Name: Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2018-01-23T14:00:00.000+00:00
Duration: 10 min 25 s
Description: Aprenda a gerar organoides cerebrais padronizados do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este método reprodutível permite modelar mecanismos do desenvolvimento cortical humano inicial com alta homogeneidade entre lotes.

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O trabalho foi financiado pelo Ministério da ciência inovação e pesquisa do Norte-Vestfália (Junior Research Group) e pela ERA-NET NEURON, JTC 2015 transtornos do desenvolvimento neurológico, haste-MCD.

1. geração de agregados de iPSC
<ol><li>Geração de culturas de célula única monocamada de colônias de iPSC<ol>
<li>Prepare um prato de 6-poços de extrato (BME) revestido de membrana basal. Descongelar o BME no gelo a 4 ° C, durante 2-3h, dilui-lo com modificado águia médio F12 de frio Dulbecco (DMEM-F12; 01:50 diluição), cobrir a placa com 1ml/bem da solução diluída BME e armazenar a placa durante a noite a 4 ° C.</li>
		<li>Aspire o meio e lave colônias de iPSC intacta de pelo menos 2 poços de uma placa de 6 com 0,5 mM de EDTA na salina tamponada fosfato (PBS) duas vezes antes de incubação colónias com 0,5 mM ácido etilenodiaminotetracético (EDTA) em PBS por 4 min em temperatura ambiente (RT). Aspirar a solução de EDTA e delicadamente, separe as colônias lavando-os no fundo do prato com 5 mL de meio DMEM-F12. Pelota-lhes por centrifugação (4 min x 1.200 g em RT) e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Nota: iPSCs reprogramado de fibroblastos comercialmente disponíveis tem sido usado com sucesso10.</li>
		<li>Aspirar o sobrenadante e incubar as colônias de iPSC com 500 µ l de reagente de célula-dissociação para 6 min a 37 ° C.</li>
		<li>Pipetar a suspensão celular várias vezes suavemente para cima e para baixo com uma pipeta de 1 mL para invadir células únicas restantes aglomerados de células.</li>
		<li>Adicione 4 mL de DMEM-F12 para a suspensão de células para diluir o reagente de célula-dissociação.</li>
		<li>Girar as células para baixo a 1.200 x g durante 4 min em RT</li>
		<li>Ressuspender as células em 2 mL de iPSC suplementado com 5 µM Y-27632 e semente de células em um poço de uma placa de 6 BME revestido. Nota: Utilize o meio de iPSC especificado na Tabela de materiais para culturas de iPSC uma monocamada de célula única.</li>
		<li>No dia seguinte, substitua o meio fresco iPSC médio falta Y-27632. A partir daí, continue a cultura das células, alterando o meio todos os dias até iPSCs são 100% confluente. Dependendo da linhagem celular e a confluência dos poços de partida, isto vai demorar entre 2 a 4 dias.</li>
		<li>Uma vez confluente, passagem as iPSCs. Aspire médio e aplicar 500 µ l de reagente de dissociação de célula nas células.</li>
		<li>Incube as celulas por 5-10 min a 37 ° C. Suavemente agitar a placa para separar as células.</li>
		<li>Lavam-se as células do poço usando 2 mL de DMEM-F12 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Adicione DMEM-F12 para um volume total de 5 mL.</li>
		<li>Gire para baixo as células a 1.200 x g durante 4 min em RT e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>As células da semente em iPSC suplementado com 5 µM, Y-27632 em um 1:2 a proporção de 1:4 em um BME revestido placa 6 (2 mL/poço do meio).</li>
		<li>Continue a cultura as células por 2-5 dias e alterar iPSC médio falta Y-27632 todos os dias. Uma vez confluente, passagem iPSCs (1.1.4-1.1.8 de passos). Nota: O iPSCs pelo menos 2 passagens da cultura como uma monocamada na meio de iPSC especificado na Tabela de materiais antes de usá-los para a geração de iPSC agregados para permitir que as células para se adaptar as condições de cultura.</li>
	</ol>
</li>
	<li>Usam as culturas de iPSC monocamada quando são confluente de 70-90% para a geração de agregados de iPSC. Nota: iPSC adaptado para as condições de cultura como células únicas são menos propensas ao estresse que leva à morte celular durante o procedimento de dissociação e agregação. Culturas de iPSC monocamada precisam exibir morfologia típica pluripotentes sem evidência de diferenciação. Teste as culturas em uma base regular para a contaminação de micoplasma. Trabalhar apenas com culturas de iPSC livre de micoplasma.<ol>
<li>Aspire o meio de cultura de um poço de uma placa de 6 e aplicar 500 µ l de reagente de dissociação de célula nas células.</li>
		<li>Incube as celulas por 5-10 min a 37 ° C. Suavemente agitar a placa para separar as células.</li>
		<li>Lavam-se células do poço usando 2 mL de DMEM-F12 e cobrá-los em um tubo de 15 mL. Adicione DMEM-F12 para um volume total de 10 mL.</li>
		<li>Para a contagem de células, tome 25 µ l da suspensão de células e misturá-lo com 25 µ l de trypan azul para marcar as células mortas. Conte as células vivas, utilizando uma câmara de contagem.</li>
		<li>Colete suficiente células (4.500 por agregação de iPSC) da suspensão de células em um tubo de 15 mL.</li>
		<li>Gire para baixo as células a 1.200 x g durante 4 min em RT e aspirar o sobrenadante.</li>
		<li>Ressuspender as células em um volume adequado de iPSC suplementado com 50 µM Y-27632 obter 4.500 células vivas por 150 µ l. Nota: Usando uma alta concentração de Y-27632 (50 µM) é fundamental para a sobrevivência das iPSCs.</li>
		<li>Placa de 150 µ l em cada um bem de uma baixo-anexo 96 poços U-parte inferior da placa e coloque-o na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Ao gerar agregados de iPSC, considere-se que pelo menos 6 organoids são necessários para o controle de qualidade no dia 20 (ver secção 5).</li>
	</ol>
</li>
</ol>2. indução de neuroectoderma Anterior
<ol><li>Acompanhar de perto as alterações da morfologia dos agregados iPSC todos os dias sob o microscópio de cultura de tecidos utilizando um 4 X ou lente de poder X 10. Observe-se no dia 1, agregados de células com bordas claras. Continue a agregados de iPSC cultura na incubadora a 37 ° C e 5% de CO2. Nota: Um certo número de células/poço morto é normal e não afectará a geração de organoides.</li>
	<li>Alimente os agregados de iPSC, a partir de dia 2 e continuando com todos os outros dias, aspirando suavemente aproximadamente 2/3 do meio sem perturbar os agregados de células na parte inferior. Adicione um adicionais 100 µ l de meio de iPSC falta Y-27632. Nota: Dentro de 4 a 6 dias os agregados de células serão 350-450 µm de diâmetro e apresentam bordas lisas.</li>
	<li>Nesta fase, piscina a célula agrega com uma ponta de pipeta corte 100 µ l em um prato de baixo-anexo 6 cm (máximo de 20 agregados/prato) meio de indução cortical contendo DMEM-F12 com suplemento de N2 (1: 200), suplemento de B27 (1: 100), glicose (0,2 mg/mL), cíclico adenosina monofosfato (cAMP; 0,15 µ g/mL), 0,5% não aminoácidos essenciais (timina), 1% L-alanil-L-glutamina, heparina (10 µ g/mL) e os compostos LDN-193189 (180 nM), A83-01 (500 nM) e inibidor da resposta de Wnt-1 (IWR-1) (10 µ g/mL). Alimente os agregados celulares, alterando o meio de indução cortical 3 dias depois transferi-las para o prato de 6 cm.</li>
