Name: Estratégia de interferência dupla de CRISPR para direcionar interações letais sintéticas entre RNAs não codificantes em células cancerígenas (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-05-30T13:00:00.000+00:00
Duration: 7 min 23 s
Description: Aprenda a usar o sistema CRISPRi duplo para repressão combinada de lncRNAs em células de melanoma. Este método identifica interações letais sintéticas para estratégias terapêuticas contra o câncer.

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Embora menos de 3% do genoma humano codifique proteínas, aproximadamente 80% do genoma é transcrito 1,2. Entre as unidades transcricionais não codificantes, dezenas de milhares são classificadas como RNAs não codificantes longos (lncRNAs) excedendo 200 nucleotídeos, e estima-se que o número total de lncRNAs humanos exceda 100.000 3,4. Em contraste com os genes codificantes, os lncRNAs são menos conservados entre as espécies. Dado que os humanos compartilham 99% de seu genoma com primatas como os chimpanzés, acredita-se que os lncRNAs tenham uma influência muito maior na evolução fenotípica 5,6. Esses achados indicam importantes funções celulares dos lncRNAs. Embora a regulação dos lncRNAs e suas interações com proteínas de ligação ao RNA e outros RNAs permaneçam incompletamente compreendidas, e muitos lncRNAs ainda não tenham sido totalmente anotados, é claro que os lncRNAs exibem padrões de expressão específicos de células e tecidos na saúde e na doença, como o câncer 7,8,9,10. Eles estão implicados em diversas funções, incluindo regulação da transcrição gênica, envolvimento nas interações da cromatina11, processamento de RNA12, estabilização de RNA13 e regulação da tradução14.
No câncer, lncRNAs específicos de tipos de células altamente diversos influenciam o desenvolvimento e a metástase do tumor, regulando a expressão gênica, destacando seu potencial como alvos terapêuticos valiosos15. Além da detecção de lncRNAs como biomarcadores em amostras de tumor16, direcionar lncRNAs específicos do tumor para interromper suas funções a jusante tem um potencial significativo em aplicações clínicas e pesquisa básica. As abordagens baseadas em RNA para elucidar os papéis dos lncRNAs incluem oligonucleotídeos antisense (ASOs), RNAs em grampo curto e pequenos RNAs interferentes (siRNAs) 17 , 18 . Enquanto o siRNA é comumente utilizado para telas de silenciamento de genes, o knockdown baseado em siRNA é restrito ao citoplasma19. No entanto, o lncRNA freqüentemente opera dentro do núcleo.
Alternativamente, a interferência de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPRi) pode ser usada para inibir lncRNAs em cânceres humanos20. Além disso, as telas CRISPRi em todo o genoma podem ser facilmente programadas e direcionadas a uma ampla gama de genes codificantes e não codificantes para examinar seu impacto funcional21,22. No CRISPRi, um Cas9 deficiente catalítico (dCas9) é fundido a um domínio repressor transcricional, como o domínio da caixa associada a Krüppel (KRAB)23. A repressão gênica por dCas9-KRAB é guiada por um RNA guia (gRNA) para a região de interesse. O CRISPRi controla genes nos níveis de DNA, levando a uma maior eficiência e fenótipos de perda de função desejados em contraste com a interferência do RNA, que é ativa no nível pós-transcricional24. Em resposta à eficácia limitada do KRAB no silenciamento de alvos, uma fusão de KRAB e MeCP2 com dCas9 foi introduzida como uma estratégia de repressão mais eficaz25.
