Name: Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2013-08-15T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 16 s
Description: Aprenda a realizar FISH de DNA 3D com sondas diretamente rotuladas para analisar a arquitetura nuclear e a organização espacial de loci genômicos em células individuais. Este protocolo robusto oferece sinais fluorescentes intensos.

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Este trabalho foi financiado pelo BBSRC eo Wellcome Trust. Gostaríamos de agradecer Simon Walker para a assistência com imagem e Felix Krueger para obter ajuda com a análise bioinformática.

1. Gerando Sondas de DNA diretamente identificadas por Nick Translation Nota: sondas Diretamente rotulados feitas a partir de BACs (100-250 kb) consistentemente produzem sinais luminosos. Se forem necessárias sondas mais pequenas, usar fosmids (40-50 kb) ou mesmo os plasmídeos contendo inserções de 5-10 kb. Identificar BAC ou fosmid clones correspondentes a genes específicos usando Ensemble ou navegadores genoma UCSC. Prepare DNA BAC alta qualidade por precipitação repetido ou usar kits disponíveis no mercado. A menos que a preparação está contaminado com DNA genómico bacteriano, a sonda menos é necessário, por lâmina. Realize rotulagem em duas etapas: tradução nick introdução aminoallyl-dUTP e acoplamento químico de um corante reativo a amina. 1.1. Nick Translation Durante a tradução nick, DNase I é usado para criar quebras de-fita simples. DNA polimerase I alonga &#39;extremidades destes&#39; a 3 nicks &#39;, substituindo nucleotídeos existentes por novos, t<html> aqui &#39;traduzir&#39; o nick e proporcionando, assim, a oportunidade de incorporar nucleotídeos marcados. Aminoallyl-dUTP é escolhido por causa da incorporação eficiente pela polimerase I do DNA e do seu potencial para o acoplamento químico posterior para corantes reactivos com amina ou haptenos. É fundamental para alcançar o equilíbrio certo entre DNase I nicking e DNA polimerase I de tradução; muito DNase I resultará na digestão excessiva DNA dando baixa produtividade e tamanhos de fragmentos curtos, muito pouco não produzirá nicks suficientes para a polimerase para iniciar a tradução, dando grande tamanho do fragmento e má incorporação de aminoallyl-dUTP. O protocolo seguinte funciona bem, mas pode ser necessário para titular a ADNase I a partir de diferentes fabricantes ou de diferentes lotes. <ol><li> Defina-se etiquetagem de reacção em gelo e incubado durante 2 horas a 16 ° C. Isso deve produzir 0,5-1 mg DNA nick-traduzido e pode ser escalado para cima. Diluir 1:30 em ADNase I ADNase I tampão (isto é, 0,3 U / ul). </li></ol>1 &quot;&gt; <tbody><tr><td> Componente </td><td> Concentração de estoque </td><td> Volume ou quantidade </td></tr><tr><td> DNA BAC </td><td></td><td> 5-10 mg </td></tr><tr><td> Tampão NTB </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> TDT </td><td> 0,1 M </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> dNTP mix </td><td> 10x </td><td> 5 ul </td></tr><tr><td> Aminoallyl-dUTP </td><td> 0,5 mM </td><td> 6 mL </td></tr><tr><td> Polimerase I de ADN </td><td> 10 U / ul </td><td> 1 ul </td></tr><tr><td> ADNase I </td><td> 10 U / ul </td><td> 1 ul (de uma diluição de 1:30) </td></tr><tr><td> H2O </td><td></td><td> a 50 ul </td></tr></tbody></table><ol start="2"><li> Correr 1 uL num gel de agarose a 2% para verificar o tamanho dos fragmentos etiquetados. Enquanto você corre o gel, manter a reação no gelo. Sucesso nick translatiem resultará em um esfregaço com a maior parte dos fragmentos que funcionam entre 150 pb e 700 pb, com alguns fragmentos maiores em ~ 1 kb (passo crítico: veja resultados representativos). Se necessário, são adicionados mais 1 ul de uma diluição fresco 01:30 ADNase I e incubar a 16 ° C durante 15-30 min. O tempo de incubação pode variar de acordo com a quantidade e qualidade do DNA BAC. </li><li> Inativar ADNase I por aquecimento a 75 ° C durante 10 min. </li><li> ADN modificado com amina de limpeza utilizando um kit de purificação de PCR. Eluir em 100 ul de H2O </li><li> Etanol precipitado de ADN por adição de 10 ul de NaOAc 3 M (pH 5,2) e 275 ul de etanol. Adicione-se a -20 ° C durante pelo menos 1 hora ou durante a noite. Rotação à velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C. Lavar sedimento com 500 ul de etanol a 70% e deixar secar ao ar. Este passo remove os vestígios aminas que irão interferir com a reacção de marcação. Ressuspender o sedimento em 6 mL H 2 O por 1x reação inicial. </li><li> Use 1 ul para determinar a concentração do DNA amina modificadopor espectroscopia de UV microvolume. </li></ol> 1.2. O acoplamento do corante fluorescente A microscopia por fluorescência da sonda é conseguido através de acoplamento químico do corante. Alexa Fluor succinimidilo éster corantes reagir com as aminas de ADN modificado allyldUTP-amino para formar uma ligação covalente, produzindo, assim, as sondas marcadas directamente. Alexa Fluor 488, 555, 647 e os corantes tenham sido bem sucedida para este processo. <ol><li> Ajustar 4 ug de ADN modificado amino-alil até um volume de 5 ul, de calor a 95 ° C durante 5 min, encaixe fresco em gelo e adicionar 3 ml de 0,2 M NaHCO3. </li><li> Dissolve-se uma parte alíquota do corante reactivo de amina em 2 mL de DMSO anidro, à temperatura ambiente. Adicionar 8 mL de ADN modificado com NaHCO3, vortex, rotação do pulso e incubar à temperatura ambiente no escuro durante 1 hora. </li></ol> Nota: