Estabelecimento simples de um nicho osteogênico vascularizado da medula óssea usando hidrogéis pré-moldados de poli(etilenoglicol) (PEG) em uma microplaca de imagem
19 de maio de 2023
Um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea é estabelecido pela semeadura de células mesenquimais e endoteliais em hidrogéis pré-moldados de PEG 3D. As redes endoteliais, os componentes da MEC e a atividade da FA dos nichos variam dependendo do fator de crescimento utilizado. A plataforma pode ser usada para modelos avançados de câncer.
A maioria dos estudos de vascularização in vitro utiliza matrizes derivadas naturalmente. Embora tipicamente muito condutor de processos biológicos, sua atividade biológica inerente complica o estudo de influências de parâmetros únicos. Aqui, podemos adicionar seletivamente nossos jogadores de interesse e avaliar como o sistema muda.
A semeadura sequencial de células em nossos hidrogéis sintéticos de ardósia em branco permite a formação de nichos muito definidos. Aqui, os hBMMSs colonizam os hidrogéis e depositam sua matriz extracelular inerente. Isso fornece o substrato para as células endoteliais subsequentemente semeadas.
Esta característica não é comumente encontrada em outros modelos 3D in vitro. A possibilidade de adicionar diferentes tipos celulares sequencialmente permite a criação de modelos in vitro compatíveis com alto rendimento e grande complexidade. Esses modelos podem ser adaptados para gerar nichos vascularizados osteogênicos mais específicos e investigar as funções de atores celulares e moleculares.
Visão Geral
Este estudo estabelece um modelo in vitro do nicho vascular da medula óssea utilizando hidrogéis de PEG tridimensionais. O modelo permite o semeadura sequencial de células mesenquimais e endoteliais, possibilitando a investigação das interações celulares e dos efeitos de fatores de crescimento no desenvolvimento do nicho.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Biologia Celular
- Engenharia de Tecidos
Contexto
- Modelos tradicionais in vitro frequentemente utilizam matrizes derivadas naturalmente, o que complica o estudo de parâmetros específicos.
- Os hidrogéis sintéticos proporcionam um ambiente controlado para o semeadura celular.
- A adição sequencial de células permite a criação de modelos complexos e compatíveis com alto rendimento.
- Esses modelos podem ser adaptados para estudar nichos osteogênicos vascularizados.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um modelo sintético in vitro para estudar nichos vasculares da medula óssea.
- Avaliar o impacto de diferentes fatores de crescimento na formação de redes endoteliais.
- Permitir experimentação de alto rendimento com interações celulares definidas.
Métodos Utilizados
- Plaquiação de hBM-MSCs e GFP-HUVECs em hidrogéis de PEG.
- Monitoramento do desenvolvimento do cultivo celular utilizando microscopia de campo claro e fluorescência.
- Quantificação de parâmetros da rede endotelial utilizando análise por ImageJ.
- Avaliação dos efeitos de fatores de crescimento sobre o comportamento celular e formação de rede.
Resultados Principais
- As redes endoteliais se formaram de maneira mais extensa na presença de FGF-2 em comparação com BMP-2.
- Observou-se maior interconectividade com fatores de crescimento do que na ausência deles.
- A análise quantitativa mostrou diferenças significativas no comprimento da rede e nos nós com base na presença de fatores de crescimento.
- O modelo demonstrou com sucesso a capacidade de criar nichos vasculares definidos.
Conclusões
- O modelo desenvolvido é uma ferramenta valiosa para o estudo dos nichos vasculares da medula óssea.
- O semeador celular sequencial aumenta a complexidade dos estudos in vitro.
- Os fatores de crescimento influenciam significativamente o desenvolvimento da rede endotelial.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
Estabelecer um nicho de medula óssea osteogênico vascularizado em um formato de alto rendimento e compatível com imagem preenche uma lacuna crítica na descoberta pré-clínica de fármacos. Esta plataforma de hidrogel de PEG tridimensional permite a investigação controlada de interações celulares e moleculares relevantes para a biologia óssea e da medula, oferecendo confiança preditiva nos estágios iniciais de pipelines oncológicos e de doenças ósseas. Sua reprodutibilidade e quantificabilidade facilitam a validação robusta de alvos e a redução de riscos mecanicistas para o avanço da carteira de projetos.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biotecnologia e Farmacêuticos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite manipulação precisa de componentes celulares e da matriz para validação direcionada de alvos baseada em hipóteses.
- Apóia a redução de riscos mecanicistas ao isolar os efeitos de fatores de crescimento e tipos celulares na formação do nicho vascular.
- Facilita a avaliação funcional das vias osteogênicas e angiogênicas em um contexto tridimensional relevante para a doença.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Oferece um sistema padronizado e reproduzível de co-cultivo tridimensional compatível com imagem de alto conteúdo e quantificação.
- Permite medições robustas e quantitativas de parâmetros de rede vascular e marcadores de diferenciação osteogênica.
- Permite fluxos de trabalho escalonáveis e prontos para automação para triagem de compostos e ensaios fenotípicos.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Modela o microambiente da medula óssea humana para estudos translacionais de interações celulares tumorais e metástase.
- Alinha-se a abordagens baseadas em biomarcadores mediante a quantificação da atividade de FAL e métricas de rede vascular.
- Permite continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica, integrando modelos in vitro em 2D e modelos in vivo.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
Esta plataforma integra-se ao continuum de descoberta a pré-clínico ao permitir testes de hipóteses, triagem quantitativa e modelagem translacional dentro de um único sistema reutilizável.
- Biologia da Descoberta: Permite o isolamento e teste de fatores de crescimento ou tipos celulares específicos para esclarecer os papéis das vias.
- Triagem: Fornece leituras quantitativas e reprodutíveis para desfechos vasculares e osteogênicos, adequadas para análise de alto rendimento.
- Análises: Permite análise e normalização automatizadas de imagens para comparações robustas entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Oferece um modelo relevante para humanos no estudo das interações entre câncer e nicho da medula óssea.
- Reutilização Empresarial: Oferece uma plataforma modular e adaptável para diversos programas de P&D voltados para ossos, medula ou doenças metastáticas.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade biológica na validação de alvos e vias.
- Valor Operacional: Aprimora a padronização, reprodutibilidade e escalabilidade para equipes multilocalizadas e multifuncionais.
- Valor Estratégico: Melhora a qualidade das decisões de avanço ou interrupção do projeto e a eficiência do capital ao fornecer dados robustos e quantificáveis precocemente na fase de desenvolvimento.
- Impacto no Portfólio: Permite a priorização e o avanço ajustados ao risco de candidatos com fundamentos mecanicistas validados.
Considerações de Implementação
- Requer experiência em cultura celular tridimensional, microscopia e análise quantitativa de imagens.
- Necessita de acesso a microscopia de fluorescência, leitores de placas e software analítico compatível (por exemplo, ImageJ).
- Exige padronização entre equipes no fornecimento de células, preparação da matriz e protocolos de quantificação.
- Adaptável a diversos tipos celulares e condições de fatores de crescimento para modelagem específica de doenças.
- As limitações incluem a necessidade de normalização cuidadosa e validação dos algoritmos de quantificação entre diferentes execuções experimentais.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
1:04
Establishing the 3D Stromal Monoculture
2:44
Establishing the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
4:25
Quantifying the Endothelial Cell Network Formation after the 3D Stromal‐Endothelial Cell Co‐Culture
6:53
Assessing the Osteogenic Differentiation of 3D Stromal‐Endothelial Cells by Monitoring the Alkaline Phosphatase Activity