	<li>Acompanhar de perto as alterações morfológicas durante a indução cortical sob o microscópio de cultura de tecido usando uma lente de poder X 4. Nota: Depois de 4-5 dias no meio de indução cortical, bordas dos agregados celulares devem começar a alegrar-se na superfície, indicando neuroectodérmico diferenciação. Nesta fase, a organização radial de um epitélio pseudoestratificado emerge. Prossiga para a seção 3 para incorporar os agregados de células em uma matriz BME.</li>
</ol>3. incorporação de neuroectodérmico agrega em um andaime de Matrix
<ol><li>Descongele o BME no gelo a 4 ° C, durante 2-3 h alíquota BME não diluído em quantidades suficientes.</li>
	<li>Prepare uma folha de filme plástico de parafina para o procedimento de incorporação. Corte o filme plástico parafina usando uma tesoura esterilizada em 4 x 4 cm grande pedaços, coloque um pedaço de plástico filme de parafina sobre uma bandeja de ponta vazia 100 µ l para 100 dicas µ l e pressione com um dedo protegido por luva para que pequenas covinhas na folha de filme plástico parafina são criadas (1 di mple/célula agregada necessária). Limpar o filme plástico de parafina com etanol a 70% e a irradiação com luz UV (potência: 15 watts, comprimento de onda: 435 nm) sob o banco fechado estéril por 30 min.</li>
	<li>Transferi cada agregado de célula para uma covinha da folha de filme plástico parafina usando uma dica de corte de 100 µ l com 1,5 a 2 mm de diâmetro de abertura. No caso que dois agregados de células são fundidos, não separá-los, mas transferi-los juntos para uma covinha.</li>
	<li>Aspire suavemente o meio circundante os agregados de células usando uma ponta da pipeta sem cortes 100 µ l. Nota: Tenha cuidado para não chupar os agregados de células na ponta, pois isto danificará os agregados.</li>
	<li>Adicione 40 µ l de BME não diluído para cada agregado de células.</li>
	<li>Posição de cada célula agregada no meio o BME drop usando uma ponta de pipeta de 100 µ l sem cortes. Nota: Tenha muito cuidado para não prejudicar o desenvolvimento neuroepithelium com a ponta da pipeta.</li>
	<li>Cuidadosamente, transferir a folha de filme plástico parafina usando Pinças esterilizadas em uma placa de Petri de 10 cm (ou outro prato de cultura de células suficientes) e colocar a cápsula na incubadora para 15-20 min permitir que o BME solidificar.</li>
	<li>Enquanto isso, prepare um prato de baixo-anexo 6 cm contendo 5 mL de meio de indução cortical.</li>
	<li>Após a polimerização do BME, remova as gotículas contendo os agregados de células da folha de filme plástico de parafina. Vire o filme plástico parafina usando Pinças esterilizadas e apertar suavemente os agregados de células para o ligeiramente inclinado (cerca de 30 °) prato de baixo-anexo 6 cm até as gotas caem fora da folha de filme plástico de parafina. Transferi um máximo de 16 agregados de células para uma placa de 6 cm.</li>
	<li>Continuar a incubar os agregados de células a 37 ° C.</li>
</ol>4. geração de prosencéfalo-tipo Organoids de agregados neuroectodérmico
<ol><li>Um dia após a incorporação em uma matriz BME, coloque pratos de cultura organoides num agitador de cultura celular balanço com um ângulo de inclinação de 5 ° e 14 rpm, instaladas em uma incubadora de cultura de células.</li>
	<li>Monitor organoids todos os dias. Neuroepithelial homogênea laço-como estruturas desenvolvem gradualmente após incorporação numa matriz BME.</li>
	<li>Quando neuroepithelial loop estruturas são visíveis, mudar o meio meio de diferenciação de organoides contendo DMEM-F12 com suplemento de N2 (1: 200), suplemento de B27 (1: 100), glicose (0,2 mg/mL), acampamento (0,15 µ g/mL), 0,5% de timina, 1% L-alanil-L-glutamina, insulina (2,5 µ g/mL)</li>
	<li>Substitua o meio de diferenciação de organoides cada 3-4 dias até o ponto de tempo diferenciação desejado é atingido. Em seguida, organoids de correção (ver secção 5). Nota: Ocasionalmente, o tecido pode exibir botões de tecido opticamente translúcido sem estruturas de loop. Embora este não é o ideal, isso não está afetando o desenvolvimento das estruturas corticais. O organoids pode ser cultivado em meio de diferenciação de organoides por até 40 dias. Para períodos de cultura estendida (40-100 dias) o meio de diferenciação de organoides pode ser suplementado com 01:50 BME para aumentar a complexidade do tecido e com BDNF e GDNF para permitir neuronal sobrevivência e maturação14,15.</li>
</ol>5. fixação e validação do prosencéfalo-tipo Organoids
<ol><li>Para a validação, colete 6 organoids no dia 20. Use 3 organoids para o isolamento de mRNA e análises PCR. Transferi os 3 organoids adicionais para uma placa de 24 contendo PBS usando uma ponta de pipeta de 1ml de corte com uma abertura de 3-3,5 mm para fixação e análises immunocytochemical sequencial.</li>
	<li>Lave o organoids duas vezes por cuidadosamente por aspiração a PBS e substituí-lo com PBS fresco utilizando uma pipeta de 5 mL. Corrigi o organoids por 15 min no frio paraformaldeído 4% (PFA) (pH 7,4). Atenção: Cuidado com o que o PFA é um conhecido agente cancerígeno humano. Todo trabalho deve ser feito em uma coifa química usando luvas de nitrilo. Recomenda-se usar óculos de segurança. Formaldeído pode causar danos irreversíveis para a córnea.</li>
	<li>O PFA, Aspire cuidadosamente e lavar três vezes usando temperatura PBS por 10 min.</li>
	<li>Substituir a PBS com solução de sacarose a 30% (wt/vol, baseada em PBS) e armazenar as amostras em 4 ° C, para permitir que organoids a desidratar. Organoids pode ser armazenado por até 7 dias até o processamento adicional.</li>
	<li>Um dia após a fixação, pre-manche a organoids desidratado adicionando trypan azul em aproximadamente 01:50 por 10 min permitir a visualização da organoids durante o procedimento de cryosectioning.</li>
	<li>Prepare o suporte de encastre com 10% de sacarose, gelatina de 7,5% wt/vol em PBS e aquecê-lo a 75 ° C, até que é líquido.</li>
	<li>Substitua 30% solução de sacarose com medium de incorporação e transferir a placa de 24 em uma placa de aquecimento (60 ° C) por 15 min equilibrar o organoids.</li>
	<li>Cubra o fundo dos moldes com uma camada de mídia incorporação incorporação e colocá-los no gelo para polimerizar.</li>
	<li>Transferência do organoids da placa de 24 poços para a incorporação de moldes contendo o meio de encastre polimerizado, adicionar meio incorporação adicional em cima para que as organoids são cobertas e coloque o molde rapidamente em um 100% etanol/gelo congelamento (banho temperatura deve ser entre -30 a-50 ° C) pelo menos 1 min para para-choque.</li>
	<li>Coloque o molde com pinças em gelo seco temporariamente e qualquer loja que eles a-80 ° C ou diretamente proceder com cryosectioning.</li>
	<li>Organoids de Cryosection a 20 µm de espessura e coletar as seções em corrediças do microscópio, mantendo faixa da ordem de seções nos slides (absorção sequencial). Permitem que as seções secar em slides por várias horas, antes de armazená-los a-80 ° C ou executar diretamente immunocytochemical coloração.</li>
</ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

