Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

O objetivo geral deste método é implantar andaimes de transportadores de células humanas em camundongos para criar nichos de medula óssea humanizados e, em seguida, obter imagens ao vivo do comportamento das células humanas dentro dos implantes. Este método ajudará a responder a questões-chave no campo hematopoiético humano, pois permite reproduzir e viver imagens na resolução de uma única célula diferentes componentes da medula óssea. A versatilidade deste sistema é uma de suas principais vantagens, pois permite a implantação de diferentes componentes de nicho um a um ou em combinação.

Essa metodologia pode ser aplicada a outros campos de pesquisa, como metástases tumorais ou estudos de triagem de drogas. Usando a técnica estéril apropriada, comece cortando uma esponja de gelatina esterilizada em 24 pedaços de tamanho semelhante. Reconstituir os scaffolds de gelatina por imersão em etanol e depois em PBS.

Em seguida, passe suavemente cada andaime em um tecido estéril para remover o excesso de líquido e transfira os andaimes para poços individuais de uma placa de 24 poços de fixação ultrabaixa. Usando uma seringa de insulina, injete cuidadosamente uma vez 10 elevado ao quinto a um vezes 10 elevado ao sexto estroma em 50 microlitros de meio de cultura em cada andaime e coloque a placa em uma incubadora de cultura de células. Ao injetar as células no andaime, certifique-se de que não haja vazamento do andaime.

Após uma hora, encha cada poço com três mililitros de meio de cultura de células frescas e devolva os andaimes à incubadora. Após 24 horas, injetar uma vez 10 nas quintas células hematopoiéticas nos andaimes, seguido de incubação e adição adicional de meio e incubação de 24 horas, como acabamos de demonstrar. Para a geração de proteína morfogenética óssea humana recombinante, dois andaimes transportadores, coloque os andaimes reconstituídos em poços individuais de uma placa de 96 poços com fundo em U e adicione cinco microlitros de proteína morfogenética óssea humana recombinante dois a cada andaime.

Em seguida, cubra os andaimes com 20 microlitros de trombina e 20 microlitros de fibrinogênio. Para a implantação cirúrgica dos andaimes de bioengenharia, primeiro raspe a área cirúrgica na parte de trás do camundongo experimental e use uma ponta de algodão embebida em clorexidina diluída para limpar a superfície exposta da pele três vezes em cada direção. Em seguida, use uma pinça estéril e um bisturi para fazer uma incisão anterior a posterior de 0,5 a 0,7 centímetro na pele e insira a pinça sob o tecido subcutâneo para fazer uma bolsa.

Insira o andaime profundamente na bolsa e feche a incisão com cola cirúrgica. Permita que os andaimes implantados se desenvolvam por oito a 24 semanas antes do explante. Após a administração intravenosa de substâncias fluorescentes e eutanásia dos animais, esterilizar a pele como acabamos de demonstrar e fazer uma incisão longitudinal na pele no dorso do animal, próximo ao local de implantação original.

Separe cuidadosamente a pele da bolsa subcutânea onde o andaime foi implantado e, em seguida, use uma pinça para agarrar suavemente o andaime e corte cuidadosamente a membrana residual e os tecidos ao redor do andaime para recuperar a estrutura. Use cola adesiva de ação rápida para prender o andaime a uma placa de Petri de 35 por 10 mililitros. Para a proteína morfogenética óssea, dois scaffolds, antes de preencher a placa com PBS, utilizam uma microbroca cirúrgica sob microscópio microcirúrgico para afinar a superfície óssea, permitindo a visualização dos fluoróforos e a captura em alta resolução das imagens.

Tenha especial cuidado durante o processo de perfuração porque a espessura do osso normalmente varia entre os andaimes e é importante não quebrar a superfície. Encha o prato com PBS em temperatura ambiente. Para imagens de microscopia de 2 fótons dos andaimes de bioengenharia, coloque o andaime no microscópio confocal e selecione a lente de imersão em água 20 vezes 1,0 NA.

Em seguida, no modo de aquisição do software de imagem, selecione a caixa mostrar ferramentas do manual. No menu do laser, ligue o laser de 2 fótons e deixe o laser aquecer e estabilizar. Quando o laser estiver pronto, no menu de configuração de imagem, ative o modo de canal e alterne a faixa a cada quadro.

No menu do caminho da luz, selecione o divisor de máximos não digitalizado e MBS 760 plus. Ative os quatro detectores não escaneados e defina a configuração conforme ilustrado no esquema. No menu de canais, defina o comprimento de onda do laser para 890 nanômetros e a potência para 50%Defina o ganho mestre para 500 a 600, o deslocamento digital para zero e o ganho digital para 15 para cada canal.

No modo de aquisição, defina os parâmetros apropriados para obter imagens de alta resolução sem danificar o tecido e branquear os fluoróforos. Em seguida, defina o zoom para um para a varredura inicial da imagem. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abaixe a lente até que ela toque na solução salina e defina manualmente o foco da lente usando uma lâmpada como fonte de luz.

Agora ative o menu Z-stack e selecione a primeira última função. Defina o intervalo necessário entre duas fatias subseqüenciais e selecione ao vivo para obter uma imagem de uma varredura ao vivo da amostra, ajustando o ganho digital e o deslocamento digital conforme necessário para uma exposição ideal. Para visualizar vários canais ao mesmo tempo, selecione a função de divisão.

No menu do palco, enquanto estiver no modo ao vivo, digitalize a imagem e marque as regiões de interesse, como a localização das cavidades ósseas. Quando a varredura de amostra estiver concluída, vá para a primeira região de interesse e use as funções set first e set last no modo ao vivo para definir a parte superior e inferior da pilha Z 3D ao redor da área de interesse. Em seguida, defina o centro, C, e clique no botão iniciar experimento para iniciar a aquisição de imagem de pilha Z da região de interesse.

Quando a aquisição estiver concluída, salve as imagens na pasta designada e digitalize a próxima região de interesse. Nessas imagens representativas, pode-se observar a morfologia macroscópica de diferentes andaimes recuperados de camundongos NSG imunodeficientes oito semanas após o implante. A co-semeadura com células endoteliais humanas aumenta a vascularização do andaime, enquanto a adição de proteína morfogenética óssea humana recombinante dois induz a formação óssea.

Esses andaimes fotografados por microscopia de 2 fótons ao vivo revelam a presença de vasos sanguíneos nos andaimes e o enxerto de longo prazo das células hematopoiéticas humanas no parênquima do andaime. Scaffolds semeados com células estromais endoteliais e mesenquimais humanas ilustram a participação das células endoteliais humanas na formação de vasos dentro do scaffold, resultando em uma vasculatura quimérica murino-humana. A formação de tecido ósseo pode ser visualizada por microscopia de 2 fótons, assim como a formação de cavidades na vasculatura humanizada no tecido endosteal, que se assemelha muito ao tecido endosteal da medula óssea.

Além disso, na proteína morfogenética óssea humana recombinante dois andaimes transportadores, a morfologia do tecido dentro do andaime se assemelha à medula óssea madura com tecido adiposo, sugerindo que as células estromais mesenquimais humanas também contribuem para a formação do tecido adiposo. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de todos os bioengenheiros e dos principais andaimes murinos. Lembre-se sempre de manter um ambiente ascético e tome cuidado extra ao manusear andaimes.

Tenha em mente as limitações associadas a este método, como quimeras humano-camundongo dos tecidos. Lembre-se de que, após a imagem, as amostras podem ser usadas para estudos posteriores, pois os andaimes podem ser digeridos e, portanto, células vivas podem ser recuperadas deles.