Name: Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-06-13T13:20:00.000+00:00
Duration: 4 min 25 s
Description: Aprenda o método de clonagem CRISPRshuttle de alto rendimento para transferência de fragmentos de DNA entre vetores sem PCR. Esta técnica aumenta a eficiência e reduz recursos em engenharia genética.

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<ol><li>Hartley, J. L., Temple, G. F., Brasch, M. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DNA+cloning+using+in+vitro+site-specific+recombination%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">DNA cloning using in vitro site-specific recombination.</a> Genome Res. 10 (11), 1788-1795 (2000).</li>
<li>Brasch, M. A., Hartley, J. L., Vidal, M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Orfeome+cloning+and+systems+biology%3A+Standardized+mass+production+of+the+parts+from+the+parts-list%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Orfeome cloning and systems biology: Standardized mass production of the parts from the parts-list.</a> Genome Res. 14 (10B), 2001-2009 (2004).</li>
<li>Zhu, B., Cai, G., Hall, E. O., Freeman, G. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((In-fusion+assembly%3A+Seamless+engineering+of+multidomain+fusion+proteins%2C+modular+vectors%2C+and+mutations%5BTitle%5D)+AND+%22Biotechniques%22%5BJournal%5D)">In-fusion assembly: Seamless engineering of multidomain fusion proteins, modular vectors, and mutations.</a> Biotechniques. 43 (3), 354-359 (2007).</li>
<li>Liu, Q., Li, M. Z., Leibham, D., Cortez, D., Elledge, S. J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+univector+plasmid-fusion+system%2C+a+method+for+rapid+construction+of+recombinant+DNA+without+restriction+enzymes%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Biol%22%5BJournal%5D)">The univector plasmid-fusion system, a method for rapid construction of recombinant DNA without restriction enzymes.</a> Curr Biol. 8 (24), 1300-1309 (1998).</li>
<li>Marsischky, G., Labaer, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Many+paths+to+many+clones%3A+A+comparative+look+at+high-throughput+cloning+methods%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">Many paths to many clones: A comparative look at high-throughput cloning methods.</a> Genome Res. 14 (10b), 2020-2028 (2004).</li>
<li>Wei, P., Xue, W., Zhao, Y., Ning, G., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+modular+assembly+of+a+UAS-cDNA%2FORF+plasmid+library+for+more+than+5500+Drosophila+genes+conserved+in+humans%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Res%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based modular assembly of a UAS-cDNA/ORF plasmid library for more than 5500 Drosophila genes conserved in humans.</a> Genome Res. 30 (1), 95-106 (2020).</li>
<li>Liu, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((CRISPR-based+shuttle+cloning+of+1%2C397+human+genes+into+UAS+vectors%5BTitle%5D)+AND+%22Acta+Biochim+Biophys+Sin+%28Shanghai%29%22%5BJournal%5D)">CRISPR-based shuttle cloning of 1,397 human genes into UAS vectors.</a> Acta Biochim Biophys Sin (Shanghai). , (2025).</li>
<li>Yang, X., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+public+genome-scale+lentiviral+expression+library+of+human+ORFs%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Methods%22%5BJournal%5D)">A public genome-scale lentiviral expression library of human ORFs.</a> Nat Methods. 8 (8), 659-661 (2011).</li>
