Geração de padronizada e reprodutível Forebrain-tipo Organoids Cerebral de humanos induzida por células-tronco pluripotentes

O objetivo geral deste procedimento é gerar organoides do tipo prosencéfalo altamente padronizados e reprodutíveis a partir de células-tronco pluripotentes humanas. Este método é uma ferramenta poderosa para modelar mecanismos de novas NTZs de desenvolvimento. Em particular, pode ajudar a abordar questões-chave associadas à gênese cortical humana inicial.

A principal vantagem dessa técnica é que ela permite a geração padronizada e eficiente em termos de tempo de tecido cortical humano com pequenas variações entre organoides individuais e lotes de organoides. A tecnologia organoide pode fornecer informações sobre o desenvolvimento, estrutura e função do cérebro humano, especialmente para aqueles aspectos não encontrados em modelos cerebrais de espécies inferiores. Para gerar agregados de células-tronco pluripotentes, quando as culturas de células-tronco atingirem 70 a 90% de confluência, adicione 500 microlitros de reagente de dissociação celular a um poço da placa de cultura de seis poços para separar as células.

As células-tronco pluripotentes induzidas, que são adaptadas às condições de cultivo em monocamada, são um bom tipo de célula para gerar agregados, pois são menos propensas à morte celular induzida por estresse durante o procedimento de dissociação e agregação. Após cinco a 10 minutos a 37 graus Celsius, bata suavemente na placa e use dois mililitros de DMEM/F-12 para lavar as células do fundo do poço. Transfira a suspensão celular resultante para um tubo cônico de 15 mililitros e aumente o volume da solução celular para 10 mililitros com mais meio DMEM/F-12.

Após a contagem, transferir 4,5 vezes 10 para as terceiras células por agregado de células estaminais pluripotentes para um novo tubo de 15 mililitros e recolher as células por centrifugação. Suspendemos o pellet no volume apropriado de meio de células-tronco pluripotentes, suplementado com inibidor de rocha 50 micromolar para atingir 4,5 vezes 10 para as terceiras células por 150 microlitros de concentração média. Em seguida, adicione 150 microlitros de células a poços individuais de uma placa de fundo em U de baixa fixação de 96 poços e coloque a placa em uma incubadora de 37 graus Celsius e 5% de dióxido de carbono.

Para monitorar a indução do neuroectoderma anterior, use um microscópio de cultura de tecidos para observar de perto as alterações morfológicas dos agregados de células-tronco pluripotentes todos os dias sob baixa ampliação. No primeiro dia, agregados celulares com bordas claras devem ser observados. No segundo dia, aspire cuidadosamente aproximadamente dois terços do meio, sem perturbar os agregados celulares no fundo de cada poço, e substitua o meio descartado por 100 microlitros de meio fresco de células-tronco pluripotentes.

Entre quatro e seis dias depois, quando os agregados celulares atingirem 350 a 450 micrômetros de diâmetro e exibirem bordas lisas, use uma ponta de pipeta modificada de 100 microlitros para transferir até 20 agregados para uma única placa de cultura de baixa inserção de seis centímetros contendo cinco mililitros de meio de indução cortical. Substituir o meio de indução cortical por meio fresco uma vez a cada três dias, monitorando a morfologia dos agregados diariamente sob a objetiva 4X. Após quatro a cinco dias no meio de indução cortical, as bordas dos agregados celulares devem começar a clarear na superfície, indicando diferenciação neuroectodérmica e a organização radial de um epitélio pseudoestratificado deve emergir.

Para incorporar os agregados neuroectodérmicos em um andaime de matriz, descongele o extrato da membrana basal no gelo por duas a três horas. Enquanto o extrato está descongelando, use uma tesoura estéril para cortar o filme plástico de parafina em um quadrado de quatro por quatro centímetros por 16 organoides e coloque cada pedaço de filme sobre uma bandeja vazia de ponta de micropipeta de 100 microlitros. Pressione o filme de parafina com a ponta do dedo enluvado para que apareçam pequenas covinhas e limpe o filme com etanol a 70%.

Após a radiação UV em um gabinete de biossegurança fechado e estéril por 30 minutos, use uma ponta de pipeta modificada de 100 microlitros com uma abertura de um milímetro e meio a dois milímetros para transferir cada agregado celular para uma covinha no filme. Quando todos os agregados tiverem sido transferidos, use uma ponta de pipeta de 100 microlitros não cortada para aspirar cuidadosamente o meio de cada covinha e adicione 40 microlitros de extrato de membrana basal não diluído a cada agregado celular. Tenha cuidado para não danificar os organoides por manipulação grosseira ou aspiração na ponta da pipeta, pois isso danificaria o neuroepitélio em desenvolvimento.

