Robust FISH DNA 3D utilizando sondas Diretamente rotuladas

O objetivo geral do experimento a seguir é investigar a organização espacial de loci genômicos específicos em células individuais de maneira robusta. Isso é obtido primeiro gerando sondas marcadas com fluorescência para finalmente ligar e destacar a região genômica de interesse. Os próximos passos são aderir, fixar e permanenteizar células de interesse em uma lâmina para permitir o acesso à sonda.

Em seguida, uma desnaturação simultânea por calor da sonda e do DNA celular é seguida por etapas de lavagem de hibridização de sonda durante a noite para remover a sonda não especificamente ligada e contra-atacar com dpi. Para visualizar o núcleo celular, os resultados obtidos com a microscopia de fluorescência revelarão a posição nuclear ocupada por regiões genômicas específicas. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da organização nuclear, como determinar interações funcionais entre genes.

A principal vantagem deste protocolo DNA FISH específico é que ele é rápido, robusto e versátil. Embora demonstremos esse método usando células E Es, ele também pode ser aplicado a vários outros tipos de células, sondas marcadas diretamente feitas de costas de 100 a 250. As Kilobases produzem consistentemente sinais brilhantes se forem necessárias sondas menores.

Use 40 a 50 kilobase smid, ou mesmo plasmídeos contendo inserções de cinco a 10 kilobases. Identifique os clones anteriores ou médios correspondentes a genes específicos usando os navegadores de genoma ensemble ou UCSC. Para preparar DNA de retorno de alta qualidade, use precipitação repetida ou um kit disponível comercialmente, a limpeza da preparação é proporcional ao volume de sonda necessário.

Execute a rotulagem em duas etapas. Primeiro, use a tradução NIC para introduzir o alelo amino, DUTP. Em segundo lugar, use o acoplamento químico para anexar um corante reativo médio AM.

Vale a pena investir tempo na fabricação de sondas brilhantes, pois elas são críticas para sinais fortes de peixes. Este procedimento pode ser realizado em paralelo ao tratamento das células e não precisa ser feito no início do dia. Primeiro misturou 10 a 20 nanogramas de sonda marcada diretamente com seis microlitros de CO 1D NA por seis microgramas.

Em seguida, adicione um microlitro de DNA de fita simples de testículos de salmão para 9,7 microgramas. Ajuste o volume da mistura para 100 microlitros com água. Em seguida, adicione 10 microlitros de acetato de sódio de três molares e 275 microlitros de etanol e misture por vórtice.

Deixe a mistura precipitar por pelo menos uma hora a menos 20 graus Celsius. Em seguida, gire a precipitação em uma micro fuga na velocidade máxima por 30 minutos a quatro graus Celsius. Em seguida, lave o pellet com etanol a 70% e gire-o novamente por cinco minutos a quatro graus Celsius.

Em seguida, seque o pellet ao ar. Então resus. Suspenda-o em cinco microlitros de forma deionizada.

Amida a 37 graus Celsius enquanto agita a 1000 RPM você foile para protegê-lo da luz. Após 30 minutos, adicione cinco microlitros de mistura de sulfato de dextrina e continue a incubação com agitação. Por mais 10 minutos, a propensão das células a aderir ao Slide varia muito com o tipo de célula.

Para cada tipo de célula, determine empiricamente o tempo ideal de sedimentação e a densidade celular. Para resultados consistentes, as células devem estar em uma única suspensão celular Para aderir células ES de camundongo em uma lâmina. Comece circulando a área no slide onde as células serão localizadas.

Usando uma caneta hidrofóbica, preparei uma suspensão de 20 a 50.000 células por 80 a 100 microlitros em meio de cultura normal, adicione a suspensão celular ao círculo e deixe as células se fixarem por cerca de três horas em uma incubadora umidificada. Após a fixação da lâmina, fixe as células submergindo suavemente a lâmina em 4% PFA por 10 minutos. O slide deve ser plano em uma bandeja como uma caixa de gorjetas.

Usando reagentes à temperatura ambiente em frascos de coplan. Primeiro tempere as células com cloreto de tris por 10 minutos. Em segundo lugar, permeie as células usando uma mistura de sepina e triton X 100 por 10 minutos.

Agora lave as células duas vezes em PBS por cinco minutos por lavagem. Após as lavagens, incube as células em glicerol a 20% por pelo menos 20 minutos. Neste ponto, as lâminas podem ser armazenadas em glicerol a 50% a menos 20 graus Celsius por várias semanas.

O armazenamento por um dia ou mais deve aumentar a intensidade do sinal. Certifique-se de equilibrar as células à temperatura ambiente em 20% de glicerol em PBS antes de prosseguir. Agora, congele e descongele a lâmina três vezes usando nitrogênio líquido.

Um slide de cada vez quando o som crepitante para. Após alguns segundos, remova a lâmina para uma toalha de papel para descongelar, espere que o glicerol congelado opaco desapareça antes de congelar a lâmina novamente, até 15 lâminas podem ser feitas confortavelmente em rotação por três ciclos de congelamento e descongelamento. Agora lave as lâminas duas vezes em PBS por cinco minutos por lavagem.