Cérebro organoids representam uma poderosa ferramenta para o estudo cérebro humano desenvolvimento em vitro como eles fornecem o fundo espécies relevantes e o complexo arranjo 3D de células em um contexto de tecido. Com isso, eles a ponte entre modelos animais não-humanos e técnicas de cultura de células de humana bidimensional monocamada reducionista. Suas aplicações são, no entanto, dificultadas pela falta de reprodutibilidade9. Nós desenvolvemos um protocolo de organoides prosencéfalo-tipo, que supera a grande variabilidade de amostra para amostra, combinando a capacidade de auto-organização de iPSC com sua acessibilidade para padronização de fatores. Especificamente, iPSCs foram agregados para promover a auto-organização e posteriormente inibir TGF-ß/SMAD sinalização para promover a diferenciação de córtex dorsal, expondo as culturas para um BMP (LDN-193189) e uma TGF-β tipo I inibidor do receptor (A83-01). Adicionalmente, um composto que inibe a via Wnt (IWR) para impedir a posteriorização foi aplicado. Em contraste com os protocolos de organoides cerebral 'intrínseca'19, que são baseados na auto-montagem sem controle externo, dando origem a organoids cérebro bastante heterogêneo e exibindo variações de lote grande (medido pelas eficiências de polarizado ectoderme neural formação15), o protocolo descrito aqui reproducibly gera homogênea prosencéfalo específicas organoids de iPSCs humana.
Estes organoids do prosencéfalo-tipo pode ser usados para uma variedade de aplicações, tais como estudos de desenvolvimento neurológico, estudos evolutivos, incluindo estudos de função do gene, modelagem de doença e, potencialmente, efeitos terapêuticos e testes de drogas. No entanto, o protocolo é mais adequado para examinar os aspectos iniciais do desenvolvimento cortical humano. Por exemplo usamos o prosencéfalo-tipo organoids para examinar aspectos humanos específicos de comportamento vRGC. Mais especificamente, alterações fisiopatológicas associadas com uma forma grave de lisencefalia, uma malformação cortical humana, caracterizada por uma quase ausência de dobramento cortical, foi abordada. Apenas certos aspectos desta doença podem ser modelados em camundongos, como o cérebro de rato é, naturalmente, lissencephalic. Ao aplicar o sistema de organoides lisencefalia paciente-derivado iPSCs, podemos confiantemente recapitular aspectos humanos específicos da doença e identificar mecanismos subjacentes. Mais especificamente, nós poderia demonstrar que paciente-derivado organoids mostram uma redução significativa no tamanho, causado por um interruptor de simétrica para a divisão celular assimétrica de vRGCs. Essa opção foi associada a alterações na organização da rede de microtúbulos dos vRGCs, uma interrupção da arquitetura do nicho VZ e alterou a expressão de moléculas de adesão celular, levando a uma deficiente ativação de N-caderina/β-catenina sinalização do eixo10. Nota: Regulamento de β-catenina-dependentes dos modos de divisão de vRGC foi sugerido para ser humanos específicos como superexpressão de β-catenina em ratos leva à expansão do córtex tangencial e posteriormente cortical20de dobramento. Assim, nossos dados destacam que o sistema de organoides prosencéfalo-tipo representa uma ferramenta promissora para estudar de forma quantificável os aspectos humanos específicos do desenvolvimento cortical precoce em vitro.
Um grande desafio para o futuro é manter a homogeneidade do organoids em períodos de tempo prolongado para atingir mais maduros fenótipos neuronais. Isso pode ser realizado por um ou mais dos seguintes: cultivo a organoids em um biorreator sistema14, aplicar flutuante moldes15, suplementando o meio de diferenciação com crescimento neural, ou fatores de sobrevivência neuronal. Finalmente, um aumento controlado da complexidade do cérebro pode ser alcançado pela fusão do prosencéfalo-tipo organoids com organoids cerebral de diferente identidade regional21,22.
Tomados em conjunto, o protocolo de organoides de prosencéfalo-tipo apresentado aqui oferece uma ferramenta facilmente aplicável e confiável para a geração das primeiras estruturas corticais em vitro. O protocolo dá origem a tecido cortical precoce altamente homogêneo através de várias linhas de iPSC e pode ser utilizado para gerar confiantemente tecido cortical específicos do indivíduo. Assim, o sistema é particularmente apropriado para aplicações que exigem um alto grau de homogeneidade e reprodutibilidade como modelagem de doença.

