadas dentro de uma seção intermediária de 100 nanômetros de espessura.

A precisão de localização da imagem reconstruída foi de 10 nanômetros. O grande número de localizações permitiu a combinação de imagens de super-resolução enquanto mostrava densidades absolutas de DNA. Ficou claro que as densidades de DNA medidas não estavam uniformemente distribuídas pelo núcleo e cobriam uma extensa faixa dinâmica.

Maiores ampliações de áreas dentro do núcleo mostrando células Voronoi maiores indicaram baixas densidades de DNA, enquanto células menores indicaram altas densidades de DNA. As densidades de DNA medidas em um meio núcleo G1C3H10T mostraram a distribuição absoluta da densidade de DNA dentro do núcleo de um tipo e espécie diferentes. Embora a organização básica se parecesse com o núcleo G1 HeLa inicial, ela também possuía aglomerados constitutivos de heterocromatina paracêntrica.

Nenhuma mudança arquitetônica dramática foi observada em um núcleo G2, apesar de um tamanho nuclear ligeiramente aumentado. O núcleo HeLa tratado com TSA mostrou diferenças notáveis em relação à topografia nuclear e densidade de DNA. Com exceção da heterocromatina periférica, que apresentava ilhas de maior densidade de DNA, o restante da cromatina parecia muito mais homogêneo e descondensado.