Avaliação da Interface sináptica de células T humano primário do sangue periférico e tecido linfoide

O protocolo descreve uma técnica para estudar a capacidade das células T policlonais humanas de primário para formar sinápticas interfaces usando bilayers do lipid planar. Usamos esta técnica para mostrar a capacidade de formação de sinapse diferencial de células T humanas primárias derivado dos gânglios linfáticos e sangue periférico.

A abordagem sobre a qual falaremos hoje foi derivada para comparar propriedades e atividades funcionais de células T derivadas de tecidos e do sangue periférico. A importância do tópico é exemplificada pelo fato de que as células T do sangue periférico representam apenas 20% do total de células T em um corpo. Ser capaz de estudar um pequeno número de células T derivadas de tecidos é muito essencial, e é exatamente isso que conseguimos.

A principal vantagem dessa técnica é que ela requer menor número de células e menores volumes de reagentes do que as técnicas tradicionais. Comece usando pinças tipo tesoura de polipropileno para submergir lamínulas de vidro em solução de piranha ácida recém-preparada por 25 a 30 minutos. No final da lavagem, enxágue as lamínulas sete vezes em um novo volume de água ultrapura para cada lavagem.

Em seguida, reserve as lamínulas molhadas para deixar a água restante rolar do copo limpo. Quando as lamínulas estiverem secas, alíquota de dois microlitros da mistura final de lipossomas precisamente no centro de um canal deslizante autoadesivo dentro de uma coifa de fluxo estéril. E alinhe imediatamente, mas com cuidado, uma lamínula limpa e seca com o slide para permitir que a lamínula seja abaixada suavemente no lado adesivo do slide.

E use o anel externo da pinça tipo tesoura de polipropileno para aplicar uma leve pressão no contato periférico da lamínula com a corrediça, certificando-se de que a lamínula esteja firmemente presa à corrediça para evitar vazamentos. Em seguida, vire o slide e use um marcador permanente para desenhar quatro pontos ao redor da bicamada no lado externo do conjunto do slide. Antes da primeira injeção, designe uma porta do canal como porta de entrada e a outra como porta de saída, mantendo essa designação durante todo o experimento.

Para evitar a formação de bolhas, insira a extremidade da ponta da pipeta diretamente na porta de entrada até sentir a vedação de borracha do canal deslizante sendo penetrada com a ponta. Encha lentamente o canal com 50 microlitros de tampão de ensaio quente. Injete 200 microlitros de cloreto de níquel (II) na solução de bloqueio de caseína na porta de entrada.

E remova 50 microlitros do buffer da porta de saída. Após uma incubação de 45 minutos, remova o excesso de solução de caseína da porta de saída. Injete 100 microlitros de um ICAM-1 em solução de estreptavidina na porta de entrada para uma incubação de 45 minutos em temperatura ambiente.

No final da incubação, remova o excesso de solução proteica da porta de saída. E lave a bicamada duas vezes com 100 microlitros de tampão de ensaio por lavagem. Em seguida, rotule as bicamadas com 100 microlitros de anticorpo anti-CD3 conjugado com fluoro-4 por 45 minutos em temperatura ambiente.

Seguido por duas lavagens em 100 microlitros de tampão de ensaio por lavagem, conforme demonstrado. Para obter imagens das interações da bicamada de células T, coloque a lâmina no estágio aquecido de 37 graus Celsius de uma fluorescência de reflexão interna total, ou microscópio TIRF. E ajuste o palco usando as marcas de tinta para centralizar a bicamada na objetiva de 100 potências.

Para imagens de liberação de grânulos, adicione fragmentos de FAB de anticorpo anti-CD107A conjugados com fluorescência à suspensão de células T CD4. E ressuspenda as células marcadas em 50 microlitros de tampão de ensaio para injeção na porta de entrada do canal de lâmina. Em seguida, selecione o número apropriado de campos experimentais e registre as imagens de cada campo uma vez a cada minuto durante 30 minutos após a injeção.

Neste experimento representativo, não foram observadas diferenças entre as células T CD8 que formaram sinapses imunológicas clássicas nas bicamadas lipídicas construídas na célula de fluxo ou na lâmina de fluxo multicanal. Após a interação da bicamada lipídica, as células T CD4 estabeleceram sinapses imunes maduras, mas liberam ou não grânulos, liberam grânulos sem a formação de sinapses maduras ou não formam sinapses nem liberam grânulos. É importante observar que as células T CD4 derivadas de células mononucleares do sangue periférico são capazes de começar a liberar grânulos quase duas vezes mais rapidamente do que as células CD4 derivadas de linfonodos.

Ao tentar este procedimento, é importante manter a temperatura constante e pipetar lentamente para que não haja formação de bolhas. Além de nossa capacidade de investigar uma interface de bicamada de células T, essa abordagem também nos permitiria realizar uma coloração intercelular das células T que tocaram a bicamada. O que facilitaria significativamente uma quantidade de informações que podem ser usadas para descrever células T específicas derivadas de tecido linfóide ou de outros tecidos.

Não se esqueça de que trabalhar com solução de piranha é extremamente perigoso e é crucial que você use EPI adequado ao tentar este procedimento.