Protocolos de Triagem Experimental, Imunocitoquímica e Técnicas de Imagem Baseadas em Microscopia para Penium margaritaceum

Nossa pesquisa se concentra no papel da parede celular na manutenção da forma celular e na resposta ao estresse externo. Usamos uma variedade de técnicas de microscopia de luz e microscopia confocal de varredura a laser para obter imagens da estrutura da parede celular em células vivas e microscopia eletrônica para imagens de alta resolução das paredes celulares.

Falta a atual falta de linhagens celulares transformadas para algas estreptófitas que expressam proteínas subcelulares específicas para destacar a dinâmica da parede celular. Isso requer o uso de anticorpos e outras sondas fluorescentes para estudo. A parede celular do Penium responde a várias formas de estresse abiótico e biótico, e isso leva à plasticidade fenotípica. Descobrimos que as pectinas da parede celular são uma parte importante desse processo. O fenótipo unicelular e a capacidade de realizar a marcação de células vivas com Penium oferecem aos biólogos de plantas a oportunidade de mergulhar na estrutura e no desenvolvimento da parede celular.

[Instrutor] Para começar, remova cinco mililitros de culturas de células líquidas de crescimento ativo de Penium margaritaceum. Transfira para um tubo de centrífuga de plástico de 15 mililitros e depois centrifugue. Depois de despejar o sobrenadante, ressuspenda o pellet em cinco mililitros de WHM fresco. Prenda a tampa do tubo firmemente e agite vigorosamente o tubo por 10 segundos para ressuspender o pellet e remover qualquer substância polimérica extracelular da superfície da parede celular. Após a lavagem final, ressuspenda o pellet em um mililitro de WHM fresco e, em seguida, transfira alíquotas de 200 microlitros da suspensão celular para tubos de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue os tubos de tampa na microcentrífuga a 1000 G por um minuto, depois aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 400 microlitros de WHM fresco. Em seguida, adicione 20 microlitros de anticorpo monoclonal diluído à suspensão celular e vortex bem. Em seguida, enrole o tubo em papel alumínio e incube-o em um rotador de laboratório por 90 minutos. Centrifugue a suspensão, aspire o sobrenadante e ressuspenda o pellet em 500 microlitros de WHM fresco antes do vórtice por 10 segundos. Após a centrifugação final, ressuspender o pellet em 400 microlitros de WHM e adicionar oito microlitros de TRITC ou FIT anti-rato caprino. Finalmente, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de meio de crescimento. Tampe o tubo e envolva-o em papel alumínio até que esteja pronto para a imagem. Dilua as células marcadas com anticorpo JIM5 dez vezes em WHM. Adicione uma gota de 50 microlitros da suspensão de células diluídas em uma lamínula. Incube as células por dois minutos no escuro para permitir a aderência celular e, em seguida, pipete cuidadosamente um mililitro de WHM gota a gota para enxaguar as células não aderidas. Adicione 30 microlitros de WHM em cima das células conectadas. Cubra a gota com 30 microlitros de agarose quente a 4% em WHM e deixe solidificar. Para amostras em uma placa de Petri, adicione WHM suficiente para cobrir completamente as células embebidas em agarose. Para células em uma lamínula, inverta a lamínula e coloque-a suavemente sobre uma lâmina de depressão preenchida com WHM. Monte as células preparadas em um microscópio fluorescente. Configure uma lâmpada externa ou use a iluminação embutida do microscópio para apoiar o crescimento e o movimento das células. Capture imagens a cada 10 a 30 minutos usando o conjunto de filtros TRITC para rastrear a expansão da parede celular. Prepare um tubo contendo cinco mililitros de culturas de células lavadas de 10 a 14 dias. Em seguida, adicione cerca de 100 microlitros de esferas fluorescentes de 0,75 micrômetro em um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Pipete um mililitro de WHM no tubo e agite vigorosamente para ressuspender as contas. Centrifugue o tubo a 10.000 G por três minutos. Ressuspenda o pellet final em 500 microlitros de WHM. Em seguida, pipete um mililitro de meio WHM para cada poço de uma placa de 12 poços. Adicione inibidores ou reguladores de crescimento para atingir a concentração desejada e gire suavemente a placa. Adicione 10 microlitros da solução de esferas e gire suavemente novamente para misturar, depois adicione 10 microlitros de células lavadas a cada poço antes de misturar. Incube a placa por 24 horas na luz. Sem perturbar a placa, coloque-a em um microscópio de fluorescência invertida equipado com um filtro FITC. Pipetar um mililitro de uma suspensão celular para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitro. Centrifugue o tubo a 4.000 G por um minuto. Depois de descartar o sobrenadante, mergulhe o tubo contendo o pellet em nitrogênio líquido ou congele a 80 graus Celsius negativos. Ressuspenda o pellet descongelado em 20 microlitros de WHM. Coloque uma gota da suspensão de célula densa em uma lamínula medindo 45 por 50 milímetros. Coloque uma segunda lamínula em cima da gota para criar um sanduíche. Pressione continuamente o sanduíche por 30 segundos para romper as células. Separe cuidadosamente as lamínulas. Adicione WHM sobre as lamínulas para lavar as células rompidas em um tubo de centrífuga de 15 mililitros e centrífuga. Examinar o sedimento branco ou ligeiramente verde depois de rejeitar o sobrenadante. Ressuspenda o pellet contendo as paredes celulares em água deionizada. Após a ruptura e centrifugação da célula, ressuspenda o pellet em 100 microlitros de água deionizada antes de transferi-lo para um tubo de centrífuga de 1,5 mililitro. Em seguida, prenda fita de carbono na superfície de um toco de Cambridge. Pipete cinco gotas de microlitros da suspensão da parede celular ressuspensa na fita de carbono. Use alvo de paládio para revestir o toco por 50 segundos depois de deixá-lo secar durante a noite. Observe as células em cinco quilovolts, com um tamanho de ponto apropriado posicionado a 10 centímetros do detector de elétrons secundário. A marcação da parede celular de P. margaritaceum com anticorpos monoclonais antipectina revelou uma rede de fibras complexadas com cálcio formando um padrão de rede irregular. A pectina foi depositada no centro da célula ou istmo, empurrando a pectina mais velha em direção aos pólos. A marcação JIM7 mostrou que a pectina com alto teor de metila esterificada foi inicialmente secretada em uma faixa estreita no istmo. Outros polímeros na parede celular, como a proteína arabinogalactana, foram detectados com o anticorpo monoclonal JIM13. Grandes quantidades de substâncias poliméricas extracelulares foram secretadas fora da parede celular, permitindo o deslizamento e a agregação celular. As técnicas de rotulagem permitiram estudos quantitativos de parede celular e expansão, integrando abordagens de imagem de desenvolvimento. Estudos estruturais correlativos revelaram que a rede típica de pectina era composta por uma malha de fibras terminando externamente em projeções distintas. O tratamento com altas concentrações de cálcio transformou a rede de pectina em depósitos irregulares, como observado em células marcadas com JIM5. Quando as paredes celulares tratadas com cálcio foram examinadas em microscopia eletrônica de varredura, a estrutura desorganizada da pectina foi observada em detalhes.