Os corantes reactivos de amina pode ser utilizada para rotular mais do que uma sonda com base no seguinte esquema. Uma vez que oomente 10-20 ng de sonda é usada por rotulagem slide, 1 mg dá sonda suficiente para 50-100 slides. Também é possível armazenar o DNA amina modificado para futuras reacções de etiquetagem, a -20 ° C. <table border="1"><tbody><tr><td> Quantidade de DNA </td><td> Volume de DNA </td><td> 0,2 M NaHCO3 </td><td> Volume de corante </td><td> Total </td><td> Suficiente para </td></tr><tr><td> 4 x 1 ug </td><td> 1,25 mL cada </td><td> 0,75 mL cada </td><td> 0,5 mL cada </td><td> 2,5 ul (1/4) </td><td> 50-100 lâminas cada </td></tr><tr><td> 3 x 1,35 ug </td><td> 1,67 mL cada </td><td> 1 ul de cada </td><td> 0,67 mL cada </td><td> 3,34 ul (1/3) </td><td> 65-130 slides cada </td></tr><tr><td> 2 x 2 ug </td><td> 2,5 mL cada </td><td> 1,5 mL cada </td><td> 1 ul de cada </td><td> 5 ul (1/2) </td><td> 100-200desliza cada </td></tr><tr><td> 1 x 4 ug </td><td> 5 ul </td><td> 3 ul </td><td> 2 ul </td><td> 10 ul (total) </td><td> 200-400 lâminas </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Adicionar 90 ul de H2O e purificar a sonda marcada usando um kit de purificação de PCR. Eluir em 100 ul 10 mMTris-Cl (pH 8,5). </li><li> Determinar a concentração de sonda e eficiência de marcação por espectroscopia de espectro completo microvolume (ver Figura 2), utilizando equações de Beer-Lambert (As instruções são dadas na folha de dados que acompanha as Alexa Fluor corantes reativos ou podem ser encontrados online). Sondas que contenham corantes 3-6 por 100 bp funcionar bem. Sondas com menores graus de incorporação pode dar sinais de FISH fracos. Alternativamente, executado 5 uL num gel de agarose a 2%, sem mancha do ADN e verificar a incorporação do corante fluorescente usando uma Phosphoimager. Adicione-mancha do gel com brometo de etídio ou DNA alternativas de coloração e comparar ADN marcado para o ADN total. </li></ol><pclass = &quot;jove_title&quot;&gt; 2. FISH DNA Através dos passos seguintes, as células de interesse são fixadas a lâminas e permeabilizadas. O ADN celular e as sondas são marcadas directamente, em seguida desnaturadas em conjunto sobre uma placa quente e hibridado durante a noite numa câmara humidificada à prova de luz. 2.1. Dia 1 <ol><li> Probe Precipitation Nota: sondas precipitado a algum momento durante o dia 1. Isto pode facilmente ser executada em paralelo com o tratamento das células e não tem de ser feita no início do dia. <ol><li> Misturar 10-20 ng de sonda marcada directamente, 6 ul 0 C t-1 DNA (6 mg), 1 ul de DNA de cadeia simples a partir de testículos de salmão (9,7 ug) e ajustar o volume para 100 ul com água. </li><li> Adicionar 10 ml 3 M NaOAc e 275 mL EtOH, e misturar em vortex. Precipitar durante pelo menos 1 hora a -20 ° C. </li><li> Girar em microcentrífuga a velocidade máxima durante 30 min a 4 ° C. Lave pellet com etanol 70% e girar novamente. Dry pellete ressuspender em 5 mL de formamida desionizada. Ressuspender em 30 min a 37 ° C enquanto se agita a 1.000 rpm (protegido da luz lugar folha sobre o Thermomixer). </li><li> Adicionam-se 5 pi de mistura de sulfato de dextrano e agitar por mais 10 min a 37 ° C novamente protegidas da luz. Pipeta cima e para baixo antes de pipetagem para lamela. Nota: Para pintura cromossômica combinado com sondas BAC, inteiros cromossomo sondas de pintura que são fornecidos em pronto para uso mix de hibridização são uma opção conveniente. Ressuspender o precipitado BAC sonda (com C 0 t1 DNA e DNA de cadeia simples de testículos de salmão) em 10 mL mix pintura cromossomo pipetando cima e para baixo. Incubar a 37 ° C enquanto agitando a 300-500 rpm durante 10 min. Use 10 ml de tinta cromossomo / BAC sonda mistura por ponto. </li></ol></li><li> Colocar células para Slides Nota: As células propensão para aderir a lâminas varia grandemente com o tipo de célula. Para cada tipo de célula, determinar oóptima o tempo de estabilização e a densidade celular empiricamente. Para obter resultados consistentes, as células devem estar numa única suspensão de células. Para facilitar o uso do círculo da área das células será manchado com uma caneta hidrófobo, embora, para as células em suspensão em PBS, isto não é estritamente necessário. Uma barreira hidrofóbica evita que a suspensão de espalhar sobre a lâmina, mantém-se a três amostras por lâmina bem separadas e permite a utilização de volumes muito pequenos de solução de anticorpo em imuno-FISH. Além disso, a área de mancha pode ser mantido a um mínimo, se o número de células são reduzidas. </li><li> Células de fígado fetal de rato <ol><li> Colete cada E13.5 rato fígado fetal em cerca de 1,5 ml de PBS e ressuspender pipetando cima e para baixo. Girar em microcentrífuga a 3.000 rpm por 2 min. Repita lava três vezes. Nos últimos lavagem, as células de tensão através de um peneiro 70. Ressuspender as células a partir de um fígado em 160 ul de PBS e utilizar 50 μ por mancha. Deixe as células que se contentar com 2 min à temperatura ambiente. </li></ol></li><li> Mouse ES Células 1. Células-tronco embrionárias de rato não vai ficar fácil para o slide. Em um slide, círculo a área das células será manchado com uma caneta hidrofóbica. Prepara-se uma suspensão de 20.000-50.000 células por 80-100 uL em meio de cultura normal, pipeta em círculo e deixar a aderir durante cerca de 3 horas numa incubadora humidificada Nota:. Alternativamente, as