O cérebro humano é claramente um dos órgãos mais complexos e é responsável por todas as capacidades intelectuais humanas. Assim, uma compreensão mais profunda do desenvolvimento do cérebro humano específico é um pré-requisito fundamental para a compreensão das habilidades cognitivas humanas. Tradicionalmente, os animais transgénicos serviram como organismos modelo para estudar o desenvolvimento do cérebro. Estes modelos fornecidos insight fundamental sobre os princípios do desenvolvimento do cérebro. Agora sabemos que uma característica comum do desenvolvimento do cérebro em todos os mamíferos é uma coreografia precisa de proliferação do progenitor, neurogênese e migração neuronal. Existem, no entanto, diferenças estruturais significativas entre os cérebros dos organismos-modelo, como roedores e seres humanos, especialmente no neocórtex. Os principais mecanismos que têm sido propostos para contribuir para a evolução cortical de primatas são uma maior proliferação de células estaminais e progenitoras, bem como a geração de células de glia radial exterior (oRGCs), que só muito raramente são encontrados em roedores1 ,2,3.
Métodos para o desenvolvimento do córtex cerebral humano modelo incluem a geração de células progenitoras tele-encefálico PSC-derivados e os neurônios de projeção do córtex cerebral como culturas monocamada. Estas padronizado diferenciação protocolos repetição de certos aspectos do desenvolvimento cortical humano, tais como a ordem temporal estereotipada da neurogênese cortical4. Eles, no entanto, deixam a desejar quando se trata da recapitulação dos processos de desenvolvimento de organogênese como modelação espacial e morfogênese. Desenvolvimentos mais recentes na biologia de células-tronco levaram ao estabelecimento das culturas de organoides 3D de EPS, que estão revolucionando a pesquisa de em vitro organogênese humana. Utilizando a capacidade das EPS para se auto-organizar em estruturas organotypic, vários organoids, que reflectem a chaves propriedades estruturais e funcionais dos órgãos, incluindo os de rim, intestino, o olho e o cérebro foram estabelecidas5. Tais organoids contêm vários subtipos celulares específicas do órgão, que agrupam e organizam espacialmente muito semelhante para os órgãos em desenvolvimento na vivo5,6. Além disso, composição celular, relação de linhagem e gene estudos de rede usando a sequenciação do ARN monocelulares revelaram que organoids cerebrais humanos fielmente recapitular os principais aspectos do desenvolvimento humano fetal neocórtex, tais como programas de expressão do gene 7 , 8. uma grande desvantagem, que impediu a sua ampla aplicação até agora, foi, no entanto, a grandes variações de lotes e heterogeneidade de organoides organoides-para9.
Aqui, nós fornecemos um protocolo detalhado para um sistema de cultura de organoides prosencéfalo-tipo simples e padronizada. A principal característica deste sistema é que ele eficientemente e reproducibly gera PSC-derivado organoids da identidade tele-encefálico dorsal quase exclusiva. O protocolo é baseado sobre os métodos utilizados em nossos últimos Relatórios de célula papel10. Combina a capacidade de auto-organização das iPSCs com indução seletiva de neuroepithelium cortical e robustamente pode gerar culturas homogêneas de tecido tele-encefálico dorsal cedo dentro de 3 semanas. O protocolo baseia-se a sinalização de SMAD relatado anteriormente e a estratégia de inibição de Wnt que orienta a diferenciação do PSC para o anterior neuroectodérmico linhagem11,12 em combinação com matriz de incorporação, que promove a formação de estruturas de grande e contínuo neuroepithelial13. Nós usaram com sucesso o método descrito em várias linhas de iPSC, com vários clones por indivíduo. Nós mostramos que este sistema é adequado para aplicações a jusante, em que a reprodutibilidade e homogeneidade são muito importantes, tais como modelagem de doença. Quando aplicando o protocolo iPSCs provenientes de pacientes que sofrem de uma grave malformação cortical, pudemos recapitular as características patológicas da doença em vitro e identificar novos mecanismos moleculares levando a fenotípica altera10. Sugerimos que o protocolo de organoides descritos pode ser utilizado para fechar a lacuna entre as culturas de monocamada cortical PSC-derivado de reducionista e estudos em vivo , e que representa um sistema fiável e estável baseada em célula modelo para simular mais cedo desenvolvimento cortical humano na saúde e na doença, fora do corpo humano.

<table><tbody><tr><td>A83-01</td><td>StemGent</td><td>130-106-274</td><td>500 nM</td></tr><tr><td>B27 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17504-044</td><td>1 a 100</td></tr><tr><td>Extrato de membrana basal (por exemplo, Geltrex)</td> <td>Gibco</td><td>A14132-02</td><td></td></tr><tr><td>Monofosfato de adenosina cíclico (cAMP)</td> <td>Sigma-Aldrich</td><td>A9501</td><td>0,15 &micro; g / mL</td></tr><tr><td>Reagente de dissociação celular (TrypLE Express)</td> <td>Gibco</td><td>12605028</td><td></td></tr><tr><td>Câmara de contagem, por exemplo, Fuchs-Rosenthal</td><td>Karl Hecht</td><td>40449001</td><td></td></tr><tr><td>D-Glucose</td><td>Carl Roth</td><td>HN06.3</td><td>0,2 mg / mL</td></tr><tr><td>DMEM-F12 L-Glutamina</td><td>Gibco</td><td>11320033</td><td></td></tr><tr><td>Moldes de incorporação (Tissue-Tek Cryomold)</td><td>Sakura Finetek</td><td>4565</td><td></td></tr><tr><td>Ácido etilenodiaminotetracético</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>E6511</td><td>0.5 mM&nbsp;</td></tr><tr><td>Gelantin</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>G1890</td><td></td></tr><tr><td>Heparina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>H3149-25KU</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>Inibidor da resposta WNT (IWR-1)</td><td>Enzo Life Science</td><td>BML-WN103-0005</td><td>10 ug/mL</td></tr><tr><td>Insulina</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>91077C</td><td>2.5 &micro; g/mL</td></tr><tr><td>de meio IPSC para culturas monocamada (Pluripro)</td><td>Cell Guidance Systems</td><td>MK01</td><td></td></tr><tr><td>L-alanil-L-glutamina (GlutaMax)</td><td>Gibco</td><td>35050038</td><td>1%</td></tr><tr><td>Placas de baixa adesão de 6 cm</td><td>Labomedic</td><td>2081646L</td><td></td></tr><tr><td>Placas de baixa adesão de 10 cm</td><td>Labomedic</td><td>2081646O</td><td></td></tr><tr><td>LDN-193189</td><td>Miltenyi Biotec</td><td>130-104-171</td><td>180 nM</td></tr><tr><td>N2 Suplemento</td><td>Gibco</td><td>17502-048</td><td>1 a 200</td></tr><tr><td>aminoácidos não essenciais</td><td>Gibco</td><td>11140035</td><td>0,50%</td></tr> <tr><td>Paraformaldeído</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>P6148</td><td>4,00%</td></tr> <tr><td>Solução salina tamponada com fosfato (PBS)</td> <td>Gibco</td><td>14190144</td><td></td></tr><tr><td>Filme plástico de parafina (Parafilm)</td> <td>MARCA GMBH + CO KG</td><td>701606</td><td></td></tr><tr><td>Sistemas de orientação celular do inibidor Y-27632</td><td></td><td>SM02-100</td><td>5 &micro; M ou 50 &micro; M</td></tr><tr><td>Sucrose</td><td>Sigma-Aldrich</td><td>S7903</td><td></td></tr><tr><td>Tubos 15 mL</td><td>Corning Life Sciences</td><td>734-0451&nbsp;</td><td></td></tr><tr><td>Lâminas de microscópio, por exemplo, Superfrost Plus Lâminas de microscópio</td><td>Thermo Scientific</td><td>4951PLUS4</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 6 poços</td><td>Falcon</td><td>734-0019</td><td></td></tr><tr><td>Placa de cultura de tecidos de 24 poços</td><td>Falcon</td><td>734-0949</td><td></td></tr><tr><td>Mancha azul de tripano</td><td>Gibco</td><td>15250-061</td><td></td></tr><tr><td>Placa de revestimento de lipídio de 96 poços de ligação ultrabaixa A-U96</td><td>Amsbio</td><td>AMS.51011610</td><td></td></tr><tr><td>Anticorpos</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Sox2 R</td><td>& D Systems</td><td>MAB2018</td><td></td></tr><tr><td>Pax6</td><td>Covance</td><td>PRB-278P-100</td><td></td></tr><tr><td>Otx2</td><td>R& D Systems</td><td>ab9566</td><td></td></tr><tr><td>Emx1</td><td>Sigma</td><td>HPA006421</td><td></td></tr><tr><td>N-caderina</td><td>BD</td><td>610921</td><td></td></tr><tr><td>ZO-1</td><td>Life Tech</td><td>61-7300</td><td></td></tr><tr><td>P-Vimentina</td><td>Biozol</td><td>D076-3</td><td></td></tr><tr><td>Tpx2</td><td>Novus Biologicals</td><td>NB500-179</td><td></td></tr><tr><td>Acetilado &alfa;-tubulina&nbsp;</td><td>NEB / CS</td><td>5335</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti ms</td><td>Invitrogen</td><td>A11001</td><td></td></tr><tr><td>Alexa488 anti rb</td><td>Invitrogen</td><td>A11008</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anti ms</td><td>Invitrogen</td><td>A21424</td><td></td></tr><tr><td>Alexa555 anti rb</td><td>Invitrogen</td><td>A21429</td><td></td></tr></tbody></table>

geração de padronizada e reprodutível forebrain-tipo organoids cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

