Bioengenharia de microrganismos humanizados de medula óssea no mouse e sua visualização por imagem ao vivo

O objetivo geral deste método é implantar scaffolds carregadores de células humanas em camundongos para criar nichos de medula óssea humanizados e, em seguida, obter imagens em tempo real do comportamento das células humanas dentro dos implantes. Este método ajudará a responder perguntas-chave na área da hematopoiese humana, pois permite reproduzir e visualizar em tempo real, com resolução de célula única, diferentes componentes da medula óssea. A versatilidade deste sistema é uma de suas principais vantagens, pois permite a implantação de diferentes componentes do nicho separadamente ou em combinação.

Essa metodologia poderia potencialmente ser aplicada a outras áreas de pesquisa, como estudos de metástase tumoral ou triagem de fármacos. Utilizando a técnica asséptica apropriada, comece cortando uma esponja de gelatina esterilizada em 24 pedaços de tamanho semelhante. Reconstitua as estruturas de gelatina por imersão em etanol e, em seguida, em PBS.

Em seguida, tamponar suavemente cada suporte em um tecido estéril para remover o excesso de líquido e transferir os suportes para poços individuais de uma placa de 24 poços com aderência ultrabaixa. Usando uma seringa de insulina, injetar cuidadosamente de um vezes 10 à quinta até um vezes 10 à sexta células estromais em 50 microlitros de meio de cultura em cada suporte e colocar a placa em um incubador de cultura celular. Ao injetar as células no suporte, certifique-se de que não haja vazamento para fora do suporte.

Após uma hora, preencha cada poço com três mililitros de meio fresco de cultura celular e devolva as estruturas ao incubador. Após 24 horas, injete uma vez 10 à quinta potência de células hematopoiéticas nas estruturas, seguido por incubação e adição adicional de meio, e incubação de 24 horas conforme acabou de ser demonstrado. Para a geração de estruturas carreadoras de proteína morfogenética óssea humana recombinante dois, coloque as estruturas reconstituídas em poços individuais de uma placa de 96 poços com fundo em U e adicione cinco microlitros de proteína morfogenética óssea humana recombinante dois a cada estrutura.

Em seguida, cubra as estruturas com 20 microlitros de trombina e 20 microlitros de fibrinogênio. Para a implantação cirúrgica das estruturas bioengenheiradas, primeiro retire os pelos da área cirúrgica nas costas do camundongo experimental e use uma haste flexível embebida em clorexidina diluída para limpar a superfície da pele exposta três vezes em cada direção. A seguir, utilize pinça estéril e bisturi para fazer uma incisão de 0,5 a 0,7 centímetro de anterior para posterior na pele e insira a pinça sob o tecido subcutâneo para criar um bolso.

Insira o suporte profundamente no bolso e feche a incisão com cola cirúrgica. Deixe os suportes implantados se desenvolverem por oito a 24 semanas antes da retirada. Após a administração intravenosa de substâncias fluorescentes e eutanásia dos animais, esterilize a pele conforme acabou de ser demonstrado e faça uma incisão longitudinal na pele do dorso do animal, próxima ao local original de implantação.

Se pare cuidadosamente a pele do bolso subcutâneo onde a estrutura foi implantada, em seguida use pinças para segurar suavemente a estrutura e corte com cuidado a membrana residual e os tecidos ao redor da estrutura para recuperar a mesma. Use cola adesiva de ação rápida para fixar a estrutura a uma placa de Petri de 35 por 10 mililitros. Para estruturas com proteína morfogenética óssea dois, antes de preencher a placa com PBS, use uma microfresa cirúrgica sob microscópio microcirúrgico para afinar a superfície óssea, permitindo a visualização dos fluoróforos e a aquisição de imagens com alta resolução.

Seja particularmente cuidadoso durante o processo de perfuração, pois a espessura do osso geralmente varia entre os suportes, e é importante não romper a superfície. Encha o recipiente com PBS à temperatura ambiente. Para a imagem de microscopia de 2 fótons dos suportes bioengenheirados, coloque o suporte sobre a platina do microscópio confocal e selecione a lente de imersão em água de 20 vezes com abertura numérica 1,0.