<li>Wang, J. W., Beck, E. S., Mccabe, B. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((A+modular+toolset+for+recombination+transgenesis+and+neurogenetic+analysis+of+Drosophila%5BTitle%5D)+AND+%22PLoS+One%22%5BJournal%5D)">A modular toolset for recombination transgenesis and neurogenetic analysis of Drosophila.</a> PLoS One. 7 (7), e42102(2012).</li>
<li>Christie, K. A., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Precise+DNA+cleavage+using+CRISPR-SpRYgests%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Biotechnol%22%5BJournal%5D)">Precise DNA cleavage using CRISPR-SpRYgests.</a> Nat Biotechnol. 41 (3), 409-416 (2023).</li>
<li>Li, S. Y., Zhao, G. P., Wang, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((C-brick%3A+A+new+standard+for+assembly+of+biological+parts+using+Cpf1%5BTitle%5D)+AND+%22ACS+Synth+Biol%22%5BJournal%5D)">C-brick: A new standard for assembly of biological parts using Cpf1.</a> ACS Synth Biol. 5 (12), 1383-1388 (2016).</li>
<li>Lei, C., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+CCTL+%28Cpf1-assisted+cutting+and+taq+DNA+ligase-assisted+ligation%29+method+for+efficient+editing+of+large+DNA+constructs+in+vitro%5BTitle%5D)+AND+%22Nucleic+Acids+Res%22%5BJournal%5D)">The CCTL (Cpf1-assisted cutting and taq DNA ligase-assisted ligation) method for efficient editing of large DNA constructs in vitro.</a> Nucleic Acids Res. 45 (9), e74(2017).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Ágar em pó</td><td>Base química</td><td>KBS-001H</td><td></td></tr><tr><td>Agarose</td><td>Sangon</td><td>A600014-0100</td><td></td></tr><tr><td>Sistema automatizado de análise de imagem de gel digital</td><td>Tanon</td><td>Tanon-2500B</td><td></td></tr><tr><td>Cloranfenicol</td><td>Sangon</td><td>A100230-0010</td><td></td></tr><tr><td>Kit de extração de gel EZNA</td><td>Ômega</td><td>D2500-02</td><td></td></tr><tr><td>E.Z.N.A. Mini Kit de DNA de Plasmídeo I</td><td>Ômega</td><td>D6942-02</td><td></td></tr><tr><td>EcoRI-HF</td><td>NEB</td><td>R3101S</td><td></td></tr><tr><td>Gibson Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2611S</td><td></td></tr><tr><td>Kit de síntese de RNA HiScribe T7 Quick High Yield</td><td>NEB</td><td>E2050</td><td></td></tr><tr><td>NEBuilder HiFi DNA Assembly Master Mix</td><td>NEB</td><td>E2621X</td><td></td></tr><tr><td>Termociclador PCR</td><td>Gene Longo</td><td>T20</td><td></td></tr><tr><td>Polimerase de DNA SuperFi II Platinum</td><td>Thermo Científico</td><td>12361010</td><td></td></tr><tr><td>PvuII-HF</td><td>NEB</td><td>R3151L</td><td></td></tr><tr><td>Q5 Hot Start High Fidelity 2x Master Mix</td><td>NEB</td><td>M0494</td><td></td></tr><tr><td>S. pyogenes Cas9</td><td>GenScript</td><td>Z03386</td><td></td></tr><tr><td>Incubadora de agitação</td><td>Zhichu</td><td>ZQLY-180V</td><td></td></tr><tr><td>Espectrofotômetro</td><td>Shimadzu</td><td>BioSpec-nano</td><td></td></tr><tr><td>DNA ligase T4</td><td>Promega</td><td>M1801</td><td></td></tr><tr><td>Trans 10 Célula quimicamente competente</td><td>TransGen</td><td>CD101-02</td><td></td></tr><tr><td>Triptona</td><td>Oxóide</td><td>LP0042</td><td></td></tr><tr><td>XbaI</td><td>NEB</td><td>R0145S</td><td></td></tr><tr><td>Extrato de levedura</td><td>Oxóide</td><td>LP0021</td><td></td></tr></tbody></table>