Em seguida, incubar as lâminas em ácido clorídrico 0,1 molar durante 30 minutos. Siga o tratamento com ácido clorídrico com outra lavagem de cinco minutos em PBS. Agora permeie as células novamente com uma sepina mais forte e misture Triton X 100 por 30 minutos para lavar os surfactantes das lâminas, use duas lavagens de PBS de cinco minutos.

As lâminas estão agora prontas para se equilibrarem em amida de 50% em XSSC. Isso deve durar pelo menos 10 minutos enquanto equilibra recuperar a sonda pipetada para cima e para baixo algumas vezes e, em seguida, transferir 10 microlitros por ponto de célula para uma lamínula do tamanho apropriado. Remova uma lâmina da forma amida e seque o excesso de líquido ao redor das células com uma toalha de papel, mas não deixe a mancha secar a célula.

Agora inverta a tampa. Deslize para a corrediça sobre as células. Sele a lamínula na corrediça com cimento de borracha.

Deixe o cimento secar completamente e mantenha a lâmina protegida da luz. Em seguida, aqueça as lâminas a 78 graus Celsius por precisamente dois minutos em uma chapa quente. Isso é fundamental para um desempenho adequado.

Uma cobertura deve proteger as células da luz durante esta etapa Para preservar a morfologia nuclear tanto quanto possível. É fundamental não deixar as células secarem e garantir que o local de calor tenha a temperatura certa. Em seguida, coloque as lâminas em uma caixa leve e apertada com toalhas de papel úmidas para fornecer umidade e incube durante a noite a 37 graus Celsius.

Comece este procedimento retirando o cimento de borracha ao redor das lamínulas. Em seguida, coloque cada lâmina em X excesso SC até que as lamínulas se soltem e deslizem. Em seguida, lave as lâminas em amida 50% em excesso por 15 minutos a 45 graus Celsius.

Mantenha uma tampa no banho-maria para protegê-los da luz. Em seguida, lave as lâminas em 0,2 XSSC por 15 minutos a 63 graus Celsius. Em seguida, dois XSSC por cinco minutos a 45 graus Celsius e, finalmente, o excesso de SE em temperatura ambiente por cinco minutos.

As etapas restantes estão todas em temperatura ambiente, começando com uma lavagem de cinco minutos e o PBS agora mancha as lâminas com dappy por dois minutos e depois retém as lâminas com PBS por cinco minutos. Para montar a lamínula, aplique 10 microlitros de meio de montagem por ponto de célula na lamínula do tamanho certo. Em seguida, seque o excesso de PBS ao redor do ponto celular sem deixar as células secarem.

Inverta a tampa, deslize para uma lâmina e sele-a com verniz de unhas usando o protocolo de preparação da sonda de peixe. Após a tradução do NIC, um esfregaço de DNA deve ser visível com a maior parte dos fragmentos correndo entre 150 e 700 pares de bases. Após o acoplamento químico, a incorporação do corante fluorescente pode ser medida por análise espectroscópica da passagem da sonda.

Essas etapas de controle de qualidade para julgar a qualidade da sonda são críticas usando essa sonda. A imagem automatizada com um microscópio de epifluorescência foi viável. Isso requer sinais de peixes nítidos e facilmente identificáveis com pouco fundo.

Esta é uma imagem bruta do campo de visão. As imagens a seguir representam núcleos que foram identificados e analisados automaticamente. Várias distâncias interalélicas e interlocus são mostradas no canto superior direito e em ambos os lados abaixo de cada núcleo.

Nesse alargamento, as manchas brancas representam os núcleos identificados por campo de visão. Esses histogramas mostram distâncias interalélicas máximas entre os sinais verdes acima e os sinais vermelhos abaixo. Todos os dados são de células germinativas P 20 com sondas localizadas em diferentes cromossomos cobrindo os genes HBB e HBA e um aglomerado de histonas.

Estes são exemplos de núcleos de fígado fetal corados com sondas traseiras cobrindo mic e genes KC e Q1. A partir dessas imagens, as coordenadas nucleares dos sinais dos peixes podem ser obtidas e as relações espaciais das regiões genômicas podem ser calculadas. As distâncias interalélicas são plotadas como uma fração do raio do núcleo.

As sondas vermelhas estavam significativamente mais próximas do que as sondas verdes nesses dados. A microscopia confocal, que requer sinais mais intensos, também foi viável. Pilhas de imagens foram usadas para modelagem 3D de sinais de peixes dentro de seus territórios cromossômicos.

Essas duas sondas em vermelho e branco estão próximas de cada extremidade do cromossomo do camundongo, sete cromossomos inteiros são mostrados em verde. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como realizar o DNA de peixes para investigar o posicionamento espacial de loci genômicos específicos em células individuais. Ao tentar este procedimento, é importante lembrar que todo tratamento pode afetar a arquitetura nuclear e é importante incluir o procedimento adequado de Seguindo este procedimento.

Outros métodos, como peixes imunológicos, podem ser realizados para responder a perguntas adicionais, como relações espaciais entre genes e proteínas.