Name: 3 final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2017-10-10T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 1 s
Description: Aprenda a preparar bibliotecas de extremidades 3' de mRNA usando o protocolo A-seq2 para análise de processamento de pré-mRNA e quantificação de expressão gênica. Este método evita poli(A) longos e dímeros de adaptadores.

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Os autores agradecer dona Béatrice Dimitriades ajuda com a cultura de células. Este trabalho foi financiado pela Fundação de ciência nacional Suíça concede #31003A_170216 e 51NF40_141735 (RNA NCCR &#38; doença).

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<li>Spies, N., Burge, C. B., Bartel, D. P. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27+UTR-isoform+choice+has+limited+influence+on+the+stability+and+translational+efficiency+of+most+mRNAs+in+mouse+fibroblasts%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">3' UTR-isoform choice has limited influence on the stability and translational efficiency of most mRNAs in mouse fibroblasts.</a> Genome Res. 23 (12), 2078-2090 (2013).</li>
<li>Hoque, M., Ji, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Analysis+of+alternative+cleavage+and+polyadenylation+by+3%27+region+extraction+and+deep+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Analysis of alternative cleavage and polyadenylation by 3' region extraction and deep sequencing.</a> Nat. methods. 10 (2), 133-139 (2013).</li>
<li>Martin, G., Gruber, A. R., Keller, W., Zavolan, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genome-wide+analysis+of+pre-mRNA+3%E2%80%99+end+processing+reveals+a+decisive+role+of+human+cleavage+factor+I+in+the+regulation+of+3%27+UTR+length%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Rep%22%5BJournal%5D)">Genome-wide analysis of pre-mRNA 3’ end processing reveals a decisive role of human cleavage factor I in the regulation of 3' UTR length.</a> Cell Rep. 1 (6), 753-763 (2012).</li>
<li>Gruber, A. R., Martin, G., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+3%27+UTR+shortening+has+a+limited+effect+on+protein+abundance+in+proliferating+T+cells%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+Commun%22%5BJournal%5D)">Global 3' UTR shortening has a limited effect on protein abundance in proliferating T cells.</a> Nat. Commun. 5, 5465(2014).</li>
<li>Kivioja, T., Vähärautio, A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Counting+absolute+numbers+of+molecules+using+unique+molecular+identifiers%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">Counting absolute numbers of molecules using unique molecular identifiers.</a> Nat. methods. 9 (1), 72-74 (2011).</li>
<li>Gruber, A. J., Schmidt, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+comprehensive+analysis+of+3%27+end+sequencing+data+sets+reveals+novel+polyadenylation+signals+and+the+repressive+role+of+heterogeneous+ribonucleoprotein+C+on+cleavage+and+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">A comprehensive analysis of 3' end sequencing data sets reveals novel polyadenylation signals and the repressive role of heterogeneous ribonucleoprotein C on cleavage and polyadenylation.</a> Genome Res. 26 (8), 1145-1159 (2016).</li>
<li>Lingner, J., Keller, W. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((3%27-end+labeling+of+RNA+with+recombinant+yeast+poly%28A%29+polymerase%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">3'-end labeling of RNA with recombinant yeast poly(A) polymerase.</a> Nucleic Acids Res. 21 (12), 2917-2920 (1993).</li>
<li>Quail, M. A., Kozarewa, I., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+large+genome+center%27s+improvements+to+the+Illumina+sequencing+system%5BTitle%5D)+AND+%22Nat.+methods%22%5BJournal%5D)">A large genome center's improvements to the Illumina sequencing system.</a> Nat. methods. 5 (12), 1005-1010 (2008).</li>
<li>Rahmann, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Snakemake--a+scalable+bioinformatics+workflow+engine%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">Snakemake--a scalable bioinformatics workflow engine.</a> Bioinformatics. 28 (19), 2520-2522 (2012).</li>
<li>Analytics, C. Anaconda Software Distribution. , Available from:
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<li>Lab, H. FASTX-Toolkit - Hannon Lab. , Available from:
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<li>Dobin, A., Davis, C. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((STAR%3A+ultrafast+universal+RNA-seq+aligner%5BTitle%5D)+AND+%22Bioinformatics%22%5BJournal%5D)">STAR: ultrafast universal RNA-seq aligner.</a> Bioinformatics. 29 (1), 15-21 (2013).</li>
<li>Martin, M. <a target="_blank" href="http://journal.embnet.org/index.php/embnetjournal/article/view/200">Cutadapt removes adapter sequences from high-throughput sequencing reads.</a> EMBnet.journal. 17 (1), 10-12 (2011).</li>
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<li>Yao, C., Biesinger, J., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Transcriptome-wide+analyses+of+CstF64-RNA+interactions+in+global+regulation+of+mRNA+alternative+polyadenylation%5BTitle%5D)+AND+%22Proc.+Natl.+Acad.+Sci.+U.+S.+A%22%5BJournal%5D)">Transcriptome-wide analyses of CstF64-RNA interactions in global regulation of mRNA alternative polyadenylation.</a> Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 109 (46), 18773-18778 (2012).</li>
<li>Lin, Y., Li, Z., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((An+in-depth+map+of+polyadenylation+sites+in+cancer%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">An in-depth map of polyadenylation sites in cancer.</a> Nucleic Acids Res. 40 (17), 8460-8471 (2012).</li>
<li>Shepard, P. J., Choi, E. -A., Lu, J., Flanagan, L. A., Hertel, K. J., Shi, Y. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complex+and+dynamic+landscape+of+RNA+polyadenylation+revealed+by+PAS-Seq%5BTitle%5D)+AND+%22RNA%22%5BJournal%5D)">Complex and dynamic landscape of RNA polyadenylation revealed by PAS-Seq.</a> RNA. 17 (4), 761-772 (2011).</li>
<li>Fu, Y., Sun, Y., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Differential+genome-wide+profiling+of+tandem+3%27+UTRs+among+human+breast+cancer+and+normal+cells+by+high-throughput+sequencing%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Differential genome-wide profiling of tandem 3' UTRs among human breast cancer and normal cells by high-throughput sequencing.</a> Genome Res. 21 (5), 741-747 (2011).</li>
</ol>