células ES podem ser cultivadas em lâminas, mas em seguida, formarão colônias que podem dificultar a imagem automatizada. </li><li> As células fixas 1. Algumas experiências requerem a utilização de células fixas, que não se ligam às corrediças por si mesmos. Fiação suave a 300 rpm durante 3 min utilizando um citocentrífuga preserva a estrutura tridimensional das células e assegura que as células não cair. </li></ol><table border="1"><tbody><tr><td> Tipo de célula </td><td> Suspensão em </td><td> Tempo de estabilização </td><td> Comentar </td></tr><tr><td> Mousefígado fetal </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> No banco </td></tr><tr><td> Rato ES </td><td> DMEM com suplementos </td><td> 4 hr </td><td> 37 ° C em incubadora humidificada </td></tr><tr><td> Linfócitos mouse </td><td> PBS </td><td> 2 min </td><td> No banco </td></tr><tr><td> Rato P20 células germinativas </td><td> Fix em solução </td><td> Cytospin </td><td> No banco </td></tr></tbody></table><ol start="3"><li> Para consertar as células, deslize suavemente submergir em 4% PFA (ATENÇÃO: realizar em capela) por 10 min. Corrigir as células com o slide apartamento em uma bandeja para melhor retenção de células (por exemplo, 50 ml de 4% PFA na tampa de uma caixa de ponta) Nota:. Esta etapa não se aplica a células fixadas antes de apego aos slides. </li></ol> Para todas as etapas subseqüentes, use 50 ml ou 100 ml frascos Coplin. Tome cuidado para não raspar as células fora quando se deslocam lâminas entre frascos. <ol start="4"><li> Quench em 0,1 M de Tris-Cl, pH 7,4, durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Permeabilizar células em 0,1% saponin/0.1% de Triton X-100 em PBS durante 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Lavar duas vezes em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Incubar durante pelo menos 20 min em 20% de glicerol / PBS a RT Nota:. Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas em glicerol a 50% / PBS a -20 ° C durante pelo menos várias semanas. Tem sido observado que o armazenamento de pelo menos um dia resulta em um aumento na força de sinal 9. Recalibrar em temperatura ambiente de 20% de glicerol / PBS antes de prosseguir Nota:. Este é um ponto conveniente para começar a precipitar as sondas (ver 2.1.1). </li><li> 3x congelamento / descongelamento em azoto líquido. Mergulhe uma lâmina de cada vez em nitrogênio líquido usando um pequeno Dewar. Retirar depois de alguns segundos e um som de estalo característico, e coloque sobre toalha de papel para degelo. Aguarde glicerol congelado opaco para desaparecer em seguida, congelar novamente. Até 15 lâminas pode ser feito comodamente em rotação por três ciclos de congelamento / descongelamento. </li><li> Wcinza duas vezes em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Incubar em HCI 0,1 M durante 30 min a RT. </li><li> Lavar com PBS durante 5 min à TA. </li><li> Permeabilizar em 0,5% de Triton X-100/PBS saponin/0.5% durante 30 min à TA. </li><li> Lavar duas vezes em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Equilibrar em 50% formamide/2x SSC durante pelo menos 10 min à temperatura ambiente. </li><li> Pipeta sonda em uma lamela. Retirar a lâmina do frasco e secar o excesso de líquido ao redor do local da célula (s) com uma toalha de papel. Como a seca formamida rapidamente, tome cuidado para não secar células. Para slides com dois ou três pontos de células, aplicar 10 ml de sonda por ponto para um 22 x 50 mm lamela correspondente a manchar local no slide. Inverter lamela para deslizar sobre ponto (s). Selar com cimento de borracha e permitir que esta seque completamente. Proteger da luz em todas as fases subseqüentes. </li><li> Lâminas de calor a 78 ° C por 2 min, precisamente em um prato quente (por exemplo, um bloco de aquecimento invertido, passo fundamental: ver Discussão). Coloque uma tampa (caixa de papelão ou sim<html> Ilar) sobre a chapa quente para proteger da luz durante a desnaturação. </li><li> Incubar durante a noite a 37 ° C numa câmara humidificada à prova de luz. Para umedecer, coloque toalhas de papel em uma caixa à prova de luz e umedecer com água. </li></ol> 2.2 Dia 2 <ol><li> Prepare Coplin frascos com soluções na temperatura certa para as etapas de lavagem subsequentes. Proteger as lâminas da luz tanto quanto possível em todas as etapas subsequentes. Um café pode faz uma boa cobertura à prova de luz para Coplin frascos. </li><li> Peel off cimento de borracha e lugar de slides em 2x SSC até lamelas soltar e escorregar. </li><li> Lave com 50% formamide/2x SSC durante 15 min a 45 ° C. Coloque a tampa em banho-maria para proteger da luz. </li><li> Lavar em 0,2 x SSC durante 15 min a 63 ° C. </li><li> Lavar 2x em SSC durante 5 min a 45 ° C. </li><li> Lavar 2x em SSC durante 5 min à TA. </li><li> Lavar com PBS durante 5 min à TA. </li><li> Mancha com DAPI (5 ug / mL em 2x SSC) durante 2 minutos num frasco Coplin, à TA. </li></ol>conteúdo &quot;&gt; Nota: DAPI solução pode ser armazenada a 4 ° C no escuro, durante 2 meses. <ol start="9"><li> Destain em PBS durante 5 min à TA. </li><li> Para montar a lamela, pipeta meio de montagem sobre uma lamela. Usar 10 ul por ponto de células, utilizando 22 milímetros x 22 milímetros lamelas para um local, e 22 mm x 50 mm para lamelas 2-3 manchas. Seque PBS ao redor do local da célula, tanto quanto possível, mas tome cuidado para não secar as células. Inverter lamela em slide, e selar com verniz. </li></ol>