Embora o silenciamento de um único gene possa afetar a viabilidade do câncer, interações letais duplas ou múltiplas sintéticas podem resgatar células cancerígenas da morte celular26. A letalidade sintética envolve dois ou mais genes, cada um dos quais pode compensar a função do outro. Para superar problemas com telas de knockdown de gene único, estratégias CRISPR duplas direcionadas a pares de genes codificadores de proteínas letais oferecem uma abordagem promissora27.
Aqui, apresentamos um protocolo para o uso combinatório de direcionamento ortogonal baseado em CRISPRi de lncRNA ou outros pares de RNA não codificantes usando Staphylococcus aureus e Streptococcus pyogenes dCas9 fundidos a KRAB-MeCP2 em células de melanoma humano (ver Figura 1). O protocolo pode ser utilizado para knockdown CRISPR clássico combinatório ou como triagem baseada em CRISPRi de pares letais sintéticos no câncer. O uso de duas espécies diferentes de dCas9, SpCas9 e SaCas9, na abordagem CRISPRi permite o direcionamento independente de loci genômicos distintos com reatividade cruzada mínima, aumentando a especificidade e a flexibilidade, garantindo uma alta seletividade no alvo. Diferentes motivos adjacentes ao protoespaçador (PAMs) são utilizados: NGG para SpCas9 e NNGRRT para SaCas9. O sistema dCas9 duplo aborda desafios como compatibilidade limitada de sgRNA, permitindo modulação precisa e simultânea e reduzindo a competição do complexo sgRNA-RNP ao usar um único tipo de dCas9. Essa inovação melhora a robustez e a versatilidade da triagem de biblioteca de sgRNA dupla. Em conclusão, fornecemos um sistema CRISPRi duplo totalmente funcional em células de melanoma como um modelo de câncer.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig01.jpg"> 
Figura 1: Esquema do sistema CRISPRi duplo para direcionar interações letais sintéticas de RNAs não codificantes. (A) Procedimento de clonagem do vetor duplo de gRNA. (B) As células HEK293 foram transfectadas com plasmídeo de envelope VSV-G, plasmídeo de empacotamento PAX2 e vetor de transferência para produzir lentivírus para posterior transdução em células 501-mel. Lentivírus contendo a informação genética para SpdCas9-KRAB-MeCP2 (azul) e SadCas9-KRAB-MeCP2 (vermelho) foram integrados em células 501-mel simultaneamente. Após a seleção do antibiótico, uma segunda transdução lentiviral foi realizada para integrar os gRNAs duplos desejados (verde oliva). (C) As células 501-mel que expressam as variantes dCas9 interagem com seus gRNAs correspondentes para silenciar a expressão do gene alvo, resultando na morte das células cancerígenas. Criado com BioRender.com. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig01large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>

