Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo Staphylococcus epidermidis E Mycobacterium marinum Infecção como um modelo para a Descoberta de Drogas
June 26th, 2014
Este artigo descreve o vídeo elevado rendimento oleoduto que tenha sido estabelecida com sucesso para infectar e analisar um grande número de embriões de peixes-zebra proporcionando uma nova ferramenta poderosa para o teste e composto de descoberta de medicamentos usando um animal vertebrado organismo inteiro.
O objetivo geral deste procedimento é gerar um grande número de embriões de peixe-zebra infectados para testes compostos de alto rendimento para permitir a descoberta de medicamentos. Isso é feito primeiro usando um grande vaso de reprodução para obter um grande número de ovos de peixe-zebra síncronos em um único evento. Em seguida, os ovos são alinhados em uma grade aros e infectados com bactérias na gema usando um microinjetor automatizado.
Quando a infecção se espalha pelos embriões, eles são pré-classificados por citometria de fluxo de partículas grandes antes de serem tratados com medicamentos. Finalmente, os níveis de carga bacteriana em embriões infectados são analisados após o tratamento composto. Por fim, análise de alta resolução através de microscopia confocal vértebra.
A triagem automatizada e a amostragem de partículas grandes são usadas para mostrar com mais detalhes os efeitos que os compostos têm sobre a infecção. A principal vantagem deste método sobre as técnicas existentes, como injeções manuais ou análise de varredura PIX, é que com ele podemos gerar uma grande quantidade de embriões afetados de forma homogênea, que podemos analisar de maneira de alto rendimento. Para preparar o inóculo epiderme S, isolar várias colônias individuais de uma placa de cepa epiderme S, O 47 contendo um vetor de expressão de cereja M derivado de A pw vw 180 9 e inocular.
25 mililitros de LB suplementados com 10 microgramas por mililitro. Cloranfenicol incubar durante a noite a 37 graus Celsius até o estágio intermediário no dia seguinte, centrifugar um mililitro da cultura a 12.000 GS por um minuto e usar um mililitro de PBS estéril com 0,3% de volume por volume entre 80 para lavar o pellet três vezes. Meça a densidade óptica em OD 600 e use 2% de peso por volume, polivinil perona 40 ou PVP 40 em PBS para diluir a suspensão bacteriana em um OD 600 igual a 0,3 ou uma vez 10 elevado a oito UFC por mililitro.
Para preparar o inóculo aminum, isole várias colônias individuais da cepa M Meum M ou E 11 expressando de forma estável o vetor de cereja PS MT 3M de um Middlebrook seven H 10 areje e inocule 10 mililitros de caldo Middlebrook seven H nine contendo 10% de volume por volume. Enriquecimento de Middlebrook A DC suplementado com 50 microgramas por mililitro de higromicina incubar durante a noite a 28 graus Celsius no dia seguinte. Centrifugue um mililitro da cultura a 12.000 GS por um minuto e use um mililitro de PBS estéril com 0,3% de volume por volume entre 80 para lavar o pellet três vezes.
Meça o OD 600 da suspensão bacteriana e com 2% de peso por volume. PVP 40 em PBS diluído para um OD 600 de 0,3 ou 0,3 vezes 10 para as oito UFC por mililitro para obter ovos de peixe-zebra na noite anterior à coleta, coloque no máximo 50 fêmeas de peixe-zebra na câmara inferior de um grande vaso de reprodução e 70 machos na parte superior do vaso. Na manhã seguinte, remova o separador do recipiente Após aproximadamente uma hora através do coletor de ovos no fundo do recipiente de reprodução, colete os ovos em um tubo de 50 mililitros cheio de água de ovo.
Depois de preparar as placas de injeção, de acordo com o protocolo de texto no software operacional do microinjetor automatizado, clique em calibrar stage e, em seguida, clique em 10 24. Grade de poço e coloque a placa aros no micro injetor, calibre a placa clicando na tela na posição central do poço. Em seguida, vá para o menu da agulha e clique em calibrar porta-agulha.
Usando uma ponta de micro carregador, encha uma agulha de injeção de ponta de 10 mícrons de diâmetro com 10 microlitros de PVP 40 contendo 100 UFC por nanolitro de epiderme S, 30 UFC por nanolitro de erum ou PVP 40 sozinho para injeções simuladas, coloque a agulha no microinjetor automatizado e calibre a posição XY abaixando ou movendo a agulha para cima e clicando na tela na posição da agulha. Em seguida, calibre a posição Z da agulha clicando na tela na posição da ponta da agulha. Em seguida, use uma pipeta de transferência de plástico para distribuir os ovos sobre a grade aros e remova o excesso de água do ovo.