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</ol>

A produção deste artigo foi parcialmente financiado pela Carl Zeiss e MetaSystems.

FISH DNA 3D tornou-se uma ferramenta amplamente reconhecida para analisar arranjos espaciais no núcleo. Enquanto FISH fornece resultados visuais e direta, como acontece com todas as técnicas, é preciso estar ciente de suas limitações. PEIXES ADN enfrenta o problema inerente que os tratamentos relativamente duras são necessárias para tornar acessível a cromatina sondas FISH que finalmente interrompe-a própria estrutura nuclear coisa que está a ser analisada. Diversas estratégias têm sido perseguidos de conciliar a acessibilidade ea preservação estrutura. No protocolo aqui descrito, o ADN cromossómico é tornada acessível por congelamento-descongelamento a permeabilização das células e desnaturação pelo calor antes da hibridação da sonda. Solovei, et ai., (2002) analisaram as alterações estruturais após tratamento semelhante e verificou que a deslocação média de domínios de cromatina foi de 300 nm, o que limita a resolução da análise estrutural de cerca de 1 Mb regiões no genoma 8. Embora isso não seja alta resolução, eleé uma escala razoável para analisar a posição nuclear. Uma consideração mais prático para análise FISH é que a aquisição de imagem e as medições de distâncias nucleares são processos demorados que limitam o número de núcleos que podem ser analisados. A fim de estudar os eventos raros que visam fazer imagens de alta taxa de transferência automatizado. Então, com os controlos apropriados no lugar, um número suficiente pode ser comparado para permitir a análise estatística robusta das relações espaciais. Rotineiramente analisar 600 núcleos por ponto de dados para o qual vamos determinar as coordenadas 3D de todos os sinais de peixe dentro do volume nuclear. Esses dados exigem muito pouco espaço de armazenamento e permitir a análise das distâncias inter e intra-alélicas, ou posições radiais em qualquer momento posterior. Além disso, o processamento automatizado pode ser feito de uma maneira cega investigador que reduz grandemente a probabilidade de polarização inconsciente. Para habilitar este tipo de analys de alto rendimentoé, nosso objetivo foi o de estabelecer uma maneira rápida e eficiente de realizar FISH DNA. Encontramos o protocolo descrito aqui para ser extremamente robusto, de forma consistente a produção de sinais luminosos, com baixo fundo. Ela trabalhou para todos os tipos de células que tentaram desde que adaptado a etapa de fixação das células para o slide. Além disso, com exceção de uma, todas as BACs que usamos poderia ser transformado em sondas brilhantes. Temos também detectado com êxito um certo número de proteínas nucleares por coloração de anticorpos após ADN FISH. Enquanto para algumas proteínas Isso funciona bem, recomendamos comparação com a imunofluorescência tradicional (IF) para garantir a consistência do padrão de coloração de anticorpos entre IF e DNA imuno FISH (compare 11). Geralmente, verificou-se que as sondas marcadas com cores diferentes produziu os mesmos resultados. No entanto, os seguintes aspectos devem ser considerados ao escolher a tinta rotulagem. Primeiro, a cor do fluoróforo deve ser bem detectável pelo u microscópiosed. Em segundo lugar, o comprimento de onda da luz emitida pelos fluoroforos deve ser suficientemente diferente para evitar sangramento através do canal para o outro. Isto irá depender dos filtros no microscópio. E em terceiro lugar, pelo menos em nossas mãos, algumas cores produzir sinais luminosos de forma mais consistente do que outros. Nós sempre usaram DAPI (azul) como um contrastante que faz Alexa Fluor 555 (vermelho), 488 (verde) e 647 (muito vermelho) boas opções para marcação de sondas. Com o nosso sistema de imagens, encontramos Alexa Fluor 555 (vermelho) para produzir os sinais mais brilhantes, seguidos por Alexa Fluor 488 (verde). Alexa Fluor 647 (vermelho longínquo) tem a desvantagem de que não pode ser detectada pelo olho humano e, portanto, não há sinais pode ser visto quando se olha através do microscópio. Assim, se fazendo FISH duas cores, recomendamos a combinação de corantes vermelhos e verdes. Podem surgir dois problemas principais: células lavando os slides e sinais fracos. Como as células também aderir ao slide é entr extremamente variáveltipos de células een, eo melhor protocolo para resolver / seed as células precisa ser determinado. Nós utilizamos com sucesso, quer carregados positivamente ou poli-L-lisina lâminas revestidas (comprado pronto a utilizar), mas foram encontradas células geralmente adere melhor à poli-L-lisina lâminas revestidas. Descobrimos também que, quando as células eram muito densas áreas inteiras seria descascar como uma folha, enquanto imagem automatizada foi prejudicada se as células eram muito escassos. Assim, se a amostra não for muito precioso, diferentes números de células deveriam ser semeadas para determinar a densidade ideal. Se as células são particularmente propensas a lavar, uma caneta de barreira hidrofóbica pode ser usado, e os passos de peixe pode ser realizada por pipetagem cuidadosa soluções directamente sobre a lâmina. Pipetagem também reduz drasticamente os volumes de reagentes necessários, mas leva muito mais tempo ao fazer vários slides. Sinais fracos são geralmente devido a sondas pobres, e vale a pena investir tempo em fazer bons. Limpo DNA CCB deve ser usard como material de partida, que pode ser obtido por precipitação repetida ou kits disponíveis comercialmente. A contaminação com ADN genómico bacteriano afecta negativamente a qualidade da sonda e tratamento cuidadoso durante a lise celular e de filtragem do lisado de células é necessária para mantê-lo a um nível mínimo. É, no entanto, não é necessário usar um passo de digestão com exonuclease de ADN linear, como esta reduz grandemente o rendimento. Rotulagem eficiente da sonda é crucial. O controle de qualidade mais importante para esta etapa é verificar o tamanho do fragmento após a tradução nick (ver resultados representativos). A &#39;boa&#39; smear quase sempre resultam em uma sonda de cor viva. No entanto, verificou-se que, ocasionalmente, uma certa BAC não pode ser transformado em um bom sonda, e uma TAS diferente deve ser escolhido. Outro passo importante é a desnaturação pelo calor. Se a temperatura for demasiado baixa, o ADN será apenas parcialmente desnaturada e hibridação da sonda será prejudicada. Se a temperatura for demasiado elevada, a estrutura nuclear wivai ser perturbado mais do que o necessário. Nas nossas mãos, 78 ° C sobre um bloco quente invertida é o compromisso ideal, mas isto pode variar, dependendo do respectivo bloco quente utilizado. Temos tido bons resultados usando meio de montagem Vectashield, mas descobriu que SlowFade Gold tem menos fundo e preserva o sinal fluorescente por mais tempo. Nós não recomendamos o uso de hard-set meio de montagem como descobrimos isso afetar a estrutura 3D e formar bolhas de ar ao longo do tempo. Em conclusão, brilhantemente fluorescentes directamente sondas marcadas em conjunto com o protocolo de ADN FISH aqui descrito oferecem uma solução eficaz para a análise robusta e rápida da arquitectura nuclear, que é aplicável a uma ampla variedade de questões biológicas.

