Criação e Otimização de um Setup de Alto Rendimento para o Estudo

O objetivo geral deste procedimento é gerar grandes quantidades de embriões de peixe-zebra infectados para testes de compostos de alto rendimento, permitindo a descoberta de fármacos. Isso é realizado primeiramente utilizando um recipiente de reprodução de grande porte para obter um grande número de ovos de peixe-zebra sincronizados em um único evento. Em seguida, os ovos são alinhados em uma grade de aros e infectados com bactérias na gema por meio de um microinjetor automatizado.

Quando a infecção se espalha pelos embriões, eles são pré-separados por citometria de fluxo de grandes partículas antes de serem tratados com medicamentos. Por fim, os níveis de carga bacteriana nos embriões infectados são analisados após o tratamento com o composto. Em última instância, análise de alta resolução por meio de microscopia confocal da vértebra.

A triagem automatizada e a amostragem de partículas grandes são utilizadas para mostrar com maior detalhe os efeitos que compostos têm sobre a infecção. A principal vantagem deste método em relação a técnicas existentes, como injeções manuais ou análise por varredura PIX, é que com ele podemos gerar uma grande quantidade de embriões homogeneamente afetados, que podemos analisar de maneira de alto rendimento. Para preparar o inóculo de S epiderm, isole várias colônias individuais de uma placa da cepa S epiderm O 47 contendo o vetor de expressão M cherry derivado de A PW VW 180 9, e inocule.

25 mililitros de LB suplementado com 10 microgramas por mililitro de cloranfenicol, incubar durante a noite a 37 graus Celsius até o estágio de meio-log, no dia seguinte, centrifugar um mililitro da cultura a 12.000 ×g por um minuto e usar um mililitro de PBS estéril com 0,3% volume por volume de entre 80 a para lavar o pellet três vezes. Medir a densidade óptica em OD 600 e usar 2% peso por volume de polivinilpirrolidona 40 ou PVP 40 em PBS para diluir a suspensão bacteriana até um OD 600 igual a 0,3 ou um vezes 10 à oitava UFC por mililitro.

Para preparar o inóculo de aminum, isole várias colônias individuais da linhagem M Meum M ou E 11 que expressa de forma estável o vetor PS MT 3M cherry de um Middlebrook sete H 10, aerado, e inóculo 10 mililitros de caldo Middlebrook sete H nove contendo 10% volume por volume. Middlebrook A DC enriquecido suplementado com 50 microgramas por mililitro de higromicina, incubar durante a noite a 28 graus Celsius no dia seguinte. Centrifugue um mililitro da cultura a 12.000 ×g por um minuto e use um mililitro de PBS estéril com 0,3% volume por volume entre 80 e 100 para lavar o pellet três vezes.

Meça a DO 600 da suspensão bacteriana com PVP 40 a 2% peso por volume em PBS diluído para uma DO 600 de 0,3 ou 0,3 vezes 10 à oitava UFC por mililitro para obter ovos de peixe-zebra. Na noite anterior à coleta, coloque no máximo 50 fêmeas de peixe-zebra na câmara inferior de um recipiente de reprodução grande e 70 machos na parte superior do recipiente. Na manhã seguinte, remova o separador do recipiente. Após aproximadamente uma hora, colete os ovos através do coletor de ovos na base do recipiente de reprodução, transferindo-os para um tubo de 50 mililitros contendo água para ovos.

Após preparar as placas para injeção, de acordo com o protocolo descrito no software operacional do microinjetor automatizado, clique em calibrar estágio, depois clique na grade de 10 24 poços e coloque a placa aros no microinjetor, calibrando a placa ao clicar na tela na posição central do poço. Em seguida, vá até o menu da agulha e clique em calibrar o suporte da agulha.

Usando uma ponteira de microcarregador, encha uma agulha de injeção com diâmetro de 10 mícrons com 10 microlitros de PVP 40 contendo 100 UFCs por nanolitro de S epiderm, 30 UFCs por nanolitro de erum ou apenas PVP 40 para injeções simuladas. Coloque a agulha no microinjetor automatizado e calibre a posição XY abaixando ou movendo a agulha para cima e clicando na tela na posição da agulha. Em seguida, calibre a posição Z da agulha clicando na tela na posição da ponta da agulha. Depois, use uma pipeta plástica de transferência para distribuir os ovos sobre a grade aros e remova qualquer água em excesso dos ovos.