Generation of Standardized and Reproducible Forebrain-type Cerebral Organoids from Human Induced Pluripotent Stem Cells

O córtex humano é altamente expandido e apresenta uma estrutura complexa com áreas funcionais específicas, fornecendo a função cerebral, tais como a cognição. Esforços para estudar o desenvolvimento do córtex cerebral humano tem sido limitados pela disponibilidade de sistemas modelo. Traduzir os resultados de estudos de roedores para o sistema humano é restrito por diferenças de espécies e estudos sobre tecidos humanos primários são dificultados pela falta de disponibilidade de tecidos, bem como as preocupações éticas. Recente desenvolvimento na tecnologia de células-tronco (PSC) pluripotentes humanas incluem a geração de tridimensional (3D) auto-organização organotypic sistemas de cultura, que imitam a uma certa medida cérebro humano específico desenvolvimento em vitro. Atualmente, vários protocolos estão disponíveis para a geração de todo o cérebro ou organoids específicas de região do cérebro. O método para a geração de organoids homogênea e reprodutíveis prosencéfalo-tipo de induzido CPS (iPSC), que nós previamente estabelecido e descreve aqui, combina a capacidade intrínseca do PSC para se auto-organizar com diferenciação guiada em direção a linhagem neuroectodérmico anterior e matriz de incorporação para apoiar a formação de um neuroepithelium contínuo. Mais especificamente, este protocolo envolve: (1) a geração de agregados de iPSC, incluindo a conversão de iPSC colônias para uma cultura de monocamada confluente; (2) a indução de neuroectoderma anterior; (3) a incorporação de agregados neuroectodérmico em um andaime de matriz; (4) a geração de prosencéfalo-tipo organoids de neuroectodérmico agregados; e (5) a fixação e a validação do prosencéfalo-tipo organoids. Como tal, este protocolo fornece um sistema facilmente aplicável para a geração de tecido de cortical iPSC-derivado padronizada e reprodutível estruturas em vitro.