DNA de hibridização in situ de fluorescência (FISH ADN) permite a visualização tridimensional de loci de genes individuais, domínios subcromossómico e cromossomas inteiros, mesmo durante todas as fases do ciclo celular. PEIXES 2D é utilizado para estudos FISH metafase enquanto 3D tem sido extensivamente utilizado para sondar a relação espacial entre a organização do genoma e a sua função durante a interfase (1,2 e referências citadas). Historicamente, os estudos de co-associação foram realizadas por investigar dezenas a centenas de loci individuais por FISH. Mais recentemente poderoso de alto rendimento com base em técnicas tais como 3C 4C e Hi-C foram desenvolvidos três, permitindo que a investigação das molecular conversa cruzada entre os muitos milhares de diferentes loci. Embora as técnicas baseadas em 3C e FISH DNA podem ser métodos complementares, que não necessariamente responder as mesmas perguntas. Métodos baseados em 3C proporcionar uma leitura de conjunto de populações de células misturadas, resultando numa probabildade de co-associações. Por outro lado, enquanto a baixa no rendimento, técnicas de base de peixe oferecem a possibilidade de analisar arranjos espaciais de loci ou cromossomos nas células individuais de acordo com as suas fases do ciclo de desenvolvimento ou celular. Assim, FISH continuará a ser uma importante ferramenta para sondar relações estrutura-função nucleares. Há duas considerações importantes na realização de experiências bem-sucedidas Fish 3D. Estes são: 1. obtenção de sondas marcadas optimamente e 2. escolha de tratamentos celulares, incluindo fixação, pré-e pós-passos de hibridação, para preservar a morfologia nuclear, tanto quanto possível, ao mesmo tempo que o DNA suficientemente acessível para hibridação da sonda. Eficiente rotulagem sonda é criticamente importante para os peixes. Tradicionalmente, a nick-translation foi usado para introduzir ou hapteno ou nucleótidos fluoróforos 4. Da mesma forma, kits nick-tradução comerciais estão disponíveis para hapten direta ou incorporação fluorophore, but também para duas etapas de marcação utilizando nucleótidos aminoallyl e corantes reactivos com amina. Este último torna corante incorporação mais eficiente, dando uma molécula de ADN-polimerase menos volumoso para trabalhar. Mais recentemente, a kits para a rotulagem não enzimática do DNA têm sido desenvolvidos, que exploram ligação coordenativa de platina para os ácidos nucleicos. Sondas de peixe pode até ser comprado já com o 5. Enquanto kits e sondas fabricadas comercialmente sem dúvida dar a facilidade de uso, eles são consideravelmente mais caro do que comprar os componentes individuais e produzir sondas em casa. Nós otimizamos um nick protocolo tradução de baixo custo, a fim de marcar diretamente diversos sondas BAC em várias cores. Nós descobrimos que a obtenção de ADN BAC de elevada pureza é importante e resulta num requisito de que apenas 10-20 ng de sonda por lâmina FISH, ante de 10 - 20 vezes mais quando o ADN molde impuro é usado, resultando num maior custo e tempo- poupança. A utilização de amino-allyldUTP permite rotulagem flexívelsondas com amina disponíveis corantes reactivos (por exemplo, Alexa Fluor ou CY-corantes) ou haptenos (por exemplo, biotina, digoxigenina). Sondas de hapteno-marcadas são detectadas por anticorpos fluoróforos ou estreptavidina para amplificar o sinal e visualizar. Sondas marcadas directamente brilhantes mostram geralmente menos a coloração de fundo e evitar o excesso de amplificação de sinais, daí resultando uma representação mais precisa da localização nuclear e morfologia lócus. Existem várias técnicas diferentes peixes que usam diferentes fixadores, pré-tratamentos e lavagens pós-hibridação, mas estes geralmente se enquadram nas seguintes categorias: fixação de glutaraldeído com NaOH desnaturação, fixação em formol com HCl desnaturação e fixação em formol com desnaturação 6-9 . Cada um destes tem vantagens e desvantagens. Glutaraldeído resultados de fixação em bom estado de conservação estrutural nuclear, mas necessita de tratamento com agentes redutores para minimizara autofluorescência resultante, tratamento com NaOH e deve ser cuidadosamente controlado para equilibrar a desnaturação do ADN suficiente e dano potencial a estrutura nuclear 6. Fixação em formol é menos forte, dando uma maior probabilidade de perturbações da arquitetura nuclear, mas também geralmente com sinais mais fortes e mais confiáveis ​​e menores autofluorescência 9. HCl tratamento depurinates DNA e tiras fora proteínas, proporcionando um bom acesso ao DNA para as sondas, mas também pode apresentar quebras de DNA. Aquecimento separa fisicamente as duas fitas de DNA, resultando em boa hibridização alvo e sinais fortes, mas pode causar alguma perturbação da estrutura nuclear 8. O grau em que cada uma destas técnicas afecta epitopos da proteína varia amplamente 6,9, resultando na necessidade de determinar experimentalmente para cada proteína o protocolo ideal para usar em experiências de imuno-peixe. Embora não haja um &#39;perfeito&#39; DNA FISH tehaver descrição prévia, todos eles podem ser úteis se forem bem controlados. O nosso objectivo foi o de optimizar um protocolo para robusto e reprodutível PEIXES DNA para investigar o posicionamento espacial dos múltiplos loci em uma variedade de tipos de células 10, incidindo sobre o método de aquecimento para a maioria dos sinais fiáveis. Com esta e a utilização de um sistema de imagem automatizado que visa aumentar a taxa de transferência para a análise de arranjos nucleares de célula única.

