Visualização bidimensional de super-resolução da microvasculatura cerebral de ratos usando microscopia de localização por ultrassom

O escopo de nossa pesquisa se concentra no desenvolvimento de um protocolo para microscopia de localização por ultrassom para obter imagens de super-resolução da microvasculatura do cérebro de ratos. Nosso objetivo é enfrentar os desafios de equilibrar a resolução especial e as profundidades de penetração na imagem de pequenos vasos, fornecendo informações detalhadas sobre a estrutura vascular e a dinâmica do fluxo sanguíneo em estados saudáveis e de doença.

Nosso protocolo oferece a vantagem de alcançar uma alta resolução espacial de 12,5 micrômetros, mantendo uma profundidade de penetração de até 12 milímetros, superando os métodos convencionais, como ressonância magnética, tomografia computadorizada e ultrassom duplo. Ao contrário das técnicas ópticas, ele permite a imagem de regiões cerebrais profundas, reconstruindo estruturas microvasculares e visualizando a dinâmica do fluxo sanguíneo simultaneamente.

Nossos resultados abrem caminho para a investigação de alterações microvasculares em distúrbios neurológicos, como o tumor glioblático e a doença de Alzheimer. A capacidade de visualizar a dinâmica do fluxo sanguíneo e a arquitetura microvascular com alta resolução abre novas oportunidades para estudar a progressão da doença, a eficácia do tratamento e a relação entre as alterações musculares e a função cerebral.

[Narrador] Para começar, posicione o rato anestesiado na mesa de operação. Prenda os incisivos superiores do rato no entalhe da barra incisiva, posicionando a mandíbula inferior abaixo da barra. Posicione as barras auriculares na reentrância óssea, ligeiramente anterior e superior ao canal auditivo, garantindo que a superfície craniana permaneça horizontal. Aplique uma pequena quantidade de pressão em diferentes partes da cabeça para avaliar a estabilidade. Ajuste a altura da plataforma de imagem e ajuste o ângulo da cabeça do rato usando o entalhe da barra incisiva para garantir a respiração desobstruída. Aplique pomada de eritromicina ou solução de glicerina a 30% nos olhos do rato para protegê-los das luzes cirúrgicas e manter a umidade. Com um aparador elétrico portátil, raspe a cabeça do rato na direção contrária ao crescimento do pelo, cobrindo a área entre as orelhas e dos olhos até o pescoço. Agora, faça uma incisão ao longo da sutura sagital do crânio do rato, começando apenas o osso occipital e estendendo-se aproximadamente quatro centímetros anteriormente. Use hemostáticos para retrair a pele em ambos os lados. Opcionalmente, excise a pele sobre o crânio para maior acesso. Use uma tesoura pequena para remover o periósteo do crânio, expondo totalmente a camada óssea dura. Realize a craniotomia com uma mini broca craniana portátil, com uma broca esférica de 2,5 milímetros. Bata suavemente para abrair o osso, perfurando por dois a três segundos de cada vez, começando centralmente e progredindo para fora. Injete aproximadamente um mililitro de solução de cloreto de sódio a 0,9% a cada dois minutos na área de perfuração para resfriar e enxaguar os detritos. Mude para uma broca mais fina de um milímetro quando o tecido ósseo branco não parecer mais conectado de forma consistente. Perfuração contínua até que os principais vasos sanguíneos centrais sejam claramente visíveis como marrom escuro, com o tecido circundante parecendo rosa e os microvasos ligeiramente avermelhados. Para preparar o agente de contraste, dissolva o gás SF6 e o pó do agente de contraste liofilizado em cinco mililitros de cloreto de sódio a 0,9%. Agite vigorosamente a mistura para formar uma microbolha, ou suspensão MB, com uma concentração final de SF6 de oito microlitros por mililitro. Puxe 0,8 mililitros da suspensão MB em uma seringa de um mililitro conectada a uma bomba de microinjeção. Insira uma agulha de calibre 26 com um cateter na veia da cauda do rato e injete. Antes de obter imagens, monte uma sonda com frequência central de 15.625 megahertz no braço manipulador do instrumento estereotáxico cerebral equipado com uma pinça. Posicione a sonda de ultrassom diretamente acima do cérebro do rato exposto e aplique gel de acoplamento na superfície cerebral exposta para garantir a transmissão ideal do sinal. Abra a interface principal do software, que integra um atlas cerebral envolvente com programas de controle de movimento motor. Defina o ponto BGMA como origem e use a exibição em tempo real do software para monitorar a trajetória da sonda e a localização correspondente da fatia do cérebro do rato. Selecione o plano de imagem alvo, como BGMA menos um milímetro. Inicie o software MATLAB 2021a e insira o script de aquisição de dados no MATLAB 2021a. No diretório raiz, digite "activate" na janela de linha de comando para ativar o ambiente de tempo de execução. Em seguida, defina as profundidades inicial e final da coleta de dados em cinco e 120 comprimentos de onda, respectivamente, para capturar efetivamente a região de interesse. Defina os ângulos de direção da transmissão de ondas planas de cinco graus negativos a cinco graus em incrementos de 2,5 graus para melhorar a resolução e o contraste da imagem. A microscopia de localização ultrassônica revelou clara visualização de microvasos em profundidades de até 12 milímetros. A análise da largura total na metade do máximo indicou que o menor diâmetro detectável do vaso foi de 13 micrômetros. A correlação do anel de Fourier confirmou a resolução espacial da imagem microvascular em 12,5 micrômetros. As direções do fluxo sanguíneo em uma fatia transversal do cérebro do rato demonstraram fluxo descendente em pequenas artérias corticais e fluxo ascendente em pequenas veias, representadas pelas cores azul e vermelho, respectivamente. Um mapa de velocidade mostrou taxas de fluxo mais altas em vasos maiores, com a maioria das velocidades concentradas na faixa de 10 a 25 milímetros por segundo. A imagem do modelo de glioblastoma de rato mostrou dilatação vascular anormal, irregularidades estruturais próximas ao tumor, padrões de fluxo sanguíneo alterados na região do tumor e um fluxo vascular heterogêneo dentro e ao redor do tumor.