<table><tbody><tr><td>Filtro Ultra Centrífugo Amicon, 100 kDa MWCO</td><td>Millipore</td><td>UFC910024</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. aureus) (6H4) anticorpo monoclonal de camundongo</td><td>Tecnologia de Sinalização Celular</td><td>48989</td><td></td></tr><tr><td>anti-Cas9 (S. pyogenes) (7A9-3A3) anticorpo monoclonal</td> Tecnologia <td>de Sinalização Celular</td><td>14697</td><td></td></tr><tr><td>anticorpo monoclonal de camundongo anti-GAPDH&nbsp;</td><td>Sigma Aldrich</td><td>G8795</td><td></td></tr><tr><td>Anti-Mouse IgG (molécula inteira)&ndash; Anticorpo peroxidase produzido em coelho</td><td>Sigma Aldrich</td><td>A9044</td><td></td></tr><tr><td>Bio-Rad ChemiDoc MP Imaging System&nbsp;</td>Cloridrato de Blasticidina S <td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td></td><td>Sigma Aldrich</td><td>15205-25MG</td><td></td></tr><tr><td>CellTiter-Glo Ensaio de Viabilidade de Célula Luminescente</td><td>Promega</td><td>G7570</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga</td><td>Eppendorf</td><td>5804R</td><td></td></tr><tr><td></td><td>Eppendorf</td><td>5415R</td><td></td></tr><tr><td>CFX Connect Sistema de Detecção de PCR em Tempo Real</td><td>Bio-Rad</td><td></td><td></td></tr><tr><td>Substrato Clarity Western ECL, 500 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>1705061</td><td></td></tr><tr><td>CO2 Incubadora Modelo CB 170</td><td>Binder</td><td></td><td></td></tr><tr><td>cOmplete Protease Inhibitor Cocktail</td><td>Enzima de</td> restrição <td>Roche 11697498001</td><td></td></tr><tr><td>Esp3I (BsmB1)</td><td>Thermo Scientific</td><td>ER0451</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 10 mL Pipeta sorológica</td><td>Corning</td><td>356551</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 25 mL Pipeta Sorológica</td><td>Corning</td><td>357525</td><td></td></tr><tr><td>Falcon 5 mL Pipeta Sorológica</td><td>Corning</td><td>356543</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Sigma Aldrich</td><td>F9665-500ML</td><td></td></tr><tr><td>Gibco Dulbecco' s Águia modificada' s meio (DMEM), glicose alta, piruvato</td><td>Gibco</td><td>41966029</td><td></td></tr><tr><td>A linha celular de melanoma humano 501-mel</td><td>foi gentilmente fornecida pelo Aifantis Lab (Universidade de Nova York)</td><td>RRID: CVCL_4633</td><td></td></tr><tr><td>Immobilon -P PVDF Membrane</td><td>Millipore</td><td>IPVH00010</td><td></td></tr><tr><td>Lenti-X 293T HEK linha celular</td><td>Takara Bio</td><td>632180</td><td></td></tr><tr><td>Mini Trans-Blot Cell system&nbsp;</td>Sistema de Montagem de DNA de Alta Fidelidade <td>Bio-Rad</td> Mini-PROTEAN Mini-PROTEAN Bio-Rad <td></td><td></td></tr><tr><td></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA&nbsp;</td><td>New England Biolabs</td><td>E2621</td><td></td></tr><tr><td>Leite em pó desnatado&nbsp;</td><td>Biomol</td><td>54650</td><td></td></tr><tr><td>NuPAGE LDS Tampão de amostra (4x)</td><td>Invitrogen</td><td>NP0008</td><td></td></tr><tr><td>One Shot Stbl E. coli quimicamente competente</td><td>Invitrogen</td><td>C737303</td><td></td></tr><tr><td>Opti-MEM I Tubo</td><td>de PCR de 31985062</td><td>Gibco</td> de <td></td></tr> soro reduzido <tr><td>0,5 ml (tampa plana)</td><td>VWR International</td><td>732-3207</td><td></td></tr> Solução <tr><td>salina tamponada com fosfato (PBS)</td><td>Corning</td><td>45000-446</td><td></td></tr><tr><td>Phusion PCR de Alta Fidelidade Master Mix com Buffer HF</td><td>Kit</td> de Ensaio de Proteína <td>BCA Pierce F531L</td><td></td>da Thermo</tr><tr><td>Scientific&nbsp;</td><td>Polietileno Thermo Scientific</td><td>23225</td><td></td></tr><tr><td>Polybrene</td><td>Sigma Aldrich</td><td>TR-1003-G</td><td></td></tr><tr><td>Polietilenimina,</td> dicloridrato <td>de Puromicina Sigma Aldrich</td><td>408727</td><td></td>ramificado</tr><tr><td></td><td>Santa Cruz Biotechnology</td><td>sc-108071A</td><td></td></tr><tr><td>QIAquick PCR Kit de Purificação&nbsp;</td>Tubo de Microcentrífuga <td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>SafeSeal 1.5 mL</td><td>Sarstedt</td><td>72,706</td><td></td></tr><tr><td>Cloreto de sódio, solução Aqua 5 M,</td><td>Alfa Aesar</td><td>livre de</td> RNase J60434.AE <td></td></tr><tr><td>Dodecil Sulfato de Sódio (SDS)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>L3771</td><td></td></tr><tr><td>Filtro de Seringa PES 33mm 0.2 &mu; M</td><td>Fisher Scientific</td><td>15206869</td><td></td></tr><tr><td>TC Prato 100, Padrão</td><td>Sarstedt</td><td>8,33,902</td><td></td></tr><tr><td>TC Placa 6 Poço, Padrão, F</td><td>Sarstedt</td><td>83,39,20,005</td><td></td></tr><tr><td>Base Tris</td><td>Roche</td><td>10708976001</td><td></td></tr><tr><td>TWEEN 20</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P9416-50ML</td><td></td></tr></tbody></table>

