Sequenciamento de Amplicon usando as tecnologias de sequenciamento de leitura longa

Investigo se o sequenciamento portátil de leitura longa pode fornecer resultados de suscetibilidade à tuberculose resistentes a medicamentos em ambientes com recursos limitados, com precisão comparável ao método dos padrões ouro, avançando diagnósticos acessíveis e de alta qualidade para tuberculose. Utilizando sequenciamento direcionado de próxima geração como ferramenta diagnóstica para tuberculose resistente a medicamentos, oferecendo um perfil abrangente de resistência diretamente de amostra clínica sem expertise em bioinformática. Nosso protocolo, utilizando sequenciamento de leituras longas, tem potencial para fornecer tempos de resposta mais rápidos, fluxo de trabalho mais simples do que na detecção de resistência em tempo real, facilitando diagnósticos abrangentes de TB e aprimorando o rastreamento de surtos em ambientes com recursos limitados e infraestrutura mínima.

Para começar, calcule 100 nanogramas de cada amostra de amplicão com base na concentração e transfira o volume necessário para um tubo PCR limpo. Para determinar a massa total dos amplicons na amostra, use a fórmula fornecida. Ajuste o volume total de cada amostra para 12,5 microlitros usando água sem nuclease.

Misture as amostras suavemente, pipetando para cima e para baixo 10 vezes e gire-as brevemente em uma microcentrífuga. Em seguida, adicione 1,75 microlitros de buffer de reação de reparo final e adenilação a cada amostra, seguido por 0,75 microlitros de mistura enzimática de reparo final e adenilação. Após misturar e girar as amostras, coloque os tubos em um termociclador a 25 graus Celsius por 30 minutos, seguido por 65 graus Celsius por 30 minutos.

Para ligação nativa de código de barras, adicione os componentes mostrados na tela em novos tubos de PCR. Misture as reações suavemente pipetando e centrifuge brevemente usando uma microcentrífuga. Em seguida, adicione um microlitro de EDTA a cada tubo.

Depois, misture bem e centrifuge brevemente como mostrado anteriormente. Puxe as amostras com código de barras para um tubo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Faça vórtice nas esferas de limpeza do DNA para ressuspendê-las completamente e adicionar um volume igual a 0,7 vezes o volume acumulado da amostra.

Misture a solução da amostra de esferas e incube-a em um HulaMixer em temperatura ambiente por 10 minutos. Em seguida, para preparar dois mililitros de etanol 80%, misture 1.600 microlitros de etanol puro com 400 microlitros de água sem nuclease. Coloque o tubo em um suporte magnético por cinco minutos até que o eluado pareça claro e incolor.

Depois, remova e descarte o sobrenadante sem mexer na bola. Lave as esferas com 700 microlitros de etanol 80% recém-preparado e centrifuge o tubo brevemente. Após colocar o tubo no suporte magnético, remova o etanol residual.

Agora, remova o tubo do suporte magnético. Ressuspenda as esferas em 35 microlitros de água sem nuclease por meio de suaves movimentos e incube a 37 graus Celsius por 10 minutos. Retorne o tubo ao suporte magnético até que o eluato fique claro e incolor.

Depois, transfira 35 microlitros do eluato para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 mililitro para uso posterior. Para ligação do adaptador, misture os componentes em um tubo microcentrífuga de baixa ligação de 1,5 mililitros. Centrifuge o tubo brevemente e incube em temperatura ambiente por 20 minutos.

Faça vórtice nas esferas de limpeza de DNA para resuspendê-las completamente. Adicione 20 microlitros de esferas ao tubo e misture suavemente. Incube em um Hula Mixer por 10 minutos em temperatura ambiente.

Depois, coloque o tubo em um suporte magnético para fazer as bolas e aspirar o sobrenadante sem perturbar o pellet. Adicione 125 microlitros de buffer de fragmentos curtos e dê um toque suave no tubo para resuspender as esferas. Centrifuge brevemente e retorne o tubo ao suporte magnético.

Aspire o sobrenadante novamente após as contas terem sido pelletadas. Agora, remova o tubo do suporte magnético e resuspenda as esferas em 15 microlitros de buffer de elução pipetando suavemente ou fazendo um estalido. Centrifuge brevemente o tubo para coletar o conteúdo, depois incube-o a 37 graus Celsius por 10 minutos para eluir o DNA.

Coloque o tubo em um suporte magnético até que o eluato fique claro e incolor. Depois, aspire 15 microlitros de eluato e transfira para um tubo limpo de microcentrífuga de 1,5 mililitros. Para preparar a solução de priming da célula de fluxo, misture cuidadosamente os componentes fornecidos.

Abra a porta de priming da célula de fluxo, aspire aproximadamente 20 microlitros de buffer para remover bolhas de ar e carregue 800 microlitros da mistura de priming na porta sem introduzir bolhas de ar. Para preparar a biblioteca de DNA, misture cuidadosamente os componentes mostrados na tela. Levante suavemente a tampa da porta da amostra da célula de fluxo, carregue 200 microlitros de mistura de priming na porta de priming sem introduzir bolhas de ar.

Após misturar a biblioteca de DNA preparada, carregue 75 microlitros da biblioteca em queda na porta de amostra da célula de fluxo de sequenciamento. Feche a tampa da porta da amostra da célula de fluxo, garantindo que o tampão entre firmemente na porta da amostra, e depois feche firmemente a porta de primário. A eletroforese em gel confirmou a integridade do amplicão em quase todas as amostras, mas as linhas correspondentes às amostras 89 e 136 apresentaram bandas ténues ou ausentes.

As amostras 89 e 136 apresentaram concentrações insuficientes de amplicon, levando à sua exclusão do sequenciamento de leitura longa. Em todos os genes alvo, as plataformas de leitura longa e curta alcançaram altas profundidades de cobertura, com o gene EIS apresentando os valores médios mais altos e o gene RRS apresentando as menores profundidades de cobertura. Apesar da amplitude de profundidade de cobertura, ambas as plataformas mantiveram uma alta amplitude de cobertura de 99,9% em todos os genes associados à resistência.

Variantes de resistência a medicamentos para etambutol, fluoroquinolonas, kanamicina, amikacina e capreomicina foram detectadas com concordância de 100% em plataformas de sequenciamento de leitura curta e longa. Não foram encontradas mutações associadas à resistência para linezolide, bedaquilina e clofazimina usando qualquer uma das abordagens de sequenciamento. A detecção de resistência à estreptomicina mostrou menor concordância entre as plataformas, com apenas 71,43% de concordância.

A sensibilidade à detecção para genes-chave rpoB, katG/fabG1/ahpC/inhA, fabG1/inhA e pncA variou de 89,47% a 96,77% entre plataformas.