Em seguida, coloque a grade agros cheia de ovos no microinjetor automatizado no menu de injeção, ajuste a configuração da pressão de injeção para 200 hectares pascals, o tempo de injeção para 0,2 segundos e a pressão de compensação para 15 Hector Pascals, que se correlaciona com um nanolitro no menu de configurações do jato Femto. Clique em injetar tudo e injetar toda a placa de embriões após a injeção. Colete os ovos lavando-os em uma placa de Petri e incube-os a 28 graus Celsius.
Assim que o citômetro de fluxo de partículas grandes estiver configurado, entre no menu PMT e defina o canal vermelho para 650 volts e os canais verde e amarelo para zero volts. Em seguida, no menu de limites, defina o sinal de limite de densidade óptica para 50, correspondendo a 975 milivolts e o tempo de voo mínimo para 800, correspondendo a 320 microssegundos. Para reduzir a influência de detritos, coloque os embriões no copo de amostra e no menu de classificação para encontrar o máximo de 70 embriões por placa a serem classificados digitando 70.
Coloque uma placa de Petri vazia sob o classificador e clique em classificação manual. Quando a placa de Petri estiver cheia, salve os dados clicando em armazenar. Se for necessária uma análise ou imagem de alta resolução, os embriões podem ser classificados individualmente em poços de uma placa de 96 poços.
Colocar os embriões no copo de amostra e definir o máximo de um embrião por alvéolo a classificar. Em seguida, posicione uma placa vazia de 96 poços no suporte esquerdo da placa e clique na placa de preenchimento. Quando a placa estiver cheia, salve os dados clicando em armazenar para analisar embriões tratados com drogas três dias após a injeção com erum.
Trate um grupo de embriões com um composto de interesse em solvente e um segundo grupo apenas com solvente. Coloque os embriões tratados quatro e cinco dias após a fertilização no copo de amostra no citômetro de fluxo e defina a classificação para 70 embriões por placa após anestesiar os embriões em trica e configurar o sistema de triagem automatizado de vertebrados e o amostrador de partículas grandes. De acordo com o protocolo de texto do menu de configuração de detecção de objetos de imagem, selecione as imagens de referência correspondentes à idade dos embriões no menu de imagens de armazenamento automático de imagens, selecione o número de imagens a serem criadas e a orientação a ser usada.
Coloque uma placa de 96 poços cheia de embriões no suporte da placa esquerda do amostrador de partículas grandes e clique na placa de execução. Quando um embrião estiver posicionado corretamente, use uma objetiva seca simples de 10 x e visualize a cabeça e a cauda separadamente. Em seguida, use um software de processamento de imagem para unir as imagens para avaliar qual estágio de desenvolvimento é melhor para a infecção da gema.
Injeções com dermite e um marum foram realizadas em todos os diferentes estágios entre o estágio de uma e 512 células. Como visto aqui, as injeções com 100 UFC de dermite realizadas entre o estágio 16 e 128 celular forneceram o melhor padrão de infecção. A bactéria proliferou dentro da gema por três dias e se espalhou pelo corpo a partir de três dias após a infecção.
A quantificação de alto rendimento da carga bacteriana foi realizada por análise de intensidade de fluorescência usando o citômetro de fluxo de partículas grandes. Como mostrado aqui, a quantidade de bactérias vivas presentes no interior do embrião corresponde muito bem ao sinal fluorescente medido. Esta figura demonstra que o estágio ideal de desenvolvimento para injeção de 30 UFC de aminum está entre o estágio 16 e 128 celular para a cepa E 11 e entre o estágio 16 e 64 celular.
Com a cepa EM mais virulenta, os embriões injetados nesses estágios mostraram crescimento bacteriano dentro do carvalho e disseminação da bactéria pelo embrião. Após o tratamento pré-classificação de embriões infectados com emerina com diferentes concentrações de rifampicina mostrou uma redução da infecção micobacteriana de maneira dose-dependente. O uso da droga na dose de 200 micromolares demonstrou que ele efetivamente interrompeu a progressão bacteriana do M mein E 11, 24 horas e após o tratamento após seu desenvolvimento.
Essas técnicas abriram caminho para pesquisadores no campo de testes de compostos e desenvolvimento de medicamentos, procurando novos tratamentos para doenças infecciosas, como tuberculose ou infecções associadas a biomateriais.
Visão Geral
Este artigo em vídeo descreve um pipeline de alto rendimento estabelecido para infectar e analisar um grande número de embriões de peixe-zebra, fornecendo uma ferramenta poderosa para testes de compostos e descoberta de medicamentos.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Neurociência
- Descoberta de Medicamentos
- Biologia da Infecção
Fundamentos
- Embriões de peixe-zebra são usados como um organismo modelo para estudar infecções.
- Métodos de alto rendimento permitem a análise de tamanhos de amostra grandes.