Em seguida, coloque a grade de agros preenchida com ovos no microinjetor automatizado, no menu de injeção, ajuste a pressão de injeção para 200 hectopascais, o tempo de injeção para 0,2 segundos e a pressão de compensação para 15 hectopascais, o que corresponde a um nanolitro no menu de configurações do Femto jet. Clique em injetar tudo e injete todos os embriões da placa. Colete os ovos lavando-os em uma placa de Petri e incube-os a 28 graus Celsius.

Uma vez que o citômetro de fluxo para partículas grandes esteja configurado, acesse o menu PMT e defina o canal vermelho em 650 volts e os canais verde e amarelo em zero volts. Em seguida, no menu de limiares, defina o sinal de limiar de densidade óptica em 50, correspondente a 975 milivolts, e o tempo mínimo de voo em 800, correspondente a 320 microssegundos. Para reduzir a influência de detritos, coloque os embriões no copo de amostra e, no menu de separação, insira 70 para encontrar o máximo de 70 embriões por placa a serem separados.

Coloque uma placa de Petri vazia sob o classificador e clique em classificação manual. Quando a placa de Petri estiver cheia, salve os dados clicando em armazenar. Se for necessária uma análise ou imagem de alta resolução, os embriões podem ser classificados individualmente em poços de uma placa de 96 poços.

Coloque os embriões no copo da amostra e defina um máximo de um embrião por poço a ser classificado. Em seguida, posicione uma placa de 96 poços vazia no suporte esquerdo da placa e clique em preencher placa. Quando a placa estiver cheia, salve os dados clicando em armazenar para analisar embriões tratados com fármaco aos três dias pós-injeção com erum.

Trate um grupo de embriões com um composto de interesse em solvente e um segundo grupo com solvente apenas. Coloque os embriões tratados aos quatro e cinco dias após a fertilização no copo de amostra do citômetro de fluxo e configure a separação para 70 embriões por placa após anestesiar os embriões em trica, e configurar o sistema automatizado de triagem de vertebrados e o amostrador de partículas grandes. De acordo com o protocolo de texto do menu de configuração de detecção de objetos por imagem, selecione as imagens de referência correspondentes à idade dos embriões no menu de imagens armazenadas automaticamente por imagem, selecione o número de imagens a serem geradas e a orientação a ser utilizada.

Coloque uma placa de 96 poços preenchida com embriões no suporte esquerdo da amostradora de partículas grandes e clique em executar placa. Quando um embrião estiver corretamente posicionado, utilize uma objetiva seca simples de 10 x e capture imagens separadas da cabeça e da cauda. Em seguida, use um software de processamento de imagens para unir as imagens e avaliar qual estágio de desenvolvimento é o mais adequado para infecção do vitelo.

Foram realizadas injeções com dermitis e um marum em todos os estágios diferentes entre o estágio de um e 512 células. Como visto aqui, injeções com 100 UFC de dermitis realizadas entre os estágios de 16 e 128 células proporcionaram o melhor padrão de infecção. As bactérias se proliferaram no interior da gema durante três dias e se espalharam para o corpo a partir de três dias pós-infecção em diante.

A quantificação de alto rendimento da carga bacteriana foi realizada por meio da análise da intensidade de fluorescência utilizando o citômetro de fluxo de partículas grandes. Como mostrado aqui, a quantidade de bactérias vivas presentes dentro do embrião corresponde muito bem ao sinal fluorescente medido. Esta figura demonstra que o estágio de desenvolvimento ideal para a injeção de 30 UFCs de aminum é entre o estágio de 16 e 128 células para a linhagem E 11 e entre o estágio de 16 e 64 células.

Com a linhagem mais virulenta EM, embriões injetados nesses estágios exibiram crescimento bacteriano dentro do embrião e disseminação das bactérias por todo o embrião. Após o tratamento pré-seleção de embriões infectados com emerina com diferentes concentrações de rifampicina, observou-se uma redução da infecção micobacteriana de maneira dependente da dose. O uso da droga em uma dose de 200 micromolar demonstrou que ela interrompeu efetivamente a progressão bacteriana de M. marinum E11, 24 horas e posteriormente após o tratamento, após seu desenvolvimento.

Essas técnicas abriram caminho para pesquisadores na área de testes de compostos e desenvolvimento de medicamentos, em busca de novos tratamentos para doenças infecciosas, como tuberculose ou infecções associadas a biomateriais.