Os autores não têm nada para divulgar.

A multidão de núcleo e fatores auxiliares que estão envolvidos no processamento de pre-mRNA 3' final é refletida em uma paisagem de poliadenilação correspondentemente complexo. Além disso, poliadenilação também é sensível a mudanças em outros processos como transcrição e emenda. 3' sites de clivagem final em pre-mRNAs são normalmente identificados com base nas caudas poli característicos que são adicionadas aos produtos de clivagem 5'. A maioria dos métodos usar primers oligo (descolamento) de comprimentos variáveis que permitem a conversão específica de poli (A)-contendo mRNAs de cDNAs em uma reação de transcrição reversa. Um problema comum desta abordagem é interna escorva para sequências A rica resultando em sítios de clivagem diferente. Dois métodos que visam contornar este artefato na fase de preparação da amostra têm sido propostos. No método 3P-seq 1, adaptadores são especificamente ligados às extremidades de caudas poli (a) com a ajuda de uma tala oligo seguido por digestão parcial de RNase T1 e transcrição reversa com TTP na reação como a única deoxynucleotide. As resultante poly(A)-poly(dT) heteroduplexes são então digeridos com RNase H e os restantes fragmentos de RNA são isolados, ligados a adaptadores e sequenciados. Um método mais simples e elegante, 2P-seq, que usa uma cartilha de sequenciamento personalizado saltando o trecho restante de oligo (descolamento) na reação de sequenciamento foi relatado pelo mesmo autores 2. Em um método relacionado, 3' lê 3, um primer extraordinariamente longo de 5 nós e 45 Ts, também contendo uma biotina são recozidos para RNA fragmentado, seguido de lavagens rigorosas para selecionar para moléculas de RNA com caudas poli (a) de mais de 50 nucleótidos. Embora 3' leituras reduz drasticamente a frequência de escorva interna, ela não completamente elimina- 3. Protocolos para a sequenciação do ARN direto também têm sido propostos, mas o lê resultante é curto e têm uma alta taxa de erro e essa abordagem não tem sido ainda mais desenvolvidos 18,19,20. A PolyA-Seq e os protocolos de Quant Seq comercializados combinam escorva (descolamento) oligo baseado com um passo de escorva aleatórios para a segunda vertente do cDNA síntese 20. O uso da reação de transcrição reversa do interruptor de modelo com a transcriptase reversa Moloney Murine leucemia vírus (MMLV) leva à geração de cDNAs com linkers em uma única etapa e desse modo não dímeros de adaptador podem aparecer no PAS-Seq e métodos SAPAS 21 , 22.
O método A-seq2 apresentado aqui se destaca em sua utilização de um nucleotídeo cleavable (dU) dentro de uma cartilha de oligo (descolamento) biotinilado. Esta modificação combina o utilitário de enriquecimento de oligo (descolamento) hibridizada, polyadenylated alvos com a remoção da maioria dos25 sequência oligo (dT) dos fragmentos isolados antes de bibliotecas são preparadas e a preservação de três Ts, que indica a presença anterior da cauda poli (a). Em contraste, métodos que utilizam o RNase H para retirar poli (a) as moléculas de RNA aleatoriamente deixam vários como. Desde em A-seq2, sequenciamento é feito da extremidade 3' dos fios antisenso, sítios de clivagem são preditos para ser localizado após o motivo NNNNTTT no início da sequência primas leituras. Os estudo randomizados tetrâmeros servem não só para permitir base chamando mas também na eliminação de artefatos de amplificação do PCR. Mais UMIs também podem ser acomodados. A possibilidade de escorva interna permanece em A-seq2 e é dirigida computacionalmente, primeiro descartando 3' termina com uma sequência de jusante codificado em genomically, A rica e, em seguida, descartando 3' clusters de final que poderiam ser explicadas pela ferragem interna na Sinal de poli A-ricos em si. Uma análise recente de sites de poli inferida com exclusividade por um grande número de protocolos indica que os sites que são exclusivos para A-seq2 têm o nucleotídeo esperada distribuição e localização dentro de genes, semelhantes a outros 3' acabar com protocolos de sequenciamento.
Um passo fundamental na-seq2 é a seleção de polyadenylated RNA e remoção de RNAs ribossomal e vários pequenos RNAs. Isso é feito facilmente por um kit de mRNA-isolamento com grânulos magnético de oligo (dT)25 . Em princípio, o RNA total isolado com fenol contendo soluções também dá alta qualidade do RNA que pode ser ainda mais sujeitos a seleção pelo kit de isolamento do mRNA ou agarose oligo (dT). Uma etapa que pode ser variada em A-seq2 é o tratamento com hidrólise alcalina, que pode ser reduzido ou estendido para obter fragmentos de RNA de tamanhos diferentes. Crítica também é que a adição de dATP 3' para 3' extremidades dos fragmentos de RNA pelo polymerase de poli é eficiente. O protocolo descrito aqui, este tratamento é aplicado para todos os fragmentos de RNA, para evitar concatemerization durante a reação de ligadura. Finalmente, notamos que, embora ligase RNA 1 é normalmente usado como um ligase do RNA, também ligates eficientemente único ADN encalhado, como fizemos aqui para ligar um adaptador à extremidade 5' das moléculas de cDNA.
Assim, A-seq2 é um eficiente e fácil de implementar o protocolo para a identificação de pre-mRNA' a extremidade 3 sites de processamento. Os desenvolvimentos futuros podem incluir reduzindo ainda mais a complexidade do protocolo e a quantidade de material necessário. O conjunto associado de ferramentas de análise de dados computacionais mais habilitar o processamento homogêneo de 3' fim leituras obtidas com uma grande variedade de protocolos de sequenciamento.

