Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento
13 de junho de 2025
Descrevemos um protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, a clonagem de vaivém baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle), que permite a transferência de fragmentos de DNA de interesse entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA.
Descrevemos nosso protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, o CRISPRshuttle. Que envolve a transferência de fragmentos de DNA alvo entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA. Técnicas existentes, como infusão de gateway e amplificação de PCR de clonagem univetorial. Essa abordagem requer procedimentos específicos de fragmentos, incluindo design primário e validação de secreção. Essas etiquetas são trabalhosas e demoradas. O transporte CRISPR elimina a PCR enquanto transfere fragmentos de DNA alvo entre vetores para reações sequenciais em tubos de ensaio. Este método supera a necessidade de manuseio específico de fragmentos e, assim, acelera a construção do corpo de prova.
[Narrador] Para começar, prepare uma mistura mestre para um determinado número de reações de digestão, combinando os reagentes mostrados na tela. Disponha os tubos de 0,2 mililitro devidamente rotulados em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo. Prepare a mistura principal para o número N de reações, misturando quantidades apropriadas de tampão CAS9 sgRNA 10 CAS9 e água tratada com DEPC. Misture bem a mistura principal e gire-a para baixo. Alíquota de 3,75 microlitros da mistura principal em cada tubo de reação. Adicione 0,75 microlitros de plasmídeo PLX 304 ORF 0,03 micromolar a cada tubo bem misturado e incube os tubos a 37 graus Celsius por uma hora. Prepare uma master mix combinando 0,14 microlitros de 3,36 microlitros linearizados pBIDC-UASC-pLXvect lineares de 3,36 microlitros e 1,8 microlitros de master mix de montagem Gibson. Misture bem a mistura principal e gire-a para baixo. Agora alíquota 1,94 microlitros da mistura mestre em cada tubo. Adicione 1,66 microlitros de plasmídeo clivado CAS9 em cada tubo. Misture bem e incube a 50 graus Celsius por uma hora. Descongele as células bacterianas competentes no gelo. Alíquota de 10 microlitros das células descongeladas em cada tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro. Misture suavemente 10 microlitros das células competentes com um microlitro de produto de montagem Gibson. Coloque os tubos no gelo por 30 minutos. Choque térmico dos tubos a 42 graus Celsius por um minuto e depois leve à geladeira por dois minutos. Adicione 100 microlitros de meio SOC pré-aquecido em cada tubo e agite a 250 RPM por uma hora a 37 graus Celsius. Finalmente, coloque as células em placas de ágar LB contendo 15 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Esta figura exibe os resultados representativos da análise de restrição de plasmídeos UAS-cDNA/ORF gerados usando o sistema CRISPRshuttle. Nesta análise, a digestão de restrição de 15 construções UAS-cDNA/ORF com PVU2 revelou que todas as amostras exibiram os padrões de fragmentos esperados em aproximadamente 1072 pares de bases e 1.820 pares de bases.
Veja a transcrição completa e aceda a milhares de vídeos científicos
Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para um método de clonagem de alto rendimento conhecido como clonagem baseada em CRISPR (clonagem CRISPRshuttle). Esta técnica inovadora facilita a transferência de fragmentos de DNA entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Engenharia Genética
- Biologia Molecular
- Tecnologia CRISPR
Fundo
- Métodos de clonagem tradicionais frequentemente requerem amplificação por PCR.
- A tecnologia CRISPR revolucionou a manipulação genética.
- Métodos de alto rendimento são essenciais para estudos em larga escala.
- A transferência eficiente de vetores é crucial para várias aplicações.
Propósito do Estudo
- Apresentar um novo método de clonagem.
- Simplificar o processo de transferência de fragmentos de DNA.
- Eliminar a necessidade de PCR em procedimentos de clonagem.
Métodos Utilizados
- Desenvolvimento do protocolo de clonagem CRISPRshuttle.
- Avaliação da eficiência na transferência de DNA.
- Comparação com métodos de clonagem tradicionais.
- Aplicação do método em vários sistemas de vetores.
Principais Resultados
- Transferência bem-sucedida de fragmentos de DNA entre vetores.
- Tempo e recursos significativamente reduzidos em comparação com métodos PCR.
- Alta eficiência demonstrada em múltiplos testes.
- Potencial para aplicações amplas em pesquisa genética.
Conclusões
- A clonagem CRISPRshuttle é uma alternativa viável aos métodos tradicionais.
- Este método aumenta a eficiência na engenharia genética.
- Estudos futuros podem aproveitar esta técnica para manipulações genéticas complexas.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
High-throughput generation of genome-wide plasmid libraries is a critical enabler for systematic gene function studies and target validation in biopharma R&D. CRISPR-based shuttle cloning (CRISPRshuttle) eliminates PCR amplification, streamlining the transfer of DNA fragments between vectors and accelerating library construction. This capability enhances predictive confidence and operational efficiency at key discovery inflection points.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables rapid assembly of genome-scale plasmid libraries for functional genomics screens.
- Supports systematic interrogation of gene function across diverse biological pathways.
- Facilitates biological de-risking and robust target validation by enabling high-throughput construct generation.
- Improves predictive confidence for downstream target selection and triage.
Screening & Assay Development
- Prepares validated plasmid constructs for scalable screening workflows without PCR-induced sequence artifacts.
- Standardizes cloning outputs, supporting reproducibility and quantitative assay development.
- Accelerates readiness for high-throughput compound evaluation and phenotypic screening platforms.
- Enables efficient reuse of donor plasmid resources across multiple assay formats.
Translational & Preclinical Research
- Streamlines the generation of disease-relevant genetic constructs for preclinical model development.
- Supports continuity from discovery through preclinical validation by enabling rapid construct iteration.
- Reduces technical bottlenecks in translational biomarker and mechanistic studies.
- Enhances risk-adjusted advancement decisions by providing robust genetic tools.
Pipeline & Workflow Integration
CRISPRshuttle cloning integrates at the interface of early discovery and lead identification, enabling seamless transition from hypothesis-driven gene selection to high-throughput construct generation and screening.
- Discovery Biology: Accelerates hypothesis testing and pathway mapping by enabling rapid, scalable cloning of gene targets.
- Screening: Delivers standardized, PCR-free constructs for reproducible assay development and screening campaigns.
- Analytics: Provides quantitative outputs on cloning efficiency and construct integrity, supporting data-driven decision making.
- Translational Research: Facilitates the generation of constructs for disease-relevant models and biomarker studies.
- Enterprise Reuse: Establishes a reusable, high-throughput cloning platform for ongoing portfolio needs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in gene function studies.
- Operational Value: Delivers high efficiency (>94%) and scalability, enabling rapid library generation by small teams.
- Strategic Value: Improves go/no-go decision quality and capital efficiency by accelerating construct availability.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of validated targets and assays.
Implementation Considerations
- Requires expertise in CRISPR/Cas9-mediated cleavage and Gibson assembly techniques.
- Needs access to compatible donor plasmids and CRISPRshuttle-ready vectors.
- Demands standardized protocols for cross-team reproducibility and data integrity.
- Adaptation may be needed for diverse vector backbones or organism-specific systems.
- Efficiency and throughput are dependent on reagent quality and workflow optimization.