<table><tbody><tr><td colspan="4">Reagent/Material</td></tr><tr><td>NTB tampão</td><td></td><td></td><td>Etapa 1.1.1 (consulte a lista de 'tampões de FISH e misturas de reação' abaixo)</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Invitrogen</td><td>D-1532</td><td>Etapa 1.1.1</td></tr><tr><td>dNTPs</td><td>Bioline</td><td>BIO-39025</td><td>Etapa 1.1.1 (consulte a lista de 'tampões de FISH e misturas de reação' abaixo)</td></tr><tr><td>Aminoalil-dUTP</td><td>Ambion</td><td>AM8439</td><td>Etapa 1.1.1</td></tr><tr><td>DNA Polimerase I</td><td>New England Biolabs</td><td>M02095</td><td>Etapa 1.1.1</td></tr><tr><td>DNase I livre de RNase recombinante</td><td>Roche</td><td>4716728001</td><td>Etapa 1.1.1</td></tr><tr><td>Kit de purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td>Etapa 1.1.4, 1.2.3</td></tr><tr><td>NaOAc</td><td>VWR</td><td>27653</td><td>Etapa 1.1.5, Etapa 2.1.1.2</td></tr><tr><td>NaHCO3</td><td>Sigma</td><td>S5761</td><td>Passo 1.2.1</td></tr><tr><td>Decapacks reativos da tintura do fluor de Alexa para aplicações de Microarray</td><td>Invitrogen (pontas de prova moleculars)</td> <td>A32750, A32756, A32757</td><td>Etapa 1.2.2</td></tr><tr><td>DMSO (anidro) </td><td>Sigma Aldrich</td><td>276855</td><td>Etapa 1.2.2</td></tr><tr>Tecnologias seguras <td>S33102</td> da <td>vida da</td><td>mancha do gel do ADN de SYBR</td><td>Etapa 1.2.4 (alternativa ao brometo de etídio)</td></tr> <tr><td>Cot-1 ADN</td><td>Invitrogen</td><td>18440-016</td><td>Etapa 2.1.1.1 (O DNA do Cot-1 pode ser feito em casa em grandes quantidades e funciona tão bem)</td></tr><tr><td>DNA de fita simples de testículos de salmão </td><td>Sigma</td><td>D7656</td><td>Etapa 2.1.1.1</td></tr><tr><td>Formamida deionizada</td><td>Sigma</td><td>F-9037</td><td>Etapa 2.1.1.3 (Perigo para a saúde)</td></tr><tr><td>Sulfato de dextrana</td><td>Sigma Life Sciences</td><td>D8906</td><td>Etapa 2.1.1.4 (Consulte a lista de 'tampões de FISH e misturas de reação' abaixo)</td></tr><tr><td>Sondas de pintura XMP</td><td>MetaSystems</td><td>000000-0528-837</td><td>Etapa 2.1.1.4 </td></tr><tr><td>Lâminas revestidas de poli-L-lisina</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P0425</td><td>Etapa 2.1.2</td></tr><tr><td>Caneta hidrofóbica (ImmEdge)</td> <td>Vector Laboratories</td><td>H-4000</td><td>Etapa 2.1.2</td></tr><tr><td>70 &mu; m peneira (Mouse f&#8211; apenas células hepáticas tal)</td> <td>BD Falcon</td><td>352350</td><td>Etapa 2.1.2.1</td></tr><tr><td>PFA</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P6148</td><td>Etapa 2.1.3 (Inflamável, corrosivo, toxicidade aguda, perigo para a saúde) (Consulte a lista de 'tampões de FISH e misturas de reação' abaixo)</td></tr> <tr><td>Tris-Cl</td><td></td><td></td><td>Etapa 2.1.3 (consulte a lista de 'tampões de FISH e misturas de reação' abaixo)</td></tr> <tr><td>Saponina da casca de Quillaja</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47036</td><td>Etapa 2.1.4, 2.1.11 (Toxicidade aguda), (Consulte a lista de 'tampões FISH e misturas de reação' abaixo)</td></tr><tr><td>Triton X-100</td><td>Sigma</td><td>T9284</td><td>Etapa 2.1.4, 2.1.11 (Toxicidade aguda, perigosa para o meio ambiente)</td></tr><tr><td>10 x PBS</td><td>Life Technologies (GIBCO)</td><td>70011-036</td><td>Etapa 2.1.4, 2.1.5, 2.1.6, 2.1.8, 2.1.10, 2.1.11, 2.1.12, 2.2.7, 2.2.9, </td></tr><tr><td>Glicerol</td><td>Fisher Scientific</td><td>G/0650</td><td>Etapa 2.1.6</td></tr><tr><td>HCl</td><td>VWR</td><td>20252</td><td>Passo 2.1.9 (Toxicidade aguda, corrosiva)</td></tr><tr><td>Formamida</td><td>Sigma Aldrich</td><td>47670</td><td>Passo 2.1.14, 2.2.3 (Perigo para a saúde)</td></tr><tr><td>SSC</td><td></td><td></td><td>Passo 2.1.14, 2.2.2-2.2.6, 2.2.8 (Ver lista de "tampões de FISH e misturas de reação" abaixo)</td></tr><tr><td>Lamínulas 22 x 22</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022022A1</td><td>Passo 2.1.15</td></tr><tr><td>Lamínulas 22 x 50</td><td>Menzel-Glaser</td><td>BB022050A1</td><td>Etapa 2.1.15</td></tr><tr><td>Cimento de borracha</td><td>Marabu</td><td>2901 (10 000)</td><td>Etapa 2.1.15 (Inflamável, perigoso para a saúde, perigo para o meio ambiente)</td></tr><tr><td>DAPI</td><td>Invitrogen Molecular Probes</td><td>D3571</td><td>Etapa 2.2.8 (Perigo para a saúde)</td></tr><tr><td>SlowFade Gold</td><td>Invitrogen</td><td>S36936</td><td>Etapa 2.2.10 (meio de montagem)</td></tr><tr><td>Esmalte transparente</td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td>Passo 2.2.10</td></tr><tr><td colspan="4">Equipment</td></tr><tr><td>Nanodrop 2000</td><td>Thermo Scientific</td><td></td><td>Step 1.1.6, 1.2.4 (espectroscopia de microvolume)</td></tr><tr><td>Typhoon FLA 7000 phosphoimager</td><td>GE Life Sciences</td><td></td><td>Step 1.2.4</td></tr><tr><td>Frascos de Coplin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S6016 (6EA)/S5516 (6EA)</td><td>Step 2.1.3 em diante</td></tr><tr><td>Dewar de nitrogênio líquido </td><td>Qualquer fornecedor</td><td></td><td>Step 2.1.7</td></tr><tr><td>Base com tampa preta (câmara à prova de luz)</td><td>Simport</td><td>M920-2</td><td>Passo 2.1.17</td></tr><tr><td>Thermomixer comfort</td><td>Eppendorf</td><td>5355 000.011</td><td>Passo 2.2.3 (ou use shaker em um 37 &deg; Sala C)</td></tr><tr><td colspan="4">Imagem e processamento de imagem</td></tr><tr><td>Metafer - Plataforma de Automação de Imagens</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>software de imagem automatizada</td></tr><tr><td>MetaCyte - Análise automatizada de FISH Interfase</td><td>MetaSystems</td><td></td><td>Software de imagem automatizada</td></tr><tr><td>Axio Imager Z2 microscópio de</td> epifluorescência <td>Zeiss</td><td></td> vertical <td>usado com imagem automatizada</td></tr><tr><td>Microscópio confocal IX81 (FV1000)</td><td>Microscópio confocal</td> <td>Olympus</td><td></td></tr><tr><td>Bitplane, versão 7.3</td><td>Software de análise de imagem e modelação 3D</td><td>Imaris</td><td></td></tr><tr><td>Volume científico Imaging, versão 4.1</td><td>Software de análise e deconvolução de imagem</td> <td>Huygens</td><td></td><</tr><tr>td colspan="4"> FISH buffers e misturas de reação <table border="1"> <tbody> <tr> <td>Name</td> <td>Composition</td> <td>Comments</td> </tr> <tr> <td> 10 x tampão NTB</td> <td>0,5 M Tris-HCl, pH 7,5</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,05 M MgCl2</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mg/ml BSA</td> <td></td> </tr> <tr> <td>dNTP Mix</td> <td>0.5 mM dGTP</td> <td>Store 50 &mu; l alíquotas em -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mM dATP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,5 mM dCTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td></td> <td>0,125 mM dTTP</td> <td></td> </tr> <tr> <td>4 % PFA</td> <td>Pesar 4 g/100 ml de PFA em PBS e aquecer a 62 &graus. Ajustar o pH com NaOH a 7,0 para dissolver o PFA restante.</td> <td>Conservar alíquotas de 50 ml a -20 &graus; C, não volte a congelar</td> </tr> <tr> <td>2 % solução de saponina</td> <td>Dissolver 2 g de saponina por 100 ml de PBS por agitação prolongada. Dissolva e ajuste o pH para 7,0 com NaOH. Leve a 1 l com ddH20 e autoclave. </td> <td>Armazene alíquotas de 5 ml a -20 &deg; C</td> </tr> <tr> <td>20 x SSC</td> <td>Pesar 175,3 g de NaCl e 88,2 g de citrato de sódio e adicionar a 80 ml de ddH20. Dissolva e ajuste o pH para 7,0 com NaOH. Levar a 1 l com ddH20 e autoclave.</td> <td></td> </tr> <tr> <td>Mistura de sulfato de dextrano</td> <td>20 % de sulfato de dextrano em 2 x tampão SSC; Solução de vórtice e misture em um rocker durante a noite.</td> <td>Store 500 &mu; l alíquotas em -20 &deg; C</td> </tr> </tbody> </table> </td></tr></tbody></table>