A captura e sequenciamento de mRNA 3' extremidades permite o estudo do processamento do mRNA e a quantificação da expressão gênica. Devido a suas caudas poli, mRNAs eucarióticos podem ser eficientemente purificados de lisado celular total com grânulo-imobilizado oligo-cromatografia (moléculas oligo(dT)), que também pode aprontar a síntese do cDNA. No entanto, esta abordagem tem dois inconvenientes. Primeiro, trechos de A's que são interno para transcrições também podem prime síntese do cDNA, resultando em sites de poli espúrias. Poli (a) homogênea, segundo trechos representam desafios específicos para sequenciamento, além de não ser informativo para identificação de transcrição. Várias abordagens têm sido propostas para contornar essas limitações, tais como a transcrição reversa através de poli caudas seguidas por digestão RNase H (3P-seq. 1), uso de um primer de sequenciamento personalizado terminando em 20 Ts (2P-seq. 2), pré-selecção de Fragmentos de RNA com caudas poli (a) de mais de 50 nucleótidos com um primer de45 CU5T seguido por digestão RNase H (3' leituras 3) e o uso de um primer de oligo-dT que contém o adaptador 3' em um grampo de cabelo (A-seq. 4).
O recentemente desenvolvido A-seq2 método 5 destina-se a ignorar o sequenciamento através de poli (a) e ao mesmo tempo minimizar a proporção de dímeros são gerados pelo auto ligadura dos adaptadores, ocorrendo especialmente quando a concentração molar de adaptadores supera a concentração de inserção. Este problema pode ser eliminado quando ambos os adaptadores são ligados para o mesmo tipo de polinucleotídicas termina como em A-seq2, onde os 3' adaptadores são ligados à extremidade 5' do RNA fragmentos e os adaptadores de 5' para 5' extremidades dos cDNAs após a transcrição reversa. O método é mais conveniente do que a nossa anteriormente proposto A-seq - no qual sequenciamento foi no 5'-para-3' direção que exige precisamente controlado RNA fragmentação-, mantendo uma alta precisão de identificação de site do poli (a). Cerca de 80% das leituras sequenciais em amostras típicas mapear com exclusividade para o genoma e levar a identificação de mais de 20.000 clusters poli local, mais de 70% das quais se sobrepõem com anotada 3' UTRs.
Em breve, o protocolo A-seq2 começa com fragmentação de mRNA e ligadura dos adaptadores reverso-complemento 3' para as extremidades 5' de fragmentos de RNA. Poli (A)-contendo RNAs são então reversos transcritas com um primer de longa (descolamento) oligo 25 nucleotídeos (nt) que contém um nucleotídeo âncora na extremidade 3', um dU na posição 4 e uma biotina na extremidade 5', que permite a ligação do cDNA de grânulos magnético estreptavidina. A maioria da primeira demão, incluindo a biotina, é removido o cDNA por clivagem em dU por mistura de enzima do usuário, contendo Uracil DNA glycosylase (UDG) e o DNA glycosylase-liase Endonuclease VIII. Esta reação deixa extremidades intactas para a ligadura de um adaptador de 5' e 3 Ts esquerda após clivagem permanecem marcar o local da cauda poli (a). Porque tanto 5' e 3' adaptadores são anexados pela ligadura para destinatário 5' extremidades, dímeros nenhum adaptador são gerados. Quatro nucleótidos aleatório-mers introduzidos no início de leituras permite a resolução de cluster em instrumentos de sequenciamento de estado-da-arte e também pode servir como identificador exclusivo molecular (UMI) para a detecção e remoção de artefatos de amplificação do PCR. O tamanho do UMI pode ser aumentado como feito em outros estudos 6. O protocolo gera leituras que são inverter complementar ao mRNA 3' extremidades, tudo iniciando com um tetrâmero randomizado, seguido por 3 Ts. processamento de leituras que têm os 3 Ts diagnósticos no final inicia sua 5' com a correção de artefatos de amplificação do PCR por explorando os UMIs, remoção de sequências de 3' adaptador e reverter a complementação. Leituras que podem ter se originado de escorva de oligo (descolamento) em sites internos A rica também são identificadas computacionalmente e descartadas. Os sites espúrios geralmente faltam um dos 18 bem caracterizadas e conservada poli sinais que devem ser localizado ~ 21 nucleotídeos upstream da clivagem aparente local 7.
O protocolo exige cerca de 8 h tempo hands-on, sem contar com a cultura de células e a ligadura durante a noite. O associado Leia análise software permite uma identificação de site poli altamente precisos. Do site da poli aglomerados criados com baseados em 4 amostras mais destacadas nesta sobreposição de 84% do manuscrito (duas repetições biológicos de controle siRNA e si-HNRNPC-tratada células) com um gene anotado e destes, 75% de sobreposição com um 3' UTR e 86% com qualquer um 3' UTR ou um terminal exon. O coeficiente de correlação de Pearson de expressão de 3' extremidades nas amostras de replicar é 0,92, e valores de acima de 0,9 normalmente são obtidos com o método. Assim, A-seq2 é um método conveniente que dá resultados muito reprodutíveis.

