3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

O objetivo geral deste método é capturar e sequenciar o mRNA em três extremidades primárias, permitindo assim estudos de processamento de mRNA, particularmente clivagem e poliadenilação de três extremidades principais, bem como a quantificação da expressão gênica. O protocolo A-seq2 e o pacote de análise de dados aqui apresentados podem ajudar a responder a perguntas-chave sobre a geração e função de isoformas de transcrição em diferentes tipos de células e tecidos. As principais vantagens do método A-seq2 são que ele evita o sequenciamento por meio de longos trechos poli(A)e não gera dímeros adaptadores.

Células que crescem até 80% de confluência são usadas para este procedimento. Remova o meio de crescimento e lave as células uma vez com PBS. Lisar diretamente as células na placa adicionando um mililitro de tampão de lise por poço e usando uma espátula de borracha para separar completamente o material da célula da superfície da placa.

Use uma ponta de pipeta de um mililitro para transferir o lisado viscoso de cada poço para um tubo de plástico de 15 mililitros. Compartilhe o DNA com uma seringa de um mililitro conectada a uma agulha hipodérmica de calibre 23. Execute vários movimentos vigorosos para cima e para baixo do êmbolo, até que o lisado não seja mais viscoso.

Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mililitro. Gire a 20.000 vezes g e quatro graus Celsius por cinco minutos, para remover os detritos. Coletar o sobrenadante claro do lisado.

Adicione ao oligo d (T) 25 esferas magnéticas e ressuspenda a mistura. Coloque os tubos em uma roda giratória por 10 minutos. Em seguida, coloque os tubos em um rack magnético por dois minutos.

Remova o líquido claro. Adicione 0,8 mililitros de tampão A a cada tubo e gire o tubo em 180 graus duas a três vezes. Remova o tampão A da segunda lavagem.

Adicione 0,8 mililitros de tampão B a cada tubo e deixe na grelha por dois minutos. Para eluir o mRNA ligado dos grânulos, remova o tampão B, adicione 33 microlitros de água a cada tubo e ressuspenda os grânulos. Aqueça a 75 graus Celsius por cinco minutos em um bloco de coração.

Imediatamente, gire os tubos por um segundo e coloque-os no rack magnético. Transferir o sobrenadante para um novo tubo. Adicione 66 microlitros de tampão de hidrólise alcalina a cada tubo, misture e aqueça a 95 graus Celsius por exatamente cinco minutos em um bloco de aquecimento.

Imediatamente, resfrie os tubos no gelo. Posteriormente, execute o isolamento de RNA usando um kit de limpeza de RNA, conforme descrito no protocolo de texto. Para iniciar este procedimento, adicione a cada amostra de RNA 14 microlitros de um Master Mix de polinucleotídeo quinase.

Incubar a 37 graus Celsius, por 30 minutos. Após 30 minutos, carregue as reações de quinase em colunas de centrifugação preparadas. Gire as colunas em 735 vezes g por dois minutos.

Descarte as colunas e coloque os tubos com reações coletadas no gelo. Para bloquear as três extremidades primárias dos fragmentos de RNA para evitar sua concatemerização em reações de ligação subsequentes, adicione a cada amostra 17,5 microlitros de uma poli(A)polimerase Master Mix. Misture e gire por um segundo.

Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, adicione 32,5 microlitros de água a cada reação e purifique o RNA, conforme descrito no protocolo de texto. Inicie este procedimento colocando as reações em um concentrador de vácuo por 10 minutos, para reduzir o volume para seis microlitros.

Em seguida, adicione a cada reação 24 microlitros de um Master Mix de RNA ligase. Incubar as reações em um misturador aquecido a 24 graus Celsius por 16 horas, com mistura intermitente a mil RPM. No dia seguinte, adicione 17 microlitros de água a cada reação e misture.

Purifique o RNA, conforme descrito no protocolo de texto. Colocar os eluites num concentrador de vácuo durante três minutos, para reduzir o volume para 11 microlitros. Transfira as reações para tubos de PCR de 200 microlitros para a reação de transcrição reversa.

Adicione um microlitro de primer. Aqueça a 70 graus Celsius em um ciclador de PCR por cinco minutos e depois deixe em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione oito microlitros de um Master Mix de transcrição reversa a cada tubo e misture.

Coloque os tubos em um ciclador de PCR. Aqueça a 55 graus Celsius por 10 minutos e a 80 graus Celsius por mais 10 minutos. Mantenha no gelo.