- Técnicas automatizadas melhoram a eficiência e consistência nos experimentos.
- Testes de medicamentos em embriões infectados podem revelar a eficácia dos compostos.
Objetivo do Estudo
- Gerar um grande número de embriões de peixe-zebra infectados para testes.
- Analisar os efeitos dos compostos em infecções bacterianas.
- Melhorar os processos de descoberta de medicamentos usando um modelo vertebrado.
Métodos Usados
- Uso de um grande recipiente de reprodução para coleta síncrona de ovos.
- Microinjeção automatizada de bactérias no vitelo do peixe-zebra.
- Citometria de fluxo de partículas grandes para classificação de embriões.
- Microscopia confocal para análise de alta resolução das infecções.
Principais Resultados
- Infecção bem-sucedida dos embriões permite análise de alto rendimento.
- Métodos automatizados produzem embriões afetados homogeneamente.
- Efeitos do tratamento medicamentoso podem ser avaliados quantitativamente.
- Imagens de alta resolução revelam interações detalhadas entre compostos e infecções.
Conclusões
- O pipeline estabelecido melhora significativamente os esforços de descoberta de medicamentos.
- Técnicas automatizadas fornecem resultados confiáveis e reproduzíveis.
- Este método pode ser adaptado para vários cenários de teste de compostos.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
This high throughput zebrafish infection model bridges the gap between cell-based assays and mammalian in vivo validation, enabling early-stage compound screening with whole-animal physiological relevance. By generating large numbers of synchronously infected embryos, the method supports predictive confidence in target validation and reduces late-stage attrition in anti-infective drug discovery pipelines. The scalable workflow accommodates diverse bacterial pathogens and compound libraries, enhancing translational continuity from hit identification to preclinical evaluation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Scientific Value: Enables interrogation of therapeutic hypotheses in a whole-animal infection context, clarifying pathogen-host interactions and target essentiality.
- Operational Value: Supports biological de-risking through homogeneous, synchronized infection models that reduce variability in phenotypic screening outcomes.
- Predictive Value: Facilitates early go/no-go decisions by quantifying compound effects on bacterial burden in vivo, improving portfolio triage efficiency.
Screening & Assay Development
- Scientific Value: Provides a standardized, reproducible platform for preparing validated biological systems amenable to downstream compound evaluation.
- Operational Value: Employs automated microinjection and large particle flow cytometry to ensure assay consistency, scalability, and high sample throughput.
- Screening Readiness: Generates quantitative fluorescence-based readouts of bacterial burden, enabling reliable dose-response analysis and hit confirmation.
Translational & Preclinical Research
- Translational Continuity: Maintains disease relevance by modeling Staphylococcus epidermidis and Mycobacterium marinum infections, which reflect biomaterial-associated and tuberculosis-related pathologies.
- Preclinical Alignment: Supports risk-adjusted advancement decisions by linking early efficacy signals to known antimicrobial mechanisms, such as rifampicin dose-dependent inhibition.
- Mechanistic De-risking: Enables use of transgenic zebrafish lines to decipher compound mode of action, strengthening target confidence before mammalian studies.
Pipeline & Workflow Integration
The method integrates into the discovery continuum from early target validation through lead identification to preclinical efficacy testing, particularly for anti-infective programs requiring whole-animal validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by enabling real-time monitoring of infection dynamics and compound interference in a vertebrate host.
- Screening: Delivers assay readiness through automated embryo alignment, precise yolk injection, and presorting via flow cytometry to ensure uniform starting conditions.
- Analytics: Provides quantitative dependent variable measurements via fluorescence intensity analysis, allowing objective comparison of bacterial burden across treatment groups.
- Translational Research: Connects discovery to preclinical continuity through dose-response profiling of known antibiotics, establishing predictive biomarkers of efficacy.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable capability for screening diverse compound libraries against multiple pathogens, reducing reliance on bespoke assay development.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in target validation by reducing mechanistic ambiguity through direct observation of infection modulation in vivo.
- Operational Value: Enhances standardization, reproducibility, and scalability through automated workflows and synchronized embryo production.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality, capital efficiency, and reduces late-stage biological risk in anti-infective programs.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization and advancement decisions based on quantitative in vivo efficacy data from high throughput screens.
Implementation Considerations
- Requires expertise in zebrafish husbandry, microinjection techniques, and flow cytometry operation.
- Dependent on automated microinjectors, large particle flow cytometers, and fluorescence detection systems.
- Necessitates cross-team standardization of infection protocols, compound preparation, and data analysis pipelines.
- Involves adaptation considerations for different bacterial strains, transgenic lines, and infection readouts based on pathogen virulence and host response.
- Practical limitations include embryo viability constraints post-infection and the need for optimization of bacterial inoculum titers for consistent phenotype penetration.