estratégia de interferência dupla de crispr para direcionar interações letais sintéticas entre rnas não codificantes em células cancerígenas

Dual CRISPR-Interference Strategy for Targeting Synthetic Lethal Interactions Between Non-Coding RNAs in Cancer Cells

Os de expressão de SadCas9-KRAB-MeCP2 e SpdCas9-KRAB-MeCP2 foram integrados em células 501-mel simultaneamente usando transdução com quantidades iguais de lentivírus. Como este protocolo CRISPRi depende da expressão de variantes dCas9-KRAB-MeCP2, a análise de Western blot é ideal para confirmar sua presença no nível da proteína. Após o enriquecimento das células transfectadas positivamente, amostras foram coletadas para análise de Western blot para confirmar a presença dos ortólogos dCas9-KRAB-MeCP2. Após a transdução bem-sucedida, uma única banda correspondente à proteína de fusão SpdCas9-KRAB-MeCP2 (202 kDa) e à proteína de fusão SadCas9-KRAB-MeCP2 (170 kDa) é esperada e foi confirmada, conforme mostrado na Figura 2A, usando anticorpos específicos para os respectivos ortólogos Cas9. No entanto, se o Western blot não for viável, a qPCR pode ser usada para verificar as proteínas de fusão no nível do mRNA.
Uma vez que as células 501-mel expressando de forma estável os repressores funcionais foram geradas, a segunda transdução lentiviral foi realizada usando um vetor gRNA duplo. RP11 e XLOC foram previamente mostrados como regulados positivamente em culturas de melanoma metastático de curto prazo, e o direcionamento individual de CRISPRi demonstrou seu impacto na proliferação e sobrevivência celular28. Assim, selecionamos este par de lncRNA para avaliação como uma combinação de RNA não codificante letal sintético de prova de conceito, antecipando um fenótipo de crescimento cumulativo e facilmente observável nas células modificadas.
Para investigar os efeitos do CRISPRi duplo em células cancerígenas usando ensaios de viabilidade, ambos os lncRNAs direcionados devem ser efetivamente reprimidos. qPCR é o método mais adequado para confirmar essa repressão medindo seus níveis de transcrição. Avaliamos a funcionalidade do protocolo CRISPRi duplo desenvolvido determinando os níveis de RNA e examinando a viabilidade celular ao direcionar o par RP11 e XLOC potencialmente letal. Portanto, diferentes gRNAs direcionados a RP11 e XLOC foram introduzidos para reduzir os níveis de RNA alvo. A repressão do RNA foi investigada usando gRNAs específicos do alvo para SadCas9-KRAB-MeCP2 ou SpdCas9-KRAB-MeCP2, testados individualmente e em combinação com um gRNA de controle direcionado a Rosa26 (ver Figura 2B). Embora os gRNAs direcionados a XLOC ou RP11 individualmente tenham suprimido efetivamente seus respectivos alvos, o knockdown simultâneo de XLOC e RP11 foi alcançado apenas com o par XLOC-sa / RP11-sp.
Como os níveis de RNA XLOC e RP11 foram reduzidos com sucesso na linha celular 501-mel com o par de gRNA XLOC-sa / RP11-sp selecionado, foi realizado um ensaio de viabilidade de repressão de lncRNA duplo (ver Figura 2C). Após 5 dias, a viabilidade celular foi de 81% e 89% do controle Rosa26 quando os gRNAs alvo foram usados individualmente. A combinação de RP11-sp e XLOC-sa resultou em uma redução significativa adicional em comparação com RP11-sp sozinho, com viabilidade celular em 59% do controle Rosa26.
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/67752/67752fig02.jpg"> 
Figura 2: Funcionalidade do sistema de repressão de lncRNA duplo. (A) A análise de Western blot foi realizada para detectar as variantes dCas9-KRAB-MeCP2 em células 501-mel modificadas usando anticorpos anti-Cas9. Células do tipo selvagem (WT) 501-mel sem transdução foram usadas como controle (ver Figura Suplementar 3, Figura Suplementar 4, Figura Suplementar 5, Figura Suplementar 6 para o blot bruto). (B) análise baseada em qPCR dos níveis de RNA RP11 e XLOC em relação às células de controle Rosa26 após a transdução de gRNAs duplos em células 501-mel modificadas. O GAPDH foi usado como o gene de limpeza. Os dados são expressos como ± média SD. (C) O ensaio de viabilidade de repressão de lncRNA duplo foi realizado após a integração de gRNAs duplos em células 501-mel modificadas em três transduções independentes. Os valores de luminescência foram normalizados para o controle Rosa26. Os resultados de viabilidade são expressos como a média (n = 3) ± EPM. Foi realizado um teste t não pareado. Asterisco (*) indica uma diferença significativa em p &lt; 0,05. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/67752fig02large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
