Método otimizado para cultivo e bioaumento microbiano de Typha latifolia (taboa)

Nosso trabalho resolve a falta de protocolos para cultivar taboa-de-gato a partir de sementes. Desenvolvemos métodos reprodutíveis para germinação de sementes, crescimento precoce e bio-aumento microbiano para apoiar futuras pesquisas de microrganismos vegetais. Poucos estudos cultivam taboa-de-gato desde sementes ou as acompanham até a maturidade, mas taboa-de-gato são comumente usadas em pesquisas de remediação de áreas úmidas.

A maior parte das pesquisas sobre taboas-de-gata envolve a compra de rizomas para propagação de taboas em estudos laboratoriais. Poucos estudos cultivam taboa a partir de sementes, não deixando métodos padronizados. Alcançar a germinação consistente e a colonização persistente dos microrganismos introduzidos tem sido um grande desafio.

Desenvolvemos métodos reprodutíveis para germinação de sementes e bio-aumento microbiano, demonstrando como a inoculação precoce ajuda a apoiar a colonização a longo prazo. Para começar, use tesouras de jardim para cortar o caule de uma planta de Typha latifolia aproximadamente dois centímetros da base da inflorescência. Retire as sementes da inflorescência, transfira para um liquidificador de laboratório até que o liquidificador esteja aproximadamente 1/4 de cheio, correspondendo a cerca de 250 mililitros de sementes não compactadas.

Agora encha o liquidificador com 500 mililitros de água da torneira, garantindo que mantenha uma altura de 10 centímetros. Misture a mistura em velocidade média-baixa por 20 segundos e imediatamente transfira o conteúdo viscoso para um béquer de um litro. Transfira aproximadamente 100 mililitros da mistura de água de sementes de volta para o liquidificador.

Depois, adicione de 400 a 600 mililitros de água fresca da torneira e bata em velocidade média-alta por 20 segundos. Despeje o conteúdo em um béquer fresco de um litro. Agora encha o béquer com água da torneira até 800 mililitros.

Depois de deixar repousar por 60 segundos, retire a lama flutuante do topo sem mexer nas sementes que assentaram no fundo. Lentamente despeje o restante da água e transfira as sementes para um béquer de 100 mililitros. Repita o processo de mistura para o restante da lama de água da semente. Em seguida, coloque o béquer contendo as sementes separadas em uma placa de mexer.

Após mexer, retire qualquer material vegetal flutuante da superfície do béquer. Despeje as sementes em um funil Buchner com papel filtro preso a um vácuo e deixe-as secar durante a noite. Armazene as sementes secas a 20 graus Celsius em tubos cônicos de polipropileno de 50 mililitros.

Prepare placas de meio grau Murashige e Skoog com 1% de fago de agar. Transfira aproximadamente um miligrama das sementes secas para um tubo cônico de polipropileno de 15 mililitros. Depois, adicione 10 mililitros de água estéril dupla destilada ao tubo.

Coloque o tubo sobre um agitador orbital em velocidade média-alta por 10 minutos. Agora retire a água do tubo e adicione cinco mililitros de solução de polisorbato 20 0,1% preparada em água estéril dupla destilada. Agite o tubo em velocidade média-alta por 10 minutos.

Remova a solução de polissorbato 20. Realize todos os passos seguintes diante de um exaustor de chama ou de fluxo laminar. Substitua a solução por cinco mililitros de água sanitária comercial a 30% e solução de polissorbato 20 a 0,025% preparados em água estéril dupla destilada.

Substitua o sobrenadante por água estéril dupla destilada. Depois, agite o tubo em velocidade média-alta por cinco minutos. Após o terceiro enxágue, gire o tubo em baixa velocidade por 24 horas para induzir a germinação.

No dia seguinte, remova o excesso de água e garanta que três mililitros de líquido permaneçam no tubo. Agora, assépticamente, corte a ponta de uma pipeta plástica de 1000 microlitros. Use a ponta da pipeta cortada para pipetar vigorosamente e suspender as sementes dentro da ponta.

Coloque as sementes e o líquido em placas de ágar Murashige e Skoog de metade da força. Gire suavemente o prato para distribuir as sementes de forma uniforme. Envolva as placas com filme de selagem de laboratório e depois coloque-as em uma câmara de crescimento com um ciclo de luz de 16 horas e um ciclo de escuridão de 8 horas a 23 graus Celsius e 70% de umidade.

Para inocular sementes de taboa, esterilize as sementes com alvejante polisorbato 20 e água duplamente destilada, como demonstrado. Meça a densidade óptica de uma cultura noturna de isolado de Luteimonas a 600 nanômetros. Normalize a cultura para um valor de absorção de 1,0 diluindo no meio de cultura.

Agora centrifuge um mililitro da cultura a 9.300 G Por dois minutos. Remova o sobrenadante e resuspenda o pellet em um mililitro de PBS. Após centrifugar e remover novamente o sobrenadante, ressuspenda o pellet bacteriano em um mililitro de água estéril duplamente destilada.

Use sementes esterilizadas, depois dilua o inóculo em uma diluição de um a dez com 0,025% de surfactante organosilicona no mesmo tubo. Agite a suspensão em baixa velocidade por 24 horas antes da germinação das sementes. Comece preenchendo uma unidade de câmara de crescimento vegetal estéril com um solo de sua escolha pré-molhado com água da torneira.

Cubra a ponta do Luer lock com papel alumínio e faça autoclave na unidade em um ciclo líquido por 20 minutos. Em seguida, em condições estéreis, acopla uma unidade de filtro de 0,2 micrômetro ao conector Luer lock na câmara de crescimento. Abra a câmara e adicione 500 microlitros de fertilizante esterilizado com filtro 1%20 por 20 por 20 ao solo.

Misture o solo com uma espátula estéril enquanto adiciona água estéril dupla destilada para manter a hidratação sem saturar demais o solo. Agora, use uma lâmina de barbear estéril para cortar ágar Murashige e Skoog de placas contendo uma muda velha e fracas em quartos. Com uma espátula estéril, transfira uma seção de ágar com a muda para o solo preparado na câmara de crescimento.

Transfira a unidade da câmara de crescimento para uma incubadora de plantas ajustada para um ciclo de luz de 16 horas e 8 horas de escuridão a 23 graus Celsius e 70% de umidade. A escarificação completa das sementes de Typha resultou em componentes visivelmente separados, enquanto a escarificação incompleta deixou o bico preso e as sementes não escarificadas permaneceram intactas. O sistema hidropônico estéril demonstrou apoiar o crescimento de espécies de taboa-de-gato e juncus, aqui imaginadas como Juncus, que foram mantidas dentro do sistema estéril por até um ano.

A maior taxa de germinação de sementes, de 20,8%, foi observada usando o método de 30% de água sanitária e polissorbato 20, o que foi significativamente maior do que todos os outros tratamentos de esterilização, exceto o método de gás cloro de 1 hora, que não conseguiu alcançar a esterilização completa das sementes. Sete dias após a escarificação, as mudas germinantes de Typha desenvolveram radicais visíveis e tecido germinativo no ambiente de placas de Petri não estéreis. Após o transplante para o solo, um subconjunto das mudas de Typha se estabeleceu com sucesso e produziu novo tecido de brotos em uma a duas semanas.

Após a inoculação com espécies de Luteimonas portadoras de plasmídeo DsRed, a colonização bacteriana fluorescente vermelha foi observada em todas as raízes das mudas de Typha aos 16 dias após a inoculação.