<table><tbody><tr><td><forte>Materiais</forte></td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Agarose, ultra puro</td><td>Invitrogen</td><td>16500-500</td><td></td></tr><tr><td>2100 Bioanalisador</td><td>Agilent</td><td>G2940CA</td><td></td></tr><tr><td>Trifosfato de cordicepina (3' dATP)</td><td>SIGMA</td><td>C9137</td><td></td></tr><tr><td>Frascos de baixa ligação de DNA, 1,5 ml</td><td>Eppendorf</td><td>22431021</td><td></td></tr><tr><td>Dulbecco&rsquo; s Fosfato Tampolado Solução Salina</td><td>SIGMA</td><td>D8637</td><td></td></tr><tr><td>Dynabeads mRNA-DIRECT Kit</td><td>Ambion</td><td>AM61012</td><td></td></tr><tr><td>Corante GR-Verde</td><td>Excellgen</td><td>EG-1071</td><td>use 1:10.000 dillution</td></tr><tr><td>HiSeq 2500 ou NextSeq 500 sequenciadores de próxima geração</td><td>Illumina</td><td>informe-se com o fornecedor</td><td></td></tr><tr><td>KAPA HiFi Hotstart DNA polimerase mix</td><td>KAPA/Roche</td><td>KK2602</td><td></td></tr><tr><td>Água livre de nuclease</td><td>Ambion</td><td>AM9937</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) polimerase, levedura</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>74225Z25KU</td><td></td></tr><tr><td>Poli(A) polimerase, E.coli</td><td>New England Biolabs</td><td>M0276L</td><td></td></tr><tr><td>Polinucleotídeo quinase</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>EK0032</td><td></td></tr><tr><td>QIAEX II Kit de extração de gel</td><td>Qiagen</td><td>20021</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Purificação de PCR QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28104</td><td></td></tr><tr><td>Kit de Extração de Gel QIAquick</td><td>Qiagen</td><td>28704</td><td></td></tr><tr><td>RNA ligase 1, alta concentração</td><td>New England Biolabs</td><td>M0437M</td><td>inclui PEG-8000</td></tr><tr><td>RNeasy MinElute RNA Cleanup kit</td><td>Qiagen</td><td>74204</td><td></td></tr><tr><td>RNase H</td><td>New England Biolabs</td><td>M0279</td><td></td></tr><tr><td>RNasin Plus, inibidor de ribonuclease</td><td>Promega</td><td>N2618</td><td></td></tr><tr><td>Transcriptase reversa Superscript IV</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td>18090050</td><td></td></tr><tr><td>Turbo DNase</td><td></td><td>Ambion AM2238</td><td></td></tr><tr><td>USER mistura enzimática</td><td>New England Biolabs</td><td>M5505</td><td></td></tr><tr><td>Dyna-Mag-2 rack magnético</td><td>Thermo Fisher Scientific</td><td>12321D</td><td></td></tr><tr><td>Thermomixer C</td><td>Eppendorf</td><td>5382000015</td><td>Misturador aquecido com tampa aquecida</td></tr><tr><td>Colunas MicroSpin</td><td>GE-Healthcare</td><td>27-5325-01</td><td></td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Buffers</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>Alkaline tampão de hidrólise, 1,5 x</td><td></td><td></td><td>Mix 1 parte 0,1 M Na2CO3 e 9 partes 0,1 M NaHCO3. Adicionar EDTA a 1 mM. Ajuste o pH para 9,2. Armazene alíquotas a -20 °C.</td></tr><tr><td>5x tampão poli(A) polimerase</td><td>Thermo Fisher Scientiific</td><td></td><td>100 mM Tris-HCl, pH 7.0, 3 mM MnCl2, 0.1 mM EDTA, 1 mM DTT, 0.5 mg/ml BSA acetilado, 50% glicerol</td></tr><tr>Tampão <td></td><td></td><td>de ligação à biotina</td><td>20 mM Tris&shy; Cl pH 7,5, 2 M NaCl, 0,1% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>TEN buffer</td><td></td><td></td><td>10 mM Tris&shy; Cl, pH 7,5, 1 mM EDTA, 0,02% NP&shy; 40</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Sequência</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos de acordo com os kits de preparação de amostras de RNA pequeno Illumina TruSeq, para sequenciadores GA-IIx e Hiseq2000/2500</td><td>Microsynth</td><td></td><td></td></tr><tr><td>revRA3 (RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; CCUUGGCACCCGAGAAUUCCA&shy; 3'</td></tr><tr><td>revDA5</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino&shy; GTTCAGAGTTCTACAGTCCGAC GATCNNNN-3'</td></tr><tr><td>Bio-dU-dT25, primer RT</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' Biotina-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN 3' (V = G, A ou C)</td></tr><tr><td>Primer PCR para frente, RP1</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' AATGATACGGCGACCACCGAGA TCTACACGTTCAGAGTTCTACAG TCCGA 3'PCR</td></tr> <tr><td>primer reverso, RPI1, código de barras em negrito</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' CAAGCAGAAGACGGCATACGAG 
ATCGTGATGTGACTGGAGTTCCT 
TGGCACCCGAGAATTCCA 3'</td></tr><tr><td>Nome</td><td>Empresa</td><td>Número de catálogo</td><td>Comentários</td></tr><tr><td>Oligonucleotídeos de acordo com os kits de preparação de amostras de RNA Illumina TruSeq HT-Small para sequenciadores HiSeq2000/2500</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>HT-rev3A (DNA/RNA)</td><td>Microsynth</td><td></td><td>5'-amino-GTGACTGGAGTTCAGACGTG 
CTCTTCCrGrAUrC-3'HT-rev5A</td></tr> <tr><td></td><td>Microsynth</td><td></td><td>5' amino-ACACTCTTTCCCTACACGACGCT 
CTTCCGATCTNNNN</td></tr> <tr><td>3'Bio-dU-dT25, primer RT</td><td>Microsynth</td><td></td> 5' Biotina-TTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTT-dU-TTTVN <td>3'PCR</td></tr> <tr><td>primers para frente (D501-506)</td><td>Microsynth ou Illumina</td><td></td><td>5'-AATGATACGGCGACCACCGAGAT CTACAC[i5]ACACTCTTTCCCTACA CGACGCTCTTCCGATCT -3'PCR</td></tr> <tr><td>primers reverso (D701-D712)</td><td>Microsynth ou Illumina</td><td></td><td>5'-CAAGCAGAAGACGGCATACGAG A[i7]GTGACTGGAGTTCAGACGTG TGCTCTTCCGATC-3'Documentação</td></tr> <tr><td>para multiplexação Illumina:</td><td>Illumina</td><td></td><td>https://support.illumina.com/content/dam/illumina-support/documents/documentation/chemistry_documentation/experiment-design/illumina-adapter-sequences_1000000002694-01.pdf</td></tr></tbody></table>