O protocolo de organoides padronizada prosencéfalo-tipo descrito aqui normalmente gera culturas organoides altamente homogênea de quase exclusivamente a identidade cortical dorsal de iPSCs humana dentro de 20 dias de cultivo (protocolo descrito na Figura 1 A). recomenda-se executar várias etapas de controle de qualidade durante o curso do tempo do protocolo, definido aqui como: 'ir' (continuar o processo de diferenciação) e 'Go' (culturas de qualidade inferior, é recomendável para finalizar o lote) (Figura 1 ). Também é aconselhável para documentar cada etapa de controle de qualidade bem tomando notas e imagens.
O primeiro passo crítico na geração de prosencéfalo-tipo organoids é começar com culturas de iPSC de alta qualidade. É importante que iPSCs não contêm frações maiores de células diferenciadas. Utilize apenas culturas de iPSC que apresentam como uma monocamada homogênea de células indiferenciadas na população inicial (Figuras 1B, C). Além disso, é fundamental começar com o número de células determinado para agregação de iPSC. A primeira inspeção detalhada dos agregados iPSC deve ser realizada no dia 2. Nesta fase, os agregados devem ter formado compacto células gustativas com bordas lisas ('ir') Considerando que agregados aparecendo irregulares ou agregados com cavidades devem ser descartado ('abortar') (figuras 1, E). O próximo passo de controle de qualidade deve ser realizado no dia 10 do protocolo. Neste ponto do tempo, os agregados de células devem mostrar tecido suave e opticamente translúcido na superfície exterior, representando a indução de neuroectoderma ('ir'), Considerando que a ausência de tais tecidos indica suboptimal indução neural ('Go') (figuras 1F, G ). Apenas os agregados que exibem uma superfície translúcida (Figura 1F) devem ser incorporados em matriz BME. Uma vez incorporado, o organoids cortical desenvolverá neuroepithelial contínuo laço-como estruturas, que irão expandir rapidamente. Analise a eficiência da indução cortical no dia 15 e dia 20 por investigar se o organoids tem desenvolvida polarizada ectoderma neural conforme demonstrado na Figura 1H, J ('ir'). No caso que organoids não desenvolveram tais botões neuroepithelial ('Go' conforme ilustrado na Figura 1,I, K), criticamente, rever as etapas de controle de qualidade realizados para solução de problemas. Quando firmemente seguir o protocolo, altamente padronizados organoides lotes será gerado (figuras 2A, B), que mostrará a homogeneidade ≥ 90% em polarizada formação neural ectoderma dentro e entre lotes (Figura 2C). Um erro comum, levando à eficiência variável de formação polarizada ectoderma neural é aumentar o número de célula inicial para agregação de iPSC, ou começar com baixa qualidade iPSC culturas tais como micoplasma contaminados culturas ou culturas que contêm células diferenciadas.
Uma validação detalhada da identidade tele-encefálico dorsal do organoids gerado deve ser realizada no dia 20. Para esse fim, 3 organoids deve ser fixo e utilizados para análises de imunofluorescência. Loops de neuroepithelial estratificada(Figura 3)expressam o marcador de células-tronco neurais Sox2 (Figura 3B, D), os marcadores do prosencéfalo Pax6 e Otx2 (figuras 3, E) e o marcador cortical dorsal Emx1 (Figura 3 F). essas voltas corticais caracterizam-se ainda mais por uma localização apical de N-caderina e ZO-1 (figuras 3, H), células de glia radial zona ventricular (vRGC)-derivado de microtúbulos, que se estende desde o apical à parte basal do (estruturas Figura 3 eu), e localizada apical dividindo pilhas que mancha positivas para vimentina fosforilada (p-vimentina, Figura 3J). Morte celular pode estar presente dentro das estruturas organoides. Central apoptose é normal e não afeta o desenvolvimento do tecido cortical. Além disso, 3 organoids deve ser usados para avaliar a homogeneidade do protocolo por análises de expressão do gene. Prosencéfalo-tipo organoids mostrar a expressão dos marcadores prosencéfalo dorsal (FoxG1, Otx2, Emx1), enquanto expressão do mesencéfalo (FoxA2, Pax5) e os marcadores rombencéfalo (HoxB2, HoxA4, HoxB4, HoxB6) não é detectável (Figura 3K).
Lotes de organoids de controle de qualidade podem ser usados para diversas aplicações, como as análises do avião divisão de células gliais radiais apicais. Para o efeito, sugerimos realizar dupla coloração usando anticorpos contra p-vimentina e Tpx2 (Figura 3-J). P-vimentina é fosforilada por CDK1 durante a mitose e situa-se no núcleo, marcando, assim, todos os núcleos na fase mitótica16. Tpx2 é uma proteína associada do microtubule que pode visualizar o fuso mitótico e os processos apicais durante a migração nuclear interkinetic17,18. Usando estes marcadores, três aspectos da divisão de vRGC podem em princípio ser analisados: (I) se celular divisão tem lugar no lado apical, (II) se o plano de divisão é vertical alinhada (indicando simétrica divisão celular), horizontal ou oblíquo ( indicando a divisão celular assimétrica) da superfície apical, e (III) se microtubule organizar centros formam-se normalmente.
Organoids podem ser também mais diferenciados em estruturas mais complexas de tecido cortical organizada e estratificada. Estruturas corticais dentro dia 35 ± 2 organoids são compostas de uma zona ventricular (VZ)-, uma interior e exterior zona subventricular (SVZ), bem como uma placa cortical (CP) - como área. Dentro o VZ e o interior e exterior SVZ, vRGCs, progenitores intermediários (IPs) e células reminiscentes de oRGCs podem ser identificadas. Além disso, a formação inicial de um córtex em camadas pode ser observada na área de CP-como com neurônios corticais profundas expressando Tbr1 e Ctip2 dentro e neurônios corticais superiores, expressando Satb2, bem como células Reelin-expressando no10regiões exteriores.
<img alt="Diagrama de formação de organoides corticais, agregação iPSC, indução neural, resultados de microscopia." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig1.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 1"> Figura 1 : Visão esquemática do protocolo de organoides e ilustração de 'ir' e 'Go' critérios. (A) visão geral esquemática do protocolo. Médio de CI: meio de indução cortical; CD: meio de diferenciação cortical. (B–C) Imagem de uma ideal cultura monocamada confluente iPSC de 90% (B) e uma cultura de não-apropriado iPSC exibindo diferenciação (C). (D–E) Um agregado de iPSC ideal em tamanho, a densidade celular e a aparência de superfície (D) e dois agregados de células 'Go', exibindo qualquer célula poupa cavidades (E, agregado superior) ou irregular das bordas (E, agregado inferior) dois dias agregação de célula seguinte. (F–G) Agregados de células exibindo bordas translúcidas e suaves (F) e agregados de células falta óptico (G) de compensação. A linha amarela é visualizando a área de interesse. (H–K) Uma óptima organoides com loops neuroepithelial contínuo (H, J) e um organoides que não conseguiram desenvolver radialmente organizaram neuroectoderma (eu, K) fotografada no dia 15 e 20, respectivamente. Barras de escala, B-C-500 µm; D-K 200 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig1large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Estágios de crescimento de organoides neurais e comparação de gráficos de barras; estudo sobre radialização do neuroepitélio." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig2.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 2"> Figura 2 : Homogeneidade e reprodutibilidade do protocolo prosencéfalo-tipo organoides. (–B) Imagens representativas do brilhante-campo de organoids de um lote no dia 15 (A) e dia 26 (B). (C) análises quantitativas de organoids no dia 20. Organoids que exibem na superfície exterior de um neuroepithelium, reconhecível em campo claro como opticamente clara superficial tecido com uma fronteira clara e evidência da arquitetura celular radial foram quantificados (n = 3 por linha de iPSC pelo menos 16 organoids por experiência). Escala de barras, A-b: 500 µm. barras de erro ± SD. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig2large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Diagrama de diferenciação neural com imunocoloração; Marcadores Sox2, Pax6, DAPI em seções organoides." class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56768/56768fig3.jpg" data-altupdatedat="1754922859000" data-alt="Figure 3"> Figura 3 : Validação do prosencéfalo-tipo organoids no dia 20. (A–J) Caracterização de Immunocytochemical de organoids. Organoids organizar em vários loops neuroepithelial (A, counterstained com DAPI). Estratificada organizadas células dentro do expresso de laços neuroepithelial o marcador de células-tronco neurais Sox2 (B, D), os marcadores do prosencéfalo Pax6 (C, D) e Otx2 (E), bem como o marcador do prosencéfalo dorsal Emx1 (F). Estruturas de loop cortical exibiram um cinto fino junção aderente lado apical no máximo com o acúmulo de N-caderina (G) e proteínas de occludens zona 1 (ZO-1; H). microtubule de RGCs Ventricular redes (manchadas pelo α-tubulina acetilada, Ac-banheira) estendem-se desde o apical à parte basal das estruturas de loop (eu). Pilhas proliferating expressando p-vimentina (p-Vim) estão localizadas na superfície apical. Fusos mitóticos estão manchados pelo Tpx2. maior ampliação imagem representativa de um vertical e um plano de divisão horizontal são mostrados à direita (J). (K) análise de RT-PCR para os fatores de transcrição específicas da região no dia 20 de dois conjuntos independentes de organoids derivado de 2 linhas diferentes de iPSC. FB: controle cérebro fetal; AB: controle cérebro de um adulto. Barras de escala, A-D 200 µm; E-eu 10 µm. <a href="//cloudflare.jove.com/files/ftp_upload/56768/56768fig3large.jpg" target="_blank">clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Epítopo</td>
			<td>Diluição</td>
		</tr>
<tr>
<td>Sox2</td>
			<td>1 - 300</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax6</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1</td>
			<td>1 - 50</td>
		</tr>
<tr>
<td>N-caderina</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>ZO-1</td>
			<td>1 - 100</td>
		</tr>
<tr>
<td>P-vimentina</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Tpx2</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Α-tubulina acetilada</td>
			<td>1 - 500</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 anti-ms</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa488 anti-rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 anti-ms</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
<tr>
<td>Alexa555 anti-rb</td>
			<td>1 - 1000</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 1: Anticorpos para controle de qualidade de organoids no dia 20.
<table fo:keep-together.within-page="1"><tbody>
<tr>
<td>Primeira demão</td>
			<td>Sequência de</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 para a frente</td>
			<td>tgcaggggttcttctgtgat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Otx2 reversa</td>
			<td>agggtcagagcaattgacca</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 para a frente</td>
			<td>ccctcccatttctgtacgttt</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxG1 reversa</td>
			<td>ctggcggctcttagagat</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 para a frente</td>
			<td>agacgcaggtgaaggtgtgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>Emx1 reversa</td>
			<td>caggcaggcaggctctcc</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 para a frente</td>
			<td>ccaccaccaaccccacaaaatg</td>
		</tr>
<tr>
<td>FoxA2 reversa</td>
			<td>tgcaacaccgtctccccaaagt</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 para a frente</td>
			<td>aggatgccgctgatggagtac</td>
		</tr>
<tr>
<td>Pax5 reversa</td>
			<td>tggaggagtgaatcagcttgg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 para a frente</td>
			<td>tttagccgttcgcttagagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB2 reversa</td>
			<td>cggatagctggagacaggag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 para a frente</td>
			<td>ttcagcaaaatgccctctct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxA4 reversa</td>
			<td>taggccagctccacagttct</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 em frente</td>
			<td>acacccgctaacaaatgagg</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB4 reversa</td>
			<td>gcacgaaagatgagggagag</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 para a frente</td>
			<td>gaactgaggagcggactcac</td>
		</tr>
<tr>
<td>HoxB6 reversa</td>
			<td>ctgggatcagggagtcttca</td>
		</tr>
<tr>
<td>18 anos para a frente</td>
			<td>ttccttggaccggcgcaag</td>
		</tr>
<tr>
<td>18s reversa</td>
			<td>gccgcatcgccggtcgg</td>
		</tr>
</tbody></table>Tabela 2: Primer e sequências de cartilha para o perfil de expressão do gene.