Prepare grânulos de estreptavidina, conforme descrito no protocolo de texto. Adicione a reação de transcrição reversa à solução de esferas e incube a quatro graus Celsius em uma roda giratória por 20 minutos. Usando um rack magnético, lave as esferas duas vezes com tampão de ligação de biotina e duas vezes com tampão TEN.

Ressuspenda os grânulos em 50 microlitros de tampão RTE. Adicione dois microlitros de mistura enzimática de uracila DNA glicosilase e incube a 37 graus Celsius por uma hora em um misturador, com mistura intermitente. Adicione 50 microlitros de água, 11 microlitros de tampão RNase H e um microlitro de Rnase H, a cada reação.

Incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Coloque os tubos no rack magnético e transfira o líquido contendo o cDNA clivado para um novo tubo. Purifique o cDNA clivado usando um kit de purificação por PCR, conforme descrito no protocolo de texto.

Coloque o cDNA purificado em um concentrador a vácuo por oito minutos para concentrar em um volume de sete microlitros. Para ligar cinco adaptadores primos às cinco extremidades primárias do cDNA isolado, adicione a cada amostra 23 microlitros de um Master Mix de RNA ligase e incube a 24 graus Celsius por 20 horas. Por fim, adicione 70 microlitros de água a cada reação.

Uma PCR piloto é realizada para determinar o número ideal de ciclos de PCR para atingir a amplificação da biblioteca, dentro da fase exponencial. Pipete o seguinte em um tubo de PCR de 200 microlitros: 25 microlitros de mistura de DNA polimerase, 20 microlitros de reação de ligação, dois microlitros de água, 1,5 microlitro de primer de PCR direto e 1,5 microlitro de primer de índice de PCR reverso. Execute o ciclador com o seguinte programa: três minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 20 ciclos de 20 segundos a 98 graus Celsius, 20 segundos a 67 graus Celsius e 30 segundos a 72 graus Celsius.

Colete sete alíquotas de microlitros diretamente do ciclador, após os ciclos indicados. Separe os produtos em um gel de agarose a 2% e visualize a migração dos produtos de PCR. Determine o número de ciclos no início da amplificação exponencial, 12 ciclos neste exemplo, e use esse número de ciclos para uma reação de PCR em larga escala.

Separe os produtos da reação de PCR em larga escala em um gel de 2% de agarose e corte as fatias de gel contendo 200 a 350 produtos de DNA de nucleotídeos. Posteriormente, extraia o DNA das fatias de gel com o kit de extração de gel, conforme descrito no protocolo de texto. Apenas as etapas computacionais mais importantes serão mostradas neste vídeo.

Mais detalhes estão disponíveis no protocolo de texto. Comece clonando o repositório Git e alterando para o diretório recém-criado. Crie um ambiente que contenha o software e ative esse ambiente.

Baixe a sequência do genoma do organismo, da qual os dados A-seq2 foram obtidos. Abra o arquivo de configuração e defina os parâmetros de entrada, conforme indicado no protocolo de texto. Inicie a análise.

A resposta de um gene específico, NUP214, ao knockdown da proteína HNRNPC, foi examinada pela análise de leituras a-seq2 de duas amostras de células HEK-293, tratadas com um pequeno RNA interferente de controle ou com um pequeno RNA interferente HNRNPC. As leituras que documentaram os poli(A)sites anotados pelo pipeline de análise foram salvas no formato BAM, que foi usado como entrada para o navegador do genoma IGD. As três extremidades primas dos picos de leitura, mapeadas em mMRNA, três extremidades primárias que são anotadas no conjunto.

Os perfis indicam um aumento do uso da isoforma UTR longa de três primos após o knockdown do HNRNCR. Uma vez dominado, o protocolo A-seq leva oito horas de tempo prático ou cerca de dois a três dias, sem contar o tempo para a cultura de células e as ligaduras noturnas. Ao tentar o protocolo, é importante primeiro projetar um conjunto primitivo que esteja em conformidade com a plataforma de sequenciamento usada em seu local.

Depois de obter as três extremidades primárias do mMRA, outros métodos, como reticulação e imunoprecipitação, podem ser pré-formados, para identificar os reguladores do processamento pré-mRNA das três extremidades principais. O A-seq2 abriu caminho para pesquisadores no campo do processamento de RNA explorarem a regulação e as consequências da poliadenilação alternativa em tipos de células individuais. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter um bom entendimento sobre como gerar bibliotecas de mRNA de três extremidades principais, analisar seus dados de sequenciamento, identificar novos poli(A)sites e quantificar seu uso.

Esperamos que o A-seq2 facilite seu trabalho de iniciar a regulação do processamento de mRNA e leve a muitos novos insights.