3' final de preparação da biblioteca com a-seq2 de sequenciamento

3' End Sequencing Library Preparation with A-seq2

Estudos na última década têm revelado uma variedade complexa e dinâmica de clivagem pre-mRNA e reações de poliadenilação. mRNAs com tempo de 3' não regiões (UTRs) são gerados em células diferenciadas, Considerando que pilhas proliferating preferencialmente expressam transcrições com curta 3' UTRs. Descrevemos o protocolo A-seq, agora em sua segunda versão, que foi desenvolvido para mapear os sítios de poliadenilação todo o genoma e estudar o Regulamento de pre-mRNA 3' processamento final. Também este protocolo atual aproveita o polyadenylate (poly(A)) caudas que são adicionadas durante a biogênese dos mRNAs mamíferos mais enriquecer para mRNAs totalmente transformados. Um adaptador de DNA com deoxyuracil em sua quarta posição permite o processamento preciso de mRNA 3' final fragmentos para sequenciamento. Não incluindo a cultura de células e a ligadura durante a noite, o protocolo exige cerca de 8 h tempo hands-on. Junto com ele, é fornecido um pacote de software easy-to-use para a análise dos dados de sequenciamento derivada. A-seq2 e o software de análise associado fornecem uma solução eficiente e confiável para o mapeamento de pre-mRNA 3' termina em uma ampla gama de condições, a partir de 106 ou menos células.