robust fish dna 3d utilizando sondas diretamente rotuladas

Robust 3D DNA FISH Using Directly Labeled Probes

PEIXES 3D DNA tornou-se uma ferramenta importante para a análise de organização tridimensional do núcleo, e várias variações da técnica têm sido publicados. Neste artigo descrevemos um protocolo que foi otimizado para robustez, reprodutibilidade e facilidade de uso. Brilhantemente fluorescentes directamente as sondas marcadas são gerados por nick-translation com amino-allyldUTP seguido por acoplamento químico do corante. 3D ADN FISH é realizada utilizando um passo de congelamento-descongelamento para permeabilização celular e um passo de aquecimento para a desnaturação simultânea de sonda e o DNA nuclear. O protocolo é aplicável a uma variedade de tipos de células e uma variedade de sondas (BACs, plasmídeos, fosmids ou tintas cromossoma inteiro) e permite a imagiologia automatizado de alto débito. Com este método rotineiramente investigar a localização nuclear de até três regiões cromossómicas.

O protocolo aqui descrito (Figura 1 para uma descrição) foi usado para um grande efeito de combinar o ADN FISH com captura de imagem de alto rendimento para a análise da organização genómica. A geração de sondas de boa qualidade é fundamental para o sucesso (ver Discussão). Figura 2 demonstra duas importantes controles de qualidade para sondas de peixe. Depois de nick-translation, uma mancha de DNA deve ser visível com a maior parte dos fragmentos de funcionamento, entre 150 e 700 pb (Figura 2A). Após o acoplamento químico, a incorporação do corante fluorescente pode ser medida por meio de análise espectroscópica da sonda (Figura 2B). Ao utilizar boas sondas, seguindo o protocolo FISH DNA geralmente resulta em claros sinais de FISH de DNA em baixo de fundo. Temos utilizado com sucesso este protocolo em uma variedade de diferentes tipos de células, e tanto com microscópios de epi-fluorescência e confocal. Imagem automatizada usando um epi-fluorescence microscópio de sinais de FISH requer cortantes, facilmente identificáveis ​​com pouco fundo (Figura 3), ao passo que a microscopia confocal requer sinais mais intensos. Figura 4A mostra imagens representativas transformados. Coordenadas nucleares de sinais de peixe pode ser obtida, e as relações espaciais de regiões genômicas pode ser computada (para um exemplo veja a Figura 4B). Temos também utilizado pilhas de imagens obtidas por microscopia confocal para modelagem 3D de sinais de FISH nos seus territórios de cromossomos (Filme 1). <img alt="Figura 1" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig1.jpg" /> Figura 1. Fluxo de Trabalho para a rotulagem sonda e FISH DNA. Preparação Probe é mostrado em azul. Procedimento FISH DNA é mostrado em preto com detalhes fornecidos em verde. <p class="jove_content" fo:keep-together.within-page= &quot;Always&quot;&gt; <img alt="Figura 2" fo:content-width="6in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig2.jpg" /> Figura 2. Marcação de sondas por nick-translation e controle de sondas marcadas qualidade. A) Gel mostrando esfregaço ideal antes de aquecer para inativar DNase I (pista 1: escada de DNA, a pista 2 e 3: BACs após nick-translation). Fragmentos deve estar no intervalo de 150-700 pb. Uma mancha adicional no ~ 1 kb é freqüentemente observada com reações nick-tradução de sucesso. B) análise espectro Microvolume de sondas marcadas. Um pico de ADN, a 260 nm, é observada com um segundo pico, que corresponde ao comprimento de onda de absorvância do fluoroforo a sonda é marcada com: Alexa Fluor 488: 495 nm, Alexa Fluor 555: 555 nm, Alexa Fluor 647: 650 nm. São mostrados três sondas com boa incorporação: os picos de absorção fluoróforo são uma altura similar ou superior aos picos de DNA. Alexa Fluor 647 tipicamente tem maior absorvânciade Alexa Fluor 555, que por sua vez tem uma maior absorvência de Alexa Fluor 488. Alexa Fluor 488 também absorve um pouco de luz a 260 nm, portanto, o primeiro pico para esta sonda é maior do que os outros. Sondas com má incorporação mostra fluoróforo absorvância 2-3-vezes inferior do que a absorção de DNA. Sondas com mais do que um pico maior fluoróforo 2 vezes do que o ADN de pico normalmente contêm corante não conjugada que podem causar fundo no peixe. <img alt="Figura 3" fo:content-width="5in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig3.jpg" /> Figura 3. Tela do software de imagem 3D peixe MetaCyte mostrando uma experiência típica FISH três cores. A tela é dividida em várias partes. A) imagem de campo de visão (FOV) Raw capturado pelo Metafer / MetaCyte sistema de digitalização de slides. B) Gallery de imagens de núcleos identificadas que têm unprocessamento de imagem dergone e segmentação de sinais de peixe. Vários tipos de dados podem ser exibidos em cada galeria de imagens. Neste exemplo, o número de células é mostrada superior esquerdo com vários interallelic e interlocus distâncias topo direita e para ambos os lados por baixo de cada imagem. C) Razão corrediça com o número de núcleos identificados na análise. D) Representação da corrediça com a área digitalizado pela sistema. E) O alargamento da área digitalizada. Manchas brancas representam os núcleos identificados por FOV. F) dados processados. Neste exemplo são apresentados interallelic distâncias máximas entre os sinais verdes (topo) e vermelho (inferior). Os dados mostrados são de rato P20 células germinativas. As sondas estão localizados em cromossomos diferentes, cobrindo HBB e genes HBA e um conjunto de histonas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver a figura maior</a> . <p class="jove_content" fo:keep-together. Dentro-page = &quot;always&quot;&gt; <img alt="Figura 4" fo:content-width="4in" fo:src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4highres.jpg" src="/files/ftp_upload/50587/50587fig4.jpg" /> Figura 4. Exemplos de imagens processadas e os dados posicionais derivados. A imagens) processados ​​para E13.5 rato as células do fígado fetal corados com sondas BAC localizados em cromossomos diferentes que cobrem Myc e KCNQ1 genes (chamados myc e KvDMR, de cor verde e vermelho, respectivamente). B) Tukey parcelas box-whisker representando a distância interallelic distribuição para os mesmos loci em núcleos 600. Interallelic distância é representada como uma fracção do raio do núcleo &#39;(distância / do raio) para ter em conta as variações no tamanho nuclear. Núcleos de células ES têm um raio de cerca de 5 micrómetros. Sondas vermelhas são significativamente mais juntos do que as sondas verdes (***: p &lt;0,01, teste t não pareado). Dados a partir de 10. Filme 1. Modelagem 3D de dois loci dentro de seu cromossomo territory. Duas sondas BAC localizados perto de cada extremidade do cromossomo 7 do mouse foram rotulados (vermelho e vermelho distante, (branco pseudo-colorido)) e hibridizado com uma tinta cromossomo inteiro (verde) de células-tronco embrionárias de rato. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/50587/50587movie1.mov" target="_blank">Clique aqui para ver filme</a> .

Nós descrevemos um protocolo robusto e versátil para a análise de arquitetura nuclear por FISH DNA 3D usando sondas fluorescentes diretamente marcadas.

Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

3D DNA FISH has become a major tool for  analyzing three-dimensional organization of the nucleus, and several variations  of the technique have been ...