Organoids cerebrais representam um novo sistema de modelo para investigar mais cedo cérebro humano desenvolvimento em vitro. Este artigo fornece a metodologia detalhada para gerar eficientemente organoids dorsal homogênea do prosencéfalo-tipo de células-tronco pluripotentes induzidas humano incluindo passos críticos de caracterização e validação.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

The human cortex is highly expanded and exhibits a complex structure with specific functional areas, providing higher brain function, such as cognition. ...

O objetivo geral deste procedimento é gerar organoides do tipo prosencéfalo altamente padronizados e reprodutíveis a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este método é uma ferramenta poderosa para modelar mecanismos de novas NTZs de desenvolvimento. Em particular, pode ajudar a abordar questões-chave associadas à gênese cortical humana inicial.A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração padronizada e eficiente em termos de tempo de tecido cortical humano com pequenas variações entre organoides individuais e lotes de organoides. A tecnologia organoide pode fornecer informações sobre o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro humano, especialmente para aqueles aspectos não encontrados em modelos cerebrais de espécies inferiores. Para gerar agregados de células-tronco pluripotentes, quando as culturas de células-tronco atingirem 70 a 90% de confluência, adicione 500 microlitros de reagente de dissociação celular a um poço da placa de cultura de seis poços para separar as células.As células-tronco pluripotentes induzidas, que são adaptadas às condições de cultivo em monocamada, são um bom tipo de célula para gerar agregados, pois são menos propensas à morte celular induzida por estresse durante o procedimento de dissociação e agregação. Após cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius, bata suavemente na placa e use dois mililitros de DMEM/F-12 para lavar as células do fundo do poço. Transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros e aumente o volume da solução celular para 10 mililitros com mais meio DMEM/F-12.Após a contagem, transferir 4,5 vezes 10 para as terceiras células por agregado de células estaminais pluripotentes para um novo tubo de 15 mililitros e recolher as células por centrifugação. Suspendemos o pellet no volume apropriado de meio de células-tronco pluripotentes, suplementado com inibidor de rocha 50 micromolar para atingir 4,5 vezes 10 para as terceiras células por 150 microlitros de concentração média. Em seguida, adicione 150 microlitros de células a poços individuais de uma placa de fundo em U de baixa fixação de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.Para monitorar a indução do neuroectoderma anterior, use um microscópio de cultura de tecidos para observar de perto as alterações morfológicas dos agregados de células-tronco pluripotentes todos os dias sob baixa ampliação. No primeiro dia, agregados celulares com bordas claras devem ser observados. No segundo dia, aspire cuidadosamente aproximadamente dois terços do meio, sem perturbar os agregados celulares no fundo de cada poço, e substitua o meio descartado por 100 microlitros de meio fresco de células-tronco pluripotentes.Entre quatro e seis dias depois, quando os agregados celulares atingirem 350 a 450 micrômetros de diâmetro e exibirem bordas lisas, use uma ponta de pipeta modificada de 100 microlitros para transferir até 20 agregados para uma única placa de cultura de baixa inserção de seis centímetros contendo cinco mililitros de meio de indução cortical. Substituir o meio de indução cortical por meio fresco uma vez a cada três dias, monitorando a morfologia dos agregados diariamente sob a objetiva 4X. Após quatro a cinco dias no meio de indução cortical, as bordas dos agregados celulares devem começar a clarear na superfície, indicando diferenciação neuroectodérmica e a organização radial de um epitélio pseudoestratificado deve emergir.Para incorporar os agregados neuroectodérmicos em um andaime de matriz, descongele o extrato da membrana basal no gelo por duas a três horas. Enquanto o extrato está descongelando, use uma tesoura estéril para cortar o filme plástico de parafina em um quadrado de quatro por quatro centímetros por 16 organoides e coloque cada pedaço de filme sobre uma bandeja vazia de ponta de micropipeta de 100 microlitros. Pressione o filme de parafina com a ponta do dedo enluvado para que apareçam pequenas covinhas e limpe o filme com etanol a 70%.Após a radiação UV em um gabinete de biossegurança fechado e estéril por 30 minutos, use uma ponta de pipeta modificada de 100 microlitros com uma abertura de um milímetro e meio a dois milímetros para transferir cada agregado celular para uma covinha no filme. Quando todos os agregados tiverem sido transferidos, use uma ponta de pipeta de 100 microlitros não cortada para aspirar cuidadosamente o meio de cada covinha e adicione 40 microlitros de extrato de membrana basal não diluído a cada agregado celular. Tenha cuidado para não danificar os organoides por manipulação grosseira ou aspiração na ponta da pipeta, pois isso danificaria o neuroepitélio em desenvolvimento.Use a ponta da pipeta para posicionar os agregados no meio de cada gota e use uma pinça estéril para transferir cuidadosamente a folha de filme plástico de parafina para uma placa de Petri de 10 centímetros. Coloque o prato na incubadora por 15 a 20 minutos. Enquanto o extrato está solidificando, adicione cinco milímetros de meio de indução cortical fresco a uma placa de cultura de baixa fixação de seis centímetros.No final da incubação, vire a folha de filme de parafina e use uma pinça estéril para espremer suavemente até 16 gotículas polimerizadas em cada prato de seis centímetros. Em seguida, retorne os agregados à incubadora de cultura de células. No dia seguinte, transferir as placas de cultura organoide para um agitador de cultura de células oscilante, inclinado em um ângulo de cinco graus a 14 rpm dentro de uma incubadora de cultura de células, com monitoramento diário de microscopia de luz, até que os agregados atinjam o estágio de diferenciação de interesse.No dia 20, use uma ponta de pipeta modificada de um mililitro com uma abertura de três a três mililitros e meio para coletar seis organoides das culturas agregadas. Coloque três dos organoides em um poço de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de PBS e use uma pipeta de cinco mililitros para lavar os organoides duas vezes com 500 microlitros de PBS fresco por lavagem. Após a segunda lavagem, fixe os organoides em paraformaldeído frio a 4% por 15 minutos, seguido por três lavagens de 10 minutos em temperatura ambiente PBS e uma desidratação final durante a noite em solução de sacarose a 30% a quatro graus Celsius.No dia seguinte, pré-pinte os organoides desidratados com uma diluição de um a 50 Trypan Blue por 10 minutos para permitir a visualização dos organoides durante o procedimento de crioseccionamento e substitua a sacarose por meio de incorporação recém-preparado. Aqueça a placa em uma almofada de aquecimento a 60 graus Celsius por 15 minutos para equilibrar os organoides no meio de incorporação e cubra a parte inferior de um molde de incorporação por organoide com meio de incorporação fresco. Coloque o molde no gelo para solidificar o meio de incorporação, transfira os organoides para os moldes de incorporação e adicione um novo meio de incorporação até que cada organoide esteja coberto.Em seguida, congele os organoides em um banho de congelamento com gelo seco com etanol a 100% por pelo menos um minuto e use um criostato para obter seções de 20 micrômetros de espessura de cada organoide para análise imunocitoquímica. Para gerar organoides do tipo prosencéfalo, use apenas culturas IPSC que se apresentam como uma monocamada homogênea de células indiferenciadas na população inicial. No segundo dia, os agregados devem ter formado gemas celulares compactas com bordas lisas.Os agregados do dia 10 devem mostrar tecido liso e opticamente liso e opticamente translúcido na superfície externa, representando a indução do neuroectoderma. Se o protocolo tiver sido seguido de perto, serão gerados lotes organoides altamente padronizados que demonstrem maior ou igual a 90% de homogeneidade na formação de neuroectoderma polarizado dentro e entre lotes. A análise imunocitoquímica dos organoides do dia 20 revela alças neuroepiteliais estratificadas que expressam o marcador de células-tronco neurais Sox2, os marcadores do prosencéfalo Pax6 e Otx2 e o marcador cortical dorsal Emx1.Essas alças corticais são ainda caracterizadas por uma localização apical de N-caderina e ZO-1, microtúbulo derivado de células gliais radiais da zona ventricular, que se estende do lado apical ao basal das estruturas, e células divisórias localizadas na apical que se coram positivamente para vimentina fosforilada. Para analisar o plano de divisão das células gliais radiais apicais pode ser realizada a dupla coloração para vimentina e Tpx2, uma proteína associada a microtúbulos que pode ser usada para visualizar o fuso mitótico e os processos apicais durante a migração nuclear intercinética. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar organoides do tipo prosencéfalo altamente padronizados e homogêneos a partir de células-tronco pluripotentes humanas.Essa técnica facilita o estudo dos aspectos humanos específicos dos distúrbios do neurodesenvolvimento usando um modelo de célula 3D complexo organizado de maneira específica do neurotecido. Uma vez que a técnica tenha sido dominada, esses organoides corticais podem ser usados para uma variedade de aplicações, como estudos de neurodesenvolvimento, evolução ou função gênica, incluindo modelagem de doenças e potencialmente testes ou terapia de drogas.