Poli (A)-contendo RNA foi isolado de células cultivadas, fragmentadas por hidrólise alcalina e cDNAs foram feitos por reverter a transcrição com primers de oligo (descolamento). O cDNA resultante foi imobilizado em grânulos de estreptavidina, dU foi clivada na reação de excisão específico do uracil, adaptadores estavam ligados a 5' e 3' extremidades do fragmento clivado e as inserções foram sequenciadas. Figura 1 mostra um esquema gráfico do experimento.
Para células HeLa e HEK293, 106 células foram suficientes para identificar sites de poli (a) para a grande maioria dos genes codificantes de proteínas, no final do procedimento. No entanto, para outros tipos de células ou tecidos, pode ser necessário testar a saturação do número de sites identificados poli, como o número de células utilizadas no experimento aumenta. Passo resultados representativos do PCR do piloto e do fragmento de DNA análise da amostra antes de sequenciamento são mostrados na Figura 2.
A Figura 3 mostra as etapas de pré-processamento da análise computacional, a partir do arquivo de fastq obtidos a partir do sequencer e terminando com a qualidade verificada, adaptador-aparado diz que estão pronta a serem mapeados para o genoma. A Figura 4 mostra as etapas de análise que começam com o mapeamento das leituras para o genoma correspondente e o final com o catálogo de mRNA' a extremidade 3 sites que são identificados em uma amostra específica de processamento. Quando múltiplas amostras são analisadas, etapas adicionais são realizadas para coincidir com a extremidade 3' processamento sites que foram encontrados em amostras individuais e relatar sua abundância através de amostras. Estas etapas são mostradas na Figura 5.
Assim, uma vez que as amostras têm sido sequenciadas, a análise da sequência resultante ler arquivos (no formato fastq) por meio do pipeline de processamento disponível é simples. Depois de adicionar as informações sobre as amostras para o arquivo de configuração, a execução do gasoduto irá resultar em dois tipos principais de arquivos de saída: 1) cama-arquivos com todos os 3' acabam o processamento locais identificados em amostras individuais (por exemplo " Sample1.3pSites.noIP.Bed.gz") e 2) um cama-arquivo com clusters de local todos os poli (clusters.merged.bed), através de todas as amostras do estudo. A saída também inclui as coordenadas do genoma para todas as leituras de cada amostra individual (por exemplo, "sample1. STAR_out/aligned.sortedByCoord.out.bam") que mais tarde podem ser visualizados em um navegador de genoma como IGV16. Inspeção visual de FIS a leitura geralmente fornece um primeiro vislumbre da distribuição dos sítios de poli no genoma e as mudanças que ocorrem sobre as perturbações específicas que foram realizadas no estudo. Por exemplo, na Figura 6 é mostrada a resposta de um gene específico para o knock-down da proteína HNRNPC.
Resumos destas distribuições de todo o genoma são também fornecidos (tabela 1). Especificamente, os arquivos de saída no diretório "contagens/annotation_overlap" contêm frações de sites que se sobrepõem com características específicas anotadas (do arquivo gtf fornecido como entrada; anotados são: 3' UTR, terminal exon, exon, intrão, intergênica). Finalmente, para cada amostra, resultados das etapas de processamento individuais também são salvos (por exemplo, "sample1.summary.tsv"). Isso inclui os números de: crus leituras em cada amostra, leituras que têm a estrutura esperada da extremidade 5', leituras que permanecem após o colapso completa duplicatas PCR, alta qualidade lê de acordo com os critérios definidos no passo 9.2, lê o mapa com exclusividade para o genoma (depois de desmaiar aqueles que resultaram dos erros de sequenciamento, consulte a etapa 9.5), mapeamento multi lê (depois de desmaiar aqueles que resultaram dos erros de sequenciamento, consulte a etapa 9.5), sites em cada amostra, cru ' a extremidade 3 sites de processamento de processamento bruto (não-clusterizados) 3' final sem os potenciais candidatos internos de escorva, original 3' terminar processamento sites de todas as amostras sem candidatos de escorva interno e conjunto final de clusters de poli (a) local.
<img alt="Figure 1" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2.jpg"> 
Figura 1: etapas principais do protocolo A-seq2. Etapas individuais são indicadas no lado esquerdo da figura. Inserir fragmentos de RNA são retratados como linhas verdes que acendem uma luz vermelhas para cDNA após a transcrição reversa; adaptadores são coloridos em azul claro ou laranja. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig1v2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 2" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig2.jpg"> 
Figura 2: piloto do PCR e perfil do produto final. (um) alíquotas da reação de PCR foram coletadas em ciclos diferentes e separaram em gel de agarose 2%. Os números à esquerda indicam tamanho em nucleotídeos das respectivas bandas na escada de DNA. Neste experimento 12 ciclos (*) foram escolhidos para a reação de PCR de grande escala. (b) exemplo de uma amostra após a seleção de tamanho que executar em um analisador de tamanho de fragmento revelando um tamanho médio de cerca de 280 nucleotídeos. Os números à esquerda [FU] indicam a intensidade de sinal relativo. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig2large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 3" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig3.jpg"> 
Figura 3: esboço do pré-processamento de sequenciamento leituras. Os arquivos fastq com leituras que são gerados pelo software instrumento associado sequenciamento são processados para identificar leituras de alta qualidade que serão mapeadas para o genoma correspondente. A figura mostra a especificação de entrada/saída de etapas individuais no pipeline, com links para os passos individuais do protocolo descrito na seção "Processamento de dados". <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig3large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 4" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig4.jpg"> 
Figura 4: esboço da sequência ler processamento, desde a etapa de mapeamento de genoma para a geração de final individual 3' processamento sites. A figura mostra a especificação de entrada/saída de etapas individuais no pipeline, com links para o isão etapas do protocolo descrito na seção "Processamento de dados". O arquivo de saída principal que é entregue ao usuário é marcado em negrito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig4large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 5" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig5.jpg"> 
Figura 5: contorno das etapas que forem tomadas para gerar clusters de co-são regulados 3' final sequenciamento sites. A figura mostra a especificação de entrada/saída de etapas individuais no pipeline, com links para os passos individuais do protocolo descrito na seção "Processamento de dados". O arquivo de saída principal é marcado em negrito. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig5large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<img alt="Figure 6" class="xfigimg" src="/files/ftp_upload/56129/56129fig6.jpg"> 
Figura 6: resultados de exemplo do perfil de 3' acabam o processamento leituras ao longo do terminal exon do gene NUP214, mostrado no navegador de genoma de IGV 16 . A-seq2 leituras foram preparadas a partir de duas amostras de células HEK 293, tratadas com um controle-siRNA ou com um HNRNPC siRNA. O lê isso documentado poli sites que foram anotados pelo pipeline análise foram salvos no formato BAM que foi usado como entrada para o navegador do genoma IGV. 3' extremidades de picos de leitura mapeiam de mRNA 3' extremidades que são anotadas em Ensembl. Os perfis indicam um aumento da utilização do longa 3' UTR isoform mediante HNRNPC knock-down. <a href="//ecsource.jove.com/files/ftp_upload/56129/56129fig6large.jpg" target="_blank">Clique aqui para ver uma versão maior desta figura.</a>
<table border="1" fo:keep-together.within-page="1" fo:keep-with-next.within-page="always">
	<tbody>
		<tr>
			<td></td>
			<td>si-controle replicar 1</td>
			<td>si-controle replicar 2</td>
		</tr>
		<tr>
			<td></td>
			<td>identificação: 29765</td>
			<td>identificação: 32682</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras crus</td>
			<td>44210258</td>
			<td>68570640</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras válidas após aparar e filtragem</td>
			<td>14024538</td>
			<td>21211793</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras de mapeamento com exclusividade</td>
			<td>6953674</td>
			<td>13946436</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de leituras, mapeamento de múltiplos loci</td>
			<td>2040646</td>
			<td>2925839</td>
		</tr>
		<tr>
			<td>número de individual 3' terminar processamento sites</td>
			<td>1107493</td>
			<td>1710353</td>
		</tr>
	</tbody>
</table>
Tabela 1: exemplo de saída do pipeline de análise. Resumos de leituras que foram obtidos em etapas individuais.