Figura suplementar 1: Mapa de plasmídeo. O mapa foi criado com Benchling (https://benchling.com/). Os plasmídeos utilizados no protocolo foram modificados a partir de Addgene #96921 e #110824. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%201.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura Suplementar 2: Figura Suplementar 2: Análise de Western blot de Expressão dCas9-KRAB. (A) Expressão de SadCas9-KRAB em células 501-mel 6 dias após a transfecção. (B) A transdução sequencial de SadCas9-KRAB e SpdCas9-KRAB em células 501-mel levou à redução da expressão de SadCas9-KRAB 3 semanas após a transfecção. (C) A transdução simultânea de SadCas9-KRAB e SpdCas9-KRAB em células 501-mel resultou em expressão reduzida de SadCas9-KRAB 3 semanas após a transfecção. (D) A expressão de SpdCas9-KRAB pode ser observada após a transdução simultânea de SadCas9-KRAB e SpdCas9-KRAB. LV. O volume de lentivírus usado em μL. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%202.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 3: Dados brutos Western blot SaCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%203_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura suplementar 4: Dados brutos de Western blot SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%204_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 5 suplementar: Dados brutos GAPDH_SpCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%205_GAPDH_SpCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Figura 6 suplementar: Dados brutos GAPDH_SaCas9-KRAB. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Figure%206_GAPDH_SaCas9-KRAB%20raw%20data.tif" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 1: Sequências de RNA guia utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%201_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Tabela Suplementar 2: Sequências de DNA utilizadas. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Table%202_RE.xlsx" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo suplementar 1: Arquivo FASTA de dual-grna-zeo-gfp. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%201_dual-grna-zeo-gfp.fasta" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 2: Arquivo FASTA de dSpCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%202_dSpCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>
Arquivo Suplementar 3: Arquivo FASTA de dSaCas9-krab-mecp2. <a href="https://www.jove.com/files/ftp_upload/67752/Supplementary%20Data%203_dSaCas9-krab-mecp2.fasta" target="_blank">Clique aqui para baixar este arquivo.</a>

Estratégia de interferência dupla de CRISPR para direcionar interações letais sintéticas entre RNAs não codificantes em células cancerígenas

Long non-coding RNAs (lncRNAs) represent a vast and functionally diverse class of RNA molecules, with over 100,000 predicted in the human genome. Although ...

dual-crispr-interference-strategy-for-targeting-synthetic-lethal

Research

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Genetics

Genética

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Estratégia de interferência dupla de CRISPR para direcionar interações letais sintéticas entre RNAs não codificantes em células cancerígenas (Vídeo) | JoVE Journal

Estratégia de interferência dupla de CRISPR para direcionar interações letais sintéticas entre RNAs não codificantes em células cancerígenas

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