Perfil espacial abrangente de transcriptomas agnósticos de espécies via Stereo-seq

Nossa pesquisa foca em caracterizar detalhadamente o microambiente do tumor ovariano para identificar biomarcadores preditivos e terapêuticos. Por exemplo, gostaríamos de encontrar marcadores para prever a resposta e resistência à quimioterapia ou novos alvos terapêuticos para tratamentos de segunda linha. Os desafios experimentais incluem o manuseio da amostra, a avaliação da qualidade da amostra e o tempo de processamento da amostra.

Já no lado da análise de dados, os desafios incluem aspectos como a escassez dos dados, semelhante a outros processos de célula única, ou também o mapeamento de áreas, especialmente regiões repetitivas. Após remover o N-Chip de sequenciamento estéreo de sua embalagem, registre o número de identificação do chip. Sem tocar na superfície do N-Chip, limpe a lâmina de vidro com 100% etanol.

Usando uma micropipeta, aplique cuidadosamente 10 microlitros de resina cerâmica curável por ultravioleta ao redor da borda do N-Chip de sequenciamento estéreo. Use um swab de espuma selado para remover o excesso de resina, deixando apenas uma linha fina ao redor da borda do aparo. Coloque o slide no dispositivo de cura ultravioleta, garantindo que a superfície do chip não seja tocada.

Agora coloque o chip aplicado em resina sobre uma máscara opaca na fonte de luz ultravioleta de 405 nanômetros para iluminar a parte de trás da lâmina e cure por cinco minutos. Após a cura, use cotonetes de espuma selada embebidas em etanol 100% de grau molecular, depois 70% de etanol e, finalmente, água sem nuclease para limpar ao redor da borda aplicada com resina. Submerga o chip três vezes em água fresca sem nuclease usando um tubo cônico de 50 mililitros.

Usando ar comprimido, seque a lasca com toda a força do ar em um ângulo de aproximadamente 60 a 80 graus, movendo-se diagonalmente pela superfície a cerca de cinco centímetros de distância. Em seguida, aplique 150 microlitros de solução de poli-L-lisina de forma uniforme em toda a superfície do chip e incube o chip por 10 minutos em temperatura ambiente. Depois, remova a solução de poli-L-lisina do chip.

Após a segunda lavagem, seque cuidadosamente as bordas do ferrolho sem tocar na superfície do aparo. Seque firmemente o chip usando ar comprimido, como demonstrado anteriormente. Ao seccionar o tecido FFPE, não toque diretamente no chip e cubra apenas 80% do chip com papel.

Para preparar dois microlitros de solução de coloração de DNA de fita simples em buffer SSC, diluir o reagente de DNA de fita simples Qubit com buffer SSC 5X. Crie uma mistura mestre da solução de coloração usando uma diluição de um a 20 de inibidor de ribonuclease, uma diluição de 1 a 200 da solução de DNA de fita simples, e o volume restante com tampão de SSC 5X. Adicione 150 microlitros de solução de coloração a cada lasca e incube no escuro em temperatura ambiente por cinco minutos.

Depois, remova delicadamente a solução de mancha do canto de cada lasca usando uma pipeta. Após lavar o chip duas vezes com 0,1X SSC buffer por 10 a 15 segundos, seque cuidadosamente as bordas do ferrolho. Adicione aproximadamente de três a cinco microlitros de glicerol na lâmina para montá-la.

Coloque um coverslip cerca de um centímetro acima do ferrolho, mantendo-o nivelado e garantindo que não toque a superfície do chip. Capture imagens fluorescentes de tecido de fita simples tingido com DNA usando um microscópio de campo amplo, garantindo 10% de sobreposição entre os blocos de imagem. Unam as imagens adquiridas em softwares de processamento de imagens, como o ImageJ, primeiro utilizando sobreposição teórica para gerar posições aproximadas dos tiles, depois aplicando sobreposição computacional de correspondência de pixels para ajustar o mosaico.