Este protocolo descreve um método para mapeamento pre-mRNA' a extremidade 3 sites de processamento.

3' final de preparação da biblioteca com A-seq2 de sequenciamento

Studies in the last decade have revealed a complex and dynamic variety of pre-mRNA cleavage and polyadenylation reactions. mRNAs with long 3&#39; ...

O objetivo geral deste método é capturar e sequenciar as extremidades 3' do mRNA, permitindo, assim, estudos sobre o processamento do mRNA, particularmente o clivagem da extremidade 3' e a poliadenilação, bem como a quantificação da expressão gênica. O protocolo A-seq2 e o pacote de análise de dados apresentados aqui podem ajudar a responder perguntas fundamentais sobre a geração e função de isoformas de transcritos em diferentes tipos celulares e tecidos. As principais vantagens do método A-seq2 são a evitação do sequenciamento de longos trechos de poli(A) e a ausência de geração de dímeros de adaptador.Células cultivadas até 80% de confluência são utilizadas para este procedimento. Remova o meio de crescimento e lave as células uma vez com PBS. Lise diretamente as células na placa adicionando um mililitro de tampão de lise por poço e utilizando uma espátula de borracha para destacar completamente o material celular da superfície da placa.Utilize uma ponteira de pipeta de um mililitro para transferir o lisado viscoso de cada poço para um tubo plástico de 15 mililitros. Emulsifique o DNA com uma seringa de um mililitro acoplada a uma agulha hipodérmica de 23 graus. Realize vários movimentos vigorosos para cima e para baixo do êmbolo, até que o lisado não esteja mais viscoso.Transfira o lisado para um tubo de 1,5 mililitro. Centrifugue a 20.000 ×g e 4 °C por cinco minutos, para remover os detritos. Colete o sobrenadante límpido do lisado.Adicione às microesferas magnéticas oligo d(T)25 e ressuspenda a mistura. Coloque os tubos em uma roda rotativa por 10 minutos. Em seguida, coloque os tubos em um suporte magnético por dois minutos.Remova o líquido transparente. Adicione 0,8 mililitros do tampão A a cada tubo e inverta o tubo em 180 graus duas a três vezes. Remova o tampão A da segunda lavagem.Adicione 0,8 mililitros do tampão B a cada tubo e deixe na grade por dois minutos. Para eluir o mRNA ligado às microesferas, remova o tampão B, adicione 33 microlitros de água a cada tubo e re-suspenda as microesferas. Incube a 75 graus Celsius por cinco minutos em um bloco aquecido.Imediatamente, centrifugue os tubos por um segundo e coloque-os no suporte magnético. Transfira o sobrenadante para um novo tubo. Adicione 66 microlitros de tampão de hidrólise alcalina a cada tubo, misture e aqueça a 95 graus Celsius por exatamente cinco minutos em um bloco de aquecimento.Imediatamente, resfrie os tubos em gelo. Em seguida, realize o isolamento de RNA utilizando um kit de purificação de RNA, conforme descrito no protocolo textual. Para iniciar este procedimento, adicione a cada amostra de RNA 14 microlitros de uma Mistura Mestra de polinucleotídeo quinase.Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, carregue as reações de quinase em colunas de centrifugação preparadas. Centrifugue as colunas a 735 vezes g durante dois minutos.Descarte as colunas e coloque os tubos com as reações coletadas no gelo. Para bloquear as extremidades três primas dos fragmentos de RNA e evitar sua concatemerização em reações subsequentes de ligação, adicione a cada amostra 17,5 microlitros de uma mistura mestra de poli(A) polimerase. Misture e centrifugue por um segundo.Incube a 37 graus Celsius por 30 minutos. Após 30 minutos, adicione 32,5 microlitros de água a cada reação e purifique o RNA, conforme descrito no protocolo textual. Inicie este procedimento colocando as reações em um concentrador a vácuo por 10 minutos, para reduzir o volume a seis microlitros.Em seguida, adicione a cada reação 24 microlitros de uma mistura mestra de RNA ligase. Incube as reações em um agitador aquecido a 24 graus Celsius por 16 horas, com mistura intermitente a mil RPM. No dia seguinte, adicione 17 microlitros de água a cada reação e homogeneíze.Purifique o RNA, conforme descrito no protocolo textual. Coloque os eluatos em um concentrador a vácuo por três minutos, para reduzir o volume a 11 microlitros. Transfira as reações para tubos PCR de 200 microlitros para a reação de transcrição reversa.Adicione um microlitro de iniciador. Incube a 70 graus Celsius em um termociclador de PCR por cinco minutos e, em seguida, deixe em temperatura ambiente por cinco minutos. Adicione oito microlitros de uma Mistura Mestra de transcrição reversa a cada tubo e homogeneíze.Coloque os tubos em um termociclador. Aqueça a 55 graus Celsius por 10 minutos e a 80 graus Celsius por mais 10 minutos. Mantenha em gelo.Prepare as esferas