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a organização espacial de locos genômicos específicos em células individuais de maneira robusta. Isso é alcançado primeiramente gerando sondas marcadas com fluorescência para, em última instância, ligar-se e destacar a região genômica de interesse. Os próximos passos consistem em aderir, fixar e permeabilizar as células de interesse em uma lâmina, a fim de permitir o acesso das sondas.Em seguida, realiza-se uma desnaturação térmica simultânea da sonda e do DNA celular, seguida por etapas de hibridização da sonda durante a noite e lavagens para remover a sonda ligada de forma não específica e contraste com dpi. Para visualizar o núcleo celular, os resultados obtidos com microscopia de fluorescência revelarão, em última instância, a posição nuclear ocupada por regiões genômicas específicas. Este método pode ajudar a responder perguntas fundamentais no campo da organização nuclear, como a determinação de interações funcionais entre genes.A principal vantagem deste protocolo específico de FISH de DNA é que ele é rápido, robusto e versátil. Embora demonstremos este método utilizando células E Es, ele também pode ser aplicado a inúmeros outros tipos celulares. Sondas marcadas diretamente, feitas de fragmentos de 100 a 250 kilobases, produzem consistentemente sinais intensos caso sejam necessárias sondas menores.Utilize smids de 40 a 50 quilobases ou até plasmídeos contendo inserções de cinco a 10 quilobases. Identifique os clones de back ou smid correspondentes a genes específicos utilizando os navegadores do genoma Ensemble ou UCSC. Para preparar DNA de back de alta qualidade, utilize precipitação repetida ou um kit comercialmente disponível; a pureza da preparação é proporcional ao volume de sonda necessário.Realize a marcação em duas etapas. Primeiro, utilize a tradução NIC para introduzir o aminoalélico DUTP. Segundo, utilize acoplamento químico para ligar um corante reativo AM.Vale a pena investir tempo na preparação de sondas brilhantes, pois são essenciais para sinais fortes em FISH. Este procedimento pode ser realizado em paralelo ao tratamento das células e não precisa ser feito no início do dia. Primeiro, misture de 10 a 20 nanogramas de sonda marcada diretamente com seis microlitros de CO 1D NA para seis microgramas.Em seguida, adicione um microlitro de DNA de fita simples de testículo de salmão por 9,7 microgramas. Ajuste o volume da mistura para 100 microlitros com água. A seguir, adicione 10 microlitros de acetato de sódio três molar e 275 microlitros de etanol e misture por vortexagem.Deixe a mistura precipitar por pelo menos uma hora a menos 20 graus Celsius. Em seguida, centrifugue o precipitado em um microcentrífuga em velocidade máxima por 30 minutos a quatro graus Celsius. Depois, lave o pellet com etanol 70% e centrifugue novamente por cinco minutos a quatro graus Celsius.Em seguida, seque o pellet ao ar. Depois, ressuspenda-o em cinco microlitros de formamida desionizada.Amida a 37 graus Celsius enquanto agita a 1000 RPM, cobrindo com papel-alumínio para proteger da luz. Após 30 minutos, adicione cinco microlitros de sulfato de dextrina, misture e continue a incubação com agitação. Por mais 10 minutos, a propensão das células de aderir à lâmina varia bastante conforme o tipo celular.Para cada tipo de célula, determine empiricamente o tempo de sedimentação e a densidade celular ideais. Para obter resultados consistentes, as células devem estar em uma suspensão de células isoladas. Para aderir células ES de camundongo em uma lâmina, comece circulando a área da lâmina onde as células serão depositadas.Usando uma caneta hidrofóbica, prepare uma suspensão de 20 a 50.000 células por 80 a 100 microlitros em meio de cultura normal, adicione a suspensão celular no círculo e deixe as células aderirem por cerca de três horas em um incubador umidificado. Após a adesão das células à lâmina, fixe-as submergindo suavemente a lâmina em PFA 4% por 10 minutos. A lâmina deve ficar plana em uma bandeja, como uma caixa de pontas.Usando reagentes em temperatura ambiente em potes coplan. Primeiro, inative as células com cloreto de tris por 10 minutos. Em seguida, permeabilize as células usando uma mistura de sapin e Triton X-100 por 10 minutos.Agora lave as células duas vezes em PBS durante cinco minutos por lavagem. Após as lavagens, incube as células em glicerol 20% por pelo menos 20 minutos. Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas em glicerol 50% a menos 20 graus Celsius por várias semanas.O armazenamento por um dia ou mais deve aumentar a intensidade do sinal. Certifique-se de equilibrar as células à temperatura ambiente em glicerol 20% em PBS antes de prosseguir. Agora, congele e descongele a lâmina três vezes usando nitrogênio líquido.Um lâmina por vez, quando o som de estalido cessar. Após alguns segundos, remova a lâmina para uma toalha de papel para descongelar; espere até que o glicerol congelado opaco desapareça antes de congelar a lâmina novamente. Até 15 lâminas podem ser processadas confortavelmente em rotação, por até três ciclos de congelamento e descongelamento. Agora, lave as lâminas duas vezes em PBS, cinco minutos por lavagem.Em seguida, incubar as lâminas em ácido clorídrico 0,1 molar durante 30 minutos. Após o tratamento com ácido clorídrico, realizar outra lavagem de cinco minutos em PBS. Agora, permeabilizar as células novamente com uma mistura mais forte de sapona e Triton X-100 por 30 minutos para remover os surfactantes das lâminas, utilizando duas lavagens de cinco minutos em PBS.As lâminas estão agora prontas para equilibrar em 50% formamida em XSSC. Este passo deve durar pelo menos 10 minutos; enquanto isso, durante a equilibração, retire a sonda pipetando para cima e para baixo algumas vezes e, em seguida, transfira 10 microlitros por ponto celular para uma lamínula do tamanho apropriado. Retire uma lâmina da formamida e seque qualquer líquido em excesso ao redor das células com uma toalha de papel, mas não permita que o ponto celular seque completamente.Agora inverta a lamínula. Deslize-a sobre a lâmina, cobrindo as células. Sobre a lamínula à lâmina com cimento-rubber.Deixe o cimento secar completamente e mantenha a lâmina protegida da luz. Em seguida, aqueça as lâminas a 78 graus Celsius por exatamente dois minutos em uma placa aquecedora. É fundamental realizar esse procedimento corretamente.Uma tampa deve proteger as células da luz durante esta etapa para preservar ao máximo a morfologia nuclear. É fundamental não deixar as células secarem e garantir que o termobloco tenha a temperatura correta. Em seguida, coloque as lâminas em uma caixa opaca à luz com toalhas de papel úmidas para fornecer umidade e incubar durante a noite a 37 graus Celsius.Inicie este procedimento removendo o cimento de borracha ao redor das lamínulas. Em seguida, coloque cada lâmina em SC em excesso de X até que as lamínulas soltem e deslizem para fora. A seguir, lave as lâminas em 50% de formamida em dois volumes em excesso de SC por 15 minutos a 45 graus Celsius.Mantenha uma tampa sobre o banho-maria para protegê-los da luz. Em seguida, lave as lâminas em 0,2 XSSC por 15 minutos a 63 graus Celsius. Depois, em XSSC 2 por cinco minutos a 45 graus Celsius e, finalmente, em excesso de SE à temperatura ambiente por cinco minutos.Os passos restantes são todos realizados à temperatura ambiente, começando com uma lavagem de cinco minutos em PBS, seguida pela coloração das lâminas com DAPI por dois minutos e, em seguida, incubação das lâminas em PBS por cinco minutos. Para montar a lamínula, aplique 10 microlitros de meio de montagem por ponto celular sobre uma lamínula de tamanho apropriado. Em seguida, remova o excesso de PBS ao redor do ponto celular sem deixar as células secarem.Inverta a lamínula, deslize-a sobre uma lâmina e feche-a com esmalte de unha utilizando o protocolo de preparação de sonda com sonda de peixe. Após a tradução NIC, uma mancha de DNA deve ser visível, com a maior parte dos fragmentos migrando entre 150 e 700 pares de bases. Após a ligação química, a incorporação do corante fluorescente pode ser avaliada por análise espectroscópica da passagem da sonda.Essas etapas de controle de qualidade para avaliar a qualidade da sonda são fundamentais ao utilizar tal sonda. A imagem automatizada com um microscópio de fluorescência epifluorescente foi viável. Isso exige sinais nítidos e facilmente identificáveis dos peixes, com pouco fundo.Esta é uma imagem bruta do campo de visão. As imagens a seguir representam núcleos que foram identificados e analisados automaticamente. Várias distâncias interalélicas e interlocos são mostradas na parte superior direita e em ambos os lados abaixo de cada núcleo.Neste aumento, pontos brancos representam os núcleos identificados por campo de visão. Esses histogramas mostram as distâncias máximas interalélicas entre os sinais verdes acima e os sinais vermelhos abaixo. Todos os dados são de células germinativas P 20 com sondas localizadas em cromossomos diferentes, cobrindo os genes HBB e HBA e um agrupamento de histonas.Estes são exemplos de núcleos de fígado fetal corados com sondas retroativas que cobrem os genes mic, KC e Q1. A partir dessas imagens, podem-se obter as coordenadas nucleares dos sinais FISH e calcular as relações espaciais das regiões genômicas. As distâncias interalélicas são representadas como uma fração do raio do núcleo.As sondas vermelhas estavam significativamente mais próximas umas das outras do que as sondas verdes nestes dados. A microscopia confocal, que exige sinais mais intensos, também foi viável. Pilhas de imagens foram utilizadas para modelagem tridimensional dos sinais dos peixes dentro de seus territórios cromossômicos.Essas duas sondas em vermelho e branco estão próximas a ambas as extremidades do cromossomo sete de camundongo, sendo a pintura de todo o cromossomo mostrada em verde. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como realizar a hibridização fluorescente in situ de DNA (FISH) para investigar o posicionamento espacial de locos genômicos específicos em células individuais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todos os tratamentos podem afetar a arquitetura nuclear, sendo essencial incluir controles apropriados ao seguir este procedimento.Outros métodos, como o imuno FISH, podem ser realizados para responder perguntas adicionais, como as relações espaciais entre genes e proteínas.

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