Use a ponta da pipeta para posicionar os agregados no meio de cada gota e use uma pinça estéril para transferir cuidadosamente a folha de filme plástico de parafina para uma placa de Petri de 10 centímetros. Coloque o prato na incubadora por 15 a 20 minutos. Enquanto o extrato está solidificando, adicione cinco milímetros de meio de indução cortical fresco a uma placa de cultura de baixa fixação de seis centímetros.

No final da incubação, vire a folha de filme de parafina e use uma pinça estéril para espremer suavemente até 16 gotículas polimerizadas em cada prato de seis centímetros. Em seguida, retorne os agregados à incubadora de cultura de células. No dia seguinte, transferir as placas de cultura organoide para um agitador de cultura de células oscilante, inclinado em um ângulo de cinco graus a 14 rpm dentro de uma incubadora de cultura de células, com monitoramento diário de microscopia de luz, até que os agregados atinjam o estágio de diferenciação de interesse.

No dia 20, use uma ponta de pipeta modificada de um mililitro com uma abertura de três a três mililitros e meio para coletar seis organoides das culturas agregadas. Coloque três dos organoides em um poço de uma placa de 24 poços contendo 500 microlitros de PBS e use uma pipeta de cinco mililitros para lavar os organoides duas vezes com 500 microlitros de PBS fresco por lavagem. Após a segunda lavagem, fixe os organoides em paraformaldeído frio a 4% por 15 minutos, seguido por três lavagens de 10 minutos em temperatura ambiente PBS e uma desidratação final durante a noite em solução de sacarose a 30% a quatro graus Celsius.

No dia seguinte, pré-pinte os organoides desidratados com uma diluição de um a 50 Trypan Blue por 10 minutos para permitir a visualização dos organoides durante o procedimento de crioseccionamento e substitua a sacarose por meio de incorporação recém-preparado. Aqueça a placa em uma almofada de aquecimento a 60 graus Celsius por 15 minutos para equilibrar os organoides no meio de incorporação e cubra a parte inferior de um molde de incorporação por organoide com meio de incorporação fresco. Coloque o molde no gelo para solidificar o meio de incorporação, transfira os organoides para os moldes de incorporação e adicione um novo meio de incorporação até que cada organoide esteja coberto.

Em seguida, congele os organoides em um banho de congelamento com gelo seco com etanol a 100% por pelo menos um minuto e use um criostato para obter seções de 20 micrômetros de espessura de cada organoide para análise imunocitoquímica. Para gerar organoides do tipo prosencéfalo, use apenas culturas IPSC que se apresentam como uma monocamada homogênea de células indiferenciadas na população inicial. No segundo dia, os agregados devem ter formado gemas celulares compactas com bordas lisas.

Os agregados do dia 10 devem mostrar tecido liso e opticamente liso e opticamente translúcido na superfície externa, representando a indução do neuroectoderma. Se o protocolo tiver sido seguido de perto, serão gerados lotes organoides altamente padronizados que demonstrem maior ou igual a 90% de homogeneidade na formação de neuroectoderma polarizado dentro e entre lotes. A análise imunocitoquímica dos organoides do dia 20 revela alças neuroepiteliais estratificadas que expressam o marcador de células-tronco neurais Sox2, os marcadores do prosencéfalo Pax6 e Otx2 e o marcador cortical dorsal Emx1.

Essas alças corticais são ainda caracterizadas por uma localização apical de N-caderina e ZO-1, microtúbulo derivado de células gliais radiais da zona ventricular, que se estende do lado apical ao basal das estruturas, e células divisórias localizadas na apical que se coram positivamente para vimentina fosforilada. Para analisar o plano de divisão das células gliais radiais apicais pode ser realizada a dupla coloração para vimentina e Tpx2, uma proteína associada a microtúbulos que pode ser usada para visualizar o fuso mitótico e os processos apicais durante a migração nuclear intercinética. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar organoides do tipo prosencéfalo altamente padronizados e homogêneos a partir de células-tronco pluripotentes humanas.

Essa técnica facilita o estudo dos aspectos humanos específicos dos distúrbios do neurodesenvolvimento usando um modelo de célula 3D complexo organizado de maneira específica do neurotecido. Uma vez que a técnica tenha sido dominada, esses organoides corticais podem ser usados para uma variedade de aplicações, como estudos de neurodesenvolvimento, evolução ou função gênica, incluindo modelagem de doenças e potencialmente testes ou terapia de drogas.