de estreptavidina, conforme descrito no protocolo textual. Adicione a reação de transcrição reversa à solução de esferas e incube a quatro graus Celsius em rotação durante 20 minutos. Utilizando um suporte magnético, lave as esferas duas vezes com tampão de ligação de biotina e duas vezes com tampão TEN.Re-suspenda as microesferas em 50 microlitros de tampão TEN. Adicione dois microlitros da mistura enzimática de uracila DNA glicosilase e incube a 37 graus Celsius por uma hora em um agitador, com mistura intermitente. Adicione 50 microlitros de água, 11 microlitros de tampão RNase H e um microlitro de RNase H a cada reação.Incube a 37 graus Celsius por 20 minutos. Coloque os tubos no suporte magnético e transfira o líquido contendo o cDNA clivado para um novo tubo. Purifique o cDNA clivado utilizando um kit de purificação de PCR, conforme descrito no protocolo no texto.Coloque o cDNA purificado em um concentrador a vácuo por oito minutos para concentrar até um volume de sete microlitros. Para ligar os adaptadores da extremidade 5' às extremidades 5' do cDNA isolado, adicione a cada amostra 23 microlitros de uma mistura mestra de RNA ligase e incube a 24 graus Celsius por 20 horas. Por fim, adicione 70 microlitros de água a cada reação.Um PCR piloto é realizado para determinar o número ideal de ciclos de PCR para alcançar a amplificação da biblioteca dentro da fase exponencial. Pipete o seguinte em um tubo de PCR de 200 microlitros: 25 microlitros de mistura de DNA polimerase, 20 microlitros da reação de ligação, dois microlitros de água, 1,5 microlitro do iniciador PCR direto e 1,5 microlitro do iniciador PCR reverso com índice. Execute o termociclador com o seguinte programa: três minutos a 95 graus Celsius, seguidos por 20 ciclos de 20 segundos a 98 graus Celsius, 20 segundos a 67 graus Celsius e 30 segundos a 72 graus Celsius.Colete alíquotas de sete microlitros diretamente do ciclador, após os ciclos indicados. Separe os produtos em um gel de agarose a 2% e visualize a migração dos produtos de PCR. Determine o número de ciclos no início da amplificação exponencial, 12 ciclos neste exemplo, e utilize esse número de ciclos para uma reação de PCR em larga escala.Sequencie os produtos da reação de PCR em larga escala em um gel de agarose a 2% e recorte os fragmentos do gel contendo produtos de DNA de 200 a 350 nucleotídeos. Em seguida, extraia o DNA dos fragmentos do gel utilizando o kit de extração de gel, conforme descrito no protocolo textual. Apenas as etapas computacionais mais importantes serão mostradas neste vídeo.Mais detalhes estão disponíveis no protocolo textual. Comece clonando o repositório Git e altere para o diretório recém-criado. Crie um ambiente que contenha o software e ative este ambiente.Baixe a sequência genômica do organismo a partir do qual foram obtidos os dados de A-seq2. Abra o arquivo de configuração e defina os parâmetros de entrada, conforme indicado no protocolo textual. Inicie a análise.A resposta de um gene específico, NUP214, ao silenciamento da proteína HNRNPC, foi examinada por meio da análise de leituras a-seq2 de duas amostras de células HEK-293, tratadas com RNA interferente controle ou com RNA interferente HNRNPC. As leituras que documentaram sítios de poli(A) anotados pelo pipeline de análise foram armazenadas em formato BAM, que foi utilizado como entrada para o navegador genômico IGD. As extremidades três primas dos picos de leitura foram mapeadas nas extremidades três primas de mRNAs que estão anotadas no ensemble.Os perfis indicam um aumento no uso da isoforma longa do UTR 3' após o silenciamento de HNRNCR. Uma vez dominado, o protocolo A-seq exige oito horas de tempo ativo ou cerca de dois a três dias, sem contar o tempo para o cultivo celular e as ligaduras noturnas. Ao tentar o protocolo, é importante primeiro projetar um conjunto inicial que esteja em conformidade com a plataforma de sequenciamento utilizada no seu local.Uma vez obtidas as extremidades 3' do mRNA, outros métodos, como o cruzamento e imunoprecipitação, podem ser realizados para identificar reguladores do processamento das extremidades 3' do pré-mRNA. O A-seq2 abriu caminho para pesquisadores na área do processamento de RNA, permitindo explorar a regulação e as consequências da poliadenilação alternativa em tipos celulares individuais. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como gerar bibliotecas de extremidades 3' do mRNA, analisar seus dados de sequenciamento, identificar novos sítios de poliadenilação e quantificar seu uso.Esperamos que o A-seq2 facilite seu trabalho ao iniciar a regulação do processamento de mRNA e leve a muitas novas descobertas.

3-end-sequencing-library-preparation-with-a-seq2

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