Imagens de C . elegans de alta resolução em todos os estágios larvais

No laboratório, trabalhamos em todos os tipos de questões de biologia do desenvolvimento. Eu mesmo trabalho mais no lado técnico, desenvolvendo métodos para melhor abordar essas questões usando técnicas de imagem. O campo de C. elegans adotou com sucesso uma enorme variedade de métodos, desde a edição de genes CRISPR, transcriptômica e proteômica, até a microscopia de super-resolução. C. elegans é um modelo incrível, no entanto, no contexto da observação in vivo em alta resolução, ele vem com seus desafios, exigindo imobilização para melhor resolução, o que por sua vez limita a viabilidade animal. O protocolo apresenta uma solução possível para imagens de C. elegans de longo prazo, permitindo que os pesquisadores adotem o método em seu próprio laboratório e estudem uma ampla variedade de processos dinâmicos de desenvolvimento diretamente in vivo. Dentro do laboratório, o método permitiu a observação detalhada da formação de órgãos, por exemplo, no contexto da morfogênese ou após divisões de células somáticas na idade adulta. Desde então, o método foi adotado por vários laboratórios que estudam uma ampla gama de processos de desenvolvimento.

[Apresentador] Para começar, conecte o dispositivo à estrutura de suporte e monte-o no microscópio vertical. Encha uma seringa com água deionizada e, em seguida, prenda uma agulha de calibre 23 e um pedaço longo de um tubo de 16 polegadas com um pino de aço dobrado oco. Encha a tubulação com água deionizada da seringa e insira o pino de aço no orifício perfurado da entrada da válvula para conectar a tubulação. Remova a seringa e a agulha antes de conectar o tubo ao solenóide fora do chip. Usando o software de imagem, ligue o solenóide e pressurize o dispositivo por vários minutos para expelir todo o ar da válvula. Verifique a conclusão verificando visualmente se a interface ar-água parece escura e desaparece no material PDMS. Desligue o solenóide usando o software de imagem. Em seguida, encha uma seringa de um mililitro com a solução de bactérias filtradas e conecte uma agulha de calibre 30 e um pedaço longo de um tubo de 32 polegadas à agulha. Pressione o êmbolo para encher a agulha e o tubo conectado com a solução bacteriana. Em seguida, usando uma pinça, insira o tubo de um por 32 polegadas diretamente na entrada de alimentos do dispositivo microfluídico e coloque a seringa na bomba da seringa. Pressione o êmbolo da seringa usando o parafuso de aperto manual na parte traseira para encher o dispositivo com líquido. Bloqueie a entrada e a saída do sem-fim com pinos de aço selados e aplique pressão adicional usando o parafuso de fixação para remover qualquer ar restante do dispositivo. Em seguida, remova o pino de aço bloqueado na saída e conecte o recipiente de resíduos à tomada. Empurre a seringa para garantir que o recipiente de resíduos esteja conectado corretamente e que não haja bloqueios no sistema. Remova o segundo pino de aço bloqueado da entrada e empurre a seringa até que uma pequena gota de líquido apareça na entrada do sem-fim. Em seguida, usando uma agulha de calibre 23, conecte um pedaço mais longo de um tubo de 16 polegadas medindo aproximadamente 15 a 20 centímetros a uma seringa de um mililitro cheia de tampão S-basal. Prenda um pino de aço reto de calibre 23 na outra extremidade do tubo. Encha a agulha e o tubo com tampão S-basal da seringa. Agora, insira o pino de aço na extremidade da tubulação no tubo que contém as minhocas e empurre uma pequena quantidade de líquido através da tubulação para garantir que não haja mais ar. Puxe os vermes para dentro do tubo sem puxá-los para dentro da seringa. Em seguida, empurre a seringa conectada aos vermes até que uma pequena gota de líquido apareça no pino de aço e insira o pino de aço na entrada do verme do dispositivo microfluídico. Coloque o dispositivo em um microscópio com baixa ampliação, 5x ou 10x, ou em um microscópio de dissecação. Posicione o dispositivo de modo que a entrada seja visível em um lado do campo de view e a parte de trás da entrada do canal de armadilha seja visível do outro lado. Empurre suavemente o êmbolo da seringa sem-fim. Em seguida, empurre os animais em direção à matriz de canais. Quando um animal estiver de frente para o canal, empurre-o para dentro do canal e repita para outros animais. Depois de capturar animais suficientes, coloque a seringa, ainda presa à entrada do verme, no estágio do microscópio, onde permanecerá durante todo o experimento. Se o carregamento foi realizado em um microscópio de dissecação, transfira o dispositivo para o microscópio de imagem. Agora, ligue a bomba de seringa e execute-a a uma taxa predefinida de um microlitro por hora para 0,5 microlitros. Programe a bomba de seringa de forma que funcione a um microlitro por hora para 0,5 microlitros, após o que a vazão é aumentada em 100 microlitros por hora para 0,5 microlitros, e o padrão de fluxo é repetido ao longo do experimento. Coloque o dispositivo no microscópio stage e certifique-se de que está firmemente preso. Mude para a ampliação de imagem desejada. Identifique os animais e regiões de interesse dentro da matriz de canais de armadilha e configure as condições de imagem desejadas. Imagem nas condições de imagem desejadas, acionando a válvula no chip através do solenóide 10 segundos antes da aquisição da imagem para que os animais sejam mantidos no lugar. O dispositivo microfluídico manteve alta qualidade de imagem em várias modalidades de microscopia, incluindo campo claro, epifluorescência, disco giratório confocal e métodos de super-resolução devido ao uso de uma lamínula de 170 micrômetros de espessura. Desenvolvimento de células epiteliais de Caenorhabditis elegans visualizadas desde o início de L1 até o estágio larval de L2 médio. A indução das células precursoras primárias da vulva desbotada e suas divisões subsequentes do final de L1 ao início do estágio larval de L4 foi evidente. Estágios de formação da vulva desde o início de L3 até a idade adulta. As imagens adquiridas foram aprimoradas por meio de deconvolução e registro de imagens, melhorando a clareza visual As divisões celulares observadas ocorreram de maneira consistente e oportuna em todos os animais, com todas as divisões concluídas dentro das durações típicas do estágio larval. O comprimento das gônadas aumentou de forma constante durante os estágios L2 e L3, com medidas consistentes possibilitadas pela orientação reta dos animais.