Processe as imagens unidas no software StereoMap e confirme que o controle de qualidade da imagem passou antes de continuar. Submerga o deslizador de sequenciamento estéreo em 30 mililitros de buffer SSC 0,1X até que o deslize de cobertura se solte. Certifique-se de que o reagente de descruzamento FFPE esteja em temperatura ambiente e inspecione em busca de partículas.

Ligue o termociclador e ajuste para 30 graus Celsius para equilíbrio, 95 graus Celsius para uma incubação de 30 minutos e mantenha infinitamente em quatro graus Celsius. Monte a junta da fita e coloque o deslizador do chip de sequenciamento estéreo dentro da fita. Depois, adicione o reagente FFPE de descruzamento no poço da fita de deslizamento estéreo, aplique fita de vedação na fita e confirme que está bem vedada.

Comece a incubação de 30 minutos a 95 graus Celsius. Após 10 minutos, coloque 25 mililitros de metanol em um recipiente de 50 mililitros em um freezer a 20 graus Celsius, preparando cerca de um mililitro por lâmina para uso posterior. Após remover o chip do termociclador, transfira o deslizante para a bancada e retire a fita de vedação.

Usando uma pipeta, remova e descarte o reagente FFPE de reticulação da. Depois que o reagente for completamente removido, desconecte a fita e a junta e descarte-os. Sob uma capela de fumaça estéril, seque a borda do ferrolho e aplique uma nova câmara de silicone se necessário.

Adicione 500 microlitros de metanol gelado do freezer de 20 graus Celsius, garantindo que toda a seção fique submersa. Pré-aqueça a solução PR em um bloco seco a 37 graus Celsius por 10 minutos antes do uso. Após a fixação, em uma exaustão, remova qualquer excesso de metanol da lâmina e espere o metanol restante no chip evaporar.

Montar uma nova junta de extremidade de. Após a evaporação, coloque o slide do chip estéreo na fita. Adicione 200 microlitros de reagente de permeablização pré-aquecido ao chip.

Aplique fita de vedação na fita de slide de sequenciamento estéreo e certifique-se de que ela esteja bem vedada. Realize transcrição reversa e depois liberação e purificação de CDNA seguindo os passos mostrados aqui. Pré-aqueça água sem nuclease a 37 graus Celsius.

Remova a vedação do chip. Pipete vigorosamente em cada canto e no centro da lasca, sobre o papel de papel, sem raspar ou tocar. Reúna toda a mistura gratuita de liberação de DNA do chip e transfira-a para um tubo centrífugo de 1,5 ou 2,0 mililitros.

Adicione 350 microlitros de água pré-aquecida sem nuclease diretamente sobre a superfície do chip. Pipete vigorosamente com uma pipeta menor, inclinando a ponta para aplicar força pura sem tocar no tecido ou raspar a lasca. Combine a lavagem com os 400 microlitros da mistura de liberação de DNA complementar coletada anteriormente, garantindo que apenas o material de um único chip seja combinado.

Coloque 100 microlitros de água sem nuclease no chip. Fele o slide de sequenciamento estéreo e armazene-o na geladeira até o fim do protocolo. A segmentação de célula única usando o pipeline SAW foi realizada em seções FFPE, permitindo o mapeamento para RNAs não poliadenilados, como tRNA, TRDMT1.

Visualizações espaciais interativas mostravam tipos de células supostamente ativas usando o software proprietário StereoMap, com clusters exibidos em várias cores em uma região ampliada do tecido. A expressão de todo o tecido do RNA não poliadenilado TRDMT1 foi visualizada usando StereoPi. As adaptações do protocolo abordam questões que tivemos no perfil espacial de transcriptômica completa de tecidos adiposos e frágeis, melhorando a adesão tecidual, a acessibilidade ao RNA e o manuseio para estereo-seqs nesses tipos de tecido difíceis.

O stereo-seq atualmente oferece resolução maior do que outros métodos transcriptômicos espaciais, com uma resolução de 500 nanômetros em comparação com dois mícrons. Também fornece captura imparcial necessária para o estudo do microbioma, transcritos virais e não poliadenilados.