Estratégia de interferência dupla de CRISPR para direcionar interações letais sintéticas entre RNAs não codificantes em células cancerígenas

Nosso objetivo é identificar sistematicamente e direcionar terapeuticamente hubs de rede críticos com foco em RNAs não codificantes no câncer. O desafio experimental atual de nossa abordagem reside na capacidade combinatória necessária para gerar e rastrear um grande número de genes em paralelo. Nosso objetivo é abrir caminho para a identificação de novos alvos combinatórios de RNA não codificante ou estruturas drogáveis para contornar a resistência e o escape terapêutico.

No futuro, traduziremos essa ferramenta de prova de conceito em esforços de triagem de bibliotecas combinatórias em larga escala, potencialmente em combinação com proteínas de ligação a RNA, tanto in vitro quanto in vivo. Para começar, conte as células Lenti-X 293T HEK usando o corante azul de tripano em um hemocitômetro. Placa 4 vezes 10 elevado a 6 células Lenti-X 293T HEK por placa de 10 centímetros e incube para atingir aproximadamente 80% de confluência no dia seguinte.

A partir desta etapa, trabalhe em um laboratório de classe 2. Misture 500 microlitros de um meio de transfecção adequado com vetor de transferência, plasmídeo de envelope e vetor pPAX2. Incube a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente.

Em um tubo separado, misture 500 microlitros de meio de soro reduzido com 36 microlitros de reagente PEI na concentração de 1 miligrama por mililitro. Incube a mistura por cinco minutos em temperatura ambiente. Combine as duas misturas e incube por 15 minutos em temperatura ambiente.

Agora, com cuidado, gota a gota, adicione a mistura ao meio celular contendo seis mililitros e incube durante a noite a 37 graus Celsius em 5% de dióxido de carbono. Após 12 a 15 horas, descarte o meio em um frasco de resíduos autoclavável usando uma pipeta sorológica. Enxágue os consumíveis, incluindo pipetas sorológicas e pontas de pipeta, com uma solução desinfetante antes de descartá-los no lixo da autoclave.

Adicione cinco mililitros de DMEM fresco às células transfectadas usando uma nova pipeta. Para colher lentivírus, transfira o sobrenadante usando uma pipeta sorológica para um tubo canônico de 50 mililitros, 48 horas após a transfecção. Em seguida, adicione 5 mililitros de meio fresco às células e incube-as por mais 24 horas.

Guarde o tubo na geladeira. Após a incubação, repita a coleta de lentivírus e combine-a com a amostra coletada anteriormente. Após a terceira colheita, armazene sobrenadantes combinados de todas as três colheitas a quatro graus Celsius até a filtração e centrifugação.

Centrifugue o sobrenadante combinado por 5 minutos a 500 G e 4 graus Celsius em recipientes e rotores estanques a aerossóis aprovados para organismos do Grupo de Risco 2 e, em seguida, filtre o sobrenadante por meio de filtros de seringa de grau de cultura de células estéreis de 0,2 micrômetro. Concentrar o sobrenadante filtrado a 1000 g e quatro graus Celsius utilizando uma unidade de filtro centrífugo com um limite de 100 kilodalton de peso molecular para aproximadamente 500 microlitros. Armazene alíquotas de vírus de 50 a 100 microlitros a 80 graus Celsius negativos até uso posterior.

Placa de células 501-mel em uma placa de seis poços a 2 vezes 10 elevado a 5 células por poço com um volume de cultura final de 2 mililitros um dia antes da transdução. Substituir o meio de cultura por 2 mililitros de DMEM pré-aquecido suplementado com polibreno a uma concentração final de 6 microgramas por mililitro. Trabalhe em um laboratório de classe 2 a partir desta etapa.

Adicione 50 microlitros de lentivírus SPD e SAD preparados simultaneamente às células gota a gota. Agite a placa suavemente e incube-a a 37 graus Celsius em uma atmosfera de 5% de dióxido de carbono. 16 horas após a transdução, descarte o meio em um frasco autoclavável usando uma pipeta sorológica.

Adicione 2 mililitros de meio fresco contendo 10 microgramas por mililitro de blasticidina e 2 microgramas por mililitro de puromicina. Repita a etapa de substituição do meio após dois dias e manuseie as células transduzidas sob condições S1 após sete dias após a transdução. Semeie 0,1 vezes 10 elevado a 5 células contendo SadCas9 KRAB e Sp-dCas9-KRAB transfectados estáveis sete dias após a transdução em uma placa de 96 poços com 100 microlitros de DMEM pré-aquecido.

No dia da transdução, substitua o meio por 100 microlitros de DMEM pré-aquecido suplementado com polibreno a 6 microgramas por mililitro. Adicione o volume apropriado de lentivírus às células e incube a placa. Após 16 horas, substitua o meio por meio fresco contendo Zeoína, Blasticidina e puromicina.

Realize a detecção de luminescência cinco dias após a transdução usando um ensaio de viabilidade celular de acordo com as instruções do fabricante. A análise de sangue ocidental confirmou a expressão bem-sucedida das proteínas de fusão SpdCas9 e SadCas9 nas células do transdutor 501-mel. A análise quantitativa da reação em cadeia da polimerase mostrou knockdown efetivo de RNAs longos não codificantes individuais RP11 e XLOC usando RNAs guia específicos, mas apenas o par XLOC-sa e RP11-sp reprimiu com sucesso ambos os alvos simultaneamente.

A repressão dupla de RP11 e XLOC usando o par XLOC-sa e RP11-sp GRNA reduziu significativamente a viabilidade da célula 501-mel para 59% em comparação com o controle.