Em seguida, no modo de aquisição do software de imagem, selecione a caixa mostrar ferramentas manuais. No menu do laser, ligue o laser de 2 fótons e aguarde o aquecimento e estabilização do laser. Quando o laser estiver pronto, no menu de configuração de imagem, ative o modo de canal e alterne faixa a cada quadro.

No menu do caminho óptico, selecione não varrido e o divisor de feixe principal MBS 760 plus. Ative os quatro detectores não varridos e configure a configuração conforme ilustrado no esquema. No menu de canais, defina o comprimento de onda do laser para 890 nanômetros e a potência para 50%. Defina o ganho principal entre 500 e 600, o deslocamento digital para zero e o ganho digital para 15 em cada canal.

No modo de aquisição, defina os parâmetros apropriados para obter imagens de alta resolução sem danificar o tecido e sem blear os fluoróforos. Em seguida, ajuste o zoom para um para a varredura inicial da imagem. Quando todos os parâmetros tiverem sido definidos, abaixe a lente até que ela toque a solução salina e defina manualmente o foco da lente usando uma lâmpada como fonte de luz.

Agora, ative o menu Z-stack e selecione a função primeiro-último. Defina o intervalo necessário entre duas fatias subsequentes e selecione live para obter uma varredura em tempo real da amostra, ajustando o ganho digital e o deslocamento digital conforme necessário para uma exposição ideal. Para visualizar múltiplos canais simultaneamente, selecione a função split.

No menu de estágios, enquanto estiver no modo ao vivo, escaneie a imagem e marque as regiões de interesse, como a localização das cavidades ósseas. Quando a varredura da amostra estiver concluída, desloque-se até a primeira região de interesse e utilize as funções definir primeiro e definir último no modo ao vivo para ajustar o topo e a base da pilha tridimensional em Z ao redor da área de interesse. Em seguida, defina o centro, C, e clique no botão iniciar experimento para começar a aquisição de imagens em pilha Z da região de interesse.

Quando a aquisição estiver concluída, salve as imagens na pasta designada e digitalize a próxima região de interesse. Nessas imagens representativas, pode-se observar a morfologia macroscópica de diferentes scaffolds recuperados de camundongos NSG imunodeficientes oito semanas após o implante. A semeadura conjunta com células endoteliais humanas aumenta a vascularização do scaffold, enquanto a adição da proteína morfogenética óssea humana recombinante dois induz a formação óssea.

Essas estruturas visualizadas por microscopia vital de dois fótons revelam a presença de vasos sanguíneos nas estruturas e a enxertia de longo prazo das células hematopoiéticas humanas no parênquima da estrutura. Estruturas semeadas com células endoteliais humanas e células estromais mesenquimais ilustram a participação das células endoteliais humanas na formação de vasos dentro da estrutura, resultando em uma vasculatura quimérica murino-humana. A formação de tecido ósseo pode ser visualizada por microscopia de dois fótons, bem como a formação de cavidades na vasculatura humanizada no tecido endosteal, que se assemelha muito ao tecido endosteal da medula óssea.

Além disso, em scaffolds portadores de proteína morfogenética óssea humana recombinante dois, a morfologia do tecido dentro do scaffold assemelha-se à medula óssea madura com tecido adiposo, sugerindo que as células estromais mesenquimais humanas também contribuem para a formação do tecido adiposo. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de toda a engenharia biológica e dos principais scaffolds murinos. Lembre-se sempre de manter um ambiente asséptico e tenha cuidado extra ao manipular os scaffolds.

Leve em consideração as limitações associadas a este método, como os quimeras humano-murinos dos tecidos. Lembre-se de que, após a obtenção de imagens, as amostras podem ser utilizadas para estudos adicionais, já que as estruturas podem ser digeridas e, portanto, células vivas podem ser recuperadas delas.