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Research

JoVE Journal

Developmental Biology

Biologia do Desenvolvimento

O vídeo demonstra um método para gerar organoides cerebrais humanos a partir de células-tronco pluripotentes induzidas. Ele mostra como a neuroesfera forma uma camada neuroectodérmica, que suprime a formação de outras camadas germinativas. As neuroesferas são incorporadas em uma matriz de gel 3D e formam brotos neuroepiteliais. Quando incubados com meios organoides, esses brotos neuroepiteliais se diferenciam em regiões cerebrais específicas, resultando na formação de organoides cerebrais...

Um método in vitro para gerar organoides cerebrais humanos

Este vídeo demonstra um ensaio para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas (iPSCs). As iPSCs humanas são induzidas a formar corpos embrióides (EBs). Os EBs são cultivados sobre um andaime de polímero usando um meio de indução, promovendo a diferenciação em células-tronco neurais, células progenitoras e neurônios imaturos. Finalmente, os EBs são embutidos em uma matriz e transferidos para um meio de manutenção para a formação de organoides cerebrais.

Geração de Organoides Cerebrais Derivados de Células-Tronco Pluripotentes Induzidas

Este vídeo demonstra a transformação de células-tronco pluripotentes humanas (hPSCs) em organoides cerebrais esféricos. Usando inibidores específicos, as hPSCs são guiadas para se diferenciar em direção a uma linhagem neuronal, formando colônias neuroectodérmicas. Fatores especiais de crescimento são então introduzidos, o que estimula a auto-organização e proliferação das colônias, levando à formação de organoides cerebrais esféricos.

Geração de esferoides a partir de células-tronco pluripotentes humanas

Este vídeo descreve a criação de organoides do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs), demonstrando a progressão de agregados de células-tronco para estruturas complexas que imitam o córtex do cérebro e se diferenciam em vários tipos de neurônios.

Geração de organoides cerebrais do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos

A modelagem do desenvolvimento do cérebro humano foi prejudicada devido à complexidade sem precedentes do tecido epitelial neural. Aqui, é descrito um método para a geração robusta de organoides cerebrais para delinear eventos iniciais do desenvolvimento do cérebro humano e modelar a microcefalia in vitro.

Geração de iPSC-derivado do cérebro Organóides Humanos para modelar alterações precoces do desenvolvimento neurológico

Esse protocolo foi gerado como um meio de produzir organoides cerebrais de forma simplificada e de baixo custo sem fatores de crescimento exógenos ou matriz de membrana do porão, mantendo a diversidade de tipos de células cerebrais e muitas características da organização celular.

Um método estática auto-direcionado para gerar organoides cerebrais a partir de células-tronco embrionárias humanas

Apresentamos protocolos detalhados para a geração e caracterização de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos 2D e 3D (hIPSC) de desenvolvimento neocortical, bem como metodologias complementares que permitem análise qualitativa e quantitativa da biogênese e função do cilium primário (PC).

Modelos pluripotentes 2D e 3D induzidos por humanos para dissecar o envolvimento do círio primário durante o desenvolvimento neocortical

Aqui descrevemos um protocolo para a geração de organoides cerebrais a partir de células-tronco pluripotentes induzidas por humanos (iPSCs). Para obter organoides cerebrais em grandes quantidades e de alta qualidade, usamos mini bioreatores caseiros.

Geração organoide cerebral a partir de células-tronco pluripotentes induzidas em mini-bioreatores caseiros

Neste estudo, fornecemos uma técnica detalhada para um sistema de cultura organoide cortical simples, mas robusto, usando culturas hPSC padrão sem alimentador. Este é um protocolo rápido, eficiente e reprodutível para gerar organoides que modelam aspectos da senescência cerebral in vitro.

Geração robusta e altamente reprodutível de organoides cerebrais corticais para modelar senescência neuronal cerebral in vitro

Espinhas dendríticas dos neurônios piramidais são os sites da maioria das sinapses excitatórias no córtex cerebral dos mamíferos. Este método descreve a análise quantitativa 3D de morfologias coluna em neurônios piramidais glutamatérgicos corticais humanos derivados de células-tronco pluripotentes induzidas.

A quantificação tridimensional das espinhas dendríticas de Piramidal neurônios derivados pluripotentes induzidas pelo homem Células-Tronco

Aprenda a gerar organoides cerebrais padronizados do tipo prosencéfalo a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este método reprodutível permite modelar mecanismos do desenvolvimento cortical humano inicial com alta homogeneidade entre lotes.

Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

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