clonagem de ônibus espacial baseada em crispr: um método de clonagem de alto rendimento

CRISPR-based Shuttle Cloning: A High-throughput Cloning Method

Utilizamos o CRISPRshuttle para construir uma coleção de plasmídeos UAS-cDNA/ORF cobrindo 1.397 genes humanos que são conservados em Drosophila7. A análise de restrição revelou que o CRISPRshuttle atinge uma eficiência de 94,5% para o uso de vetores de destino compatíveis com o CRISPRshuttle contendo duas sequências repetitivas e 96,1% para o uso de vetores de destino sem sequências repetitivas7. Nossos dados demonstraram que geralmente ~ 300 plasmídeos podem ser c...

Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento

The development of genome-wide plasmid libraries using existing genomic repositories serves as a pivotal prerequisite for systematic functional ...

Descrevemos nosso protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, o CRISPRshuttle. Que envolve a transferência de fragmentos de DNA alvo entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA. Técnicas existentes, como infusão de gateway e amplificação de PCR de clonagem univetorial. Essa abordagem requer procedimentos específicos de fragmentos, incluindo design primário e validação de secreção. Essas etiquetas são trabalhosas e demoradas. O transporte CRISPR elimina a PCR enquanto transfere fragmentos de DNA alvo entre vetores para reações sequenciais em tubos de ensaio. Este método supera a necessidade de manuseio específico de fragmentos e, assim, acelera a construção do corpo de prova.[Narrador] Para começar, prepare uma mistura mestre para um determinado número de reações de digestão, combinando os reagentes mostrados na tela. Disponha os tubos de 0,2 mililitro devidamente rotulados em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo. Prepare a mistura principal para o número N de reações, misturando quantidades apropriadas de tampão CAS9 sgRNA 10 CAS9 e água tratada com DEPC. Misture bem a mistura principal e gire-a para baixo. Alíquota de 3,75 microlitros da mistura principal em cada tubo de reação. Adicione 0,75 microlitros de plasmídeo PLX 304 ORF 0,03 micromolar a cada tubo bem misturado e incube os tubos a 37 graus Celsius por uma hora. Prepare uma master mix combinando 0,14 microlitros de 3,36 microlitros linearizados pBIDC-UASC-pLXvect lineares de 3,36 microlitros e 1,8 microlitros de master mix de montagem Gibson. Misture bem a mistura principal e gire-a para baixo. Agora alíquota 1,94 microlitros da mistura mestre em cada tubo. Adicione 1,66 microlitros de plasmídeo clivado CAS9 em cada tubo. Misture bem e incube a 50 graus Celsius por uma hora. Descongele as células bacterianas competentes no gelo. Alíquota de 10 microlitros das células descongeladas em cada tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro. Misture suavemente 10 microlitros das células competentes com um microlitro de produto de montagem Gibson. Coloque os tubos no gelo por 30 minutos. Choque térmico dos tubos a 42 graus Celsius por um minuto e depois leve à geladeira por dois minutos. Adicione 100 microlitros de meio SOC pré-aquecido em cada tubo e agite a 250 RPM por uma hora a 37 graus Celsius. Finalmente, coloque as células em placas de ágar LB contendo 15 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Esta figura exibe os resultados representativos da análise de restrição de plasmídeos UAS-cDNA/ORF gerados usando o sistema CRISPRshuttle. Nesta análise, a digestão de restrição de 15 construções UAS-cDNA/ORF com PVU2 revelou que todas as amostras exibiram os padrões de fragmentos esperados em aproximadamente 1072 pares de bases e 1.820 pares de bases.

crispr-based-shuttle-cloning-a-high-throughput-cloning-method

Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Metodologias de direcionamento de genes podem ser usadas para gerar camundongos transgênicos com alelos knockout, knock-in e marcados.  Aqui, descrevemos um método aprimorado de recombinação em E. coli, que chamamos de 'subclonagem mais inserção', que pode ser usado para gerar vetores de direcionamento de genes personalizados rapidamente.

Subclonagem Além disso Inserção (SPI) - Um Método recombineering Novel para a construção rápida de Gene Segmentação Vetores

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

A técnica de genotipagem descrito aqui, que acopla reacção em cadeia da polimerase fluorescente (PCR) para electroforese em gel capilar, permite a genotipagem de alto rendimento de clones knockout mediada por nucleases. É contorna as limitações enfrentadas por outras técnicas de genotipagem e é mais rentável do que os métodos de sequenciação.

Usando uma técnica de PCR fluorescente-capilar Electroforese em Gel de genótipo CRISPR / cas9 mediada KO mutantes em um formato de elevado rendimento

Este protocolo descreve as etapas para a clonagem de vários RNAs de guia único em um vetor de guia de RNA concatemer, que é de uso particular na criação de knockouts multi-genes usando a tecnologia CRISPR / Cas9. A geração de knockouts duplos em organoides intestinais é mostrada como uma possível aplicação deste método.

Um protocolo para múltiplo knockout de genes em ratos Organoids Intestinal Pequeno Usando um CRISPR-concatemer

Aqui, um simples, eficiente e cost-effective método de clonagem de sgRNA é descrito.

Guia de Clonagem de RNA para Sistemas de Mamíferos por CRISPR

Este manuscrito descreve um método de CRISPR-Cas9-baseado em cluster regularmente intercaladas curta palíndromo repete (CRISPR) para investigação célere e simples do papel dos vários genes candidatos na proliferação de células de leucemia mieloide aguda (LMA) em paralelo. Esta técnica é escalável e pode ser aplicada em outras linhas de células de câncer também.

Investigação de dependências genéticas utilizando ensaios de competição baseados em CRISPR-Cas9

Este protocolo descreve o transfection do plasmídeo da elevado-produção de pilhas de mamíferos em uma placa 384-well usando a tecnologia acústica da ejeção da gota. O tempo-demorado, erro-propenso a dispensar e Multiplexing do ADN, mas igualmente a dispensação do reagente do transfection, são software-driven e executado por um dispositivo do nanodispenser. As células são então semeadas nestes poços pré-preenchidos.

Multiplexação e transfecção de plasmídeo de DNA de alta produtividade usando tecnologia de Nanodosagem acústica

Este protocolo fornece um método para facilitar a geração de mudanças heterozygous ou homozygous definidas do nucleotide usando CRISPR-CAS9 em pilhas de haste pluripotentes humanas.

Geração de modificações genómicas definidas usando CRISPR-CAS9 em células-tronco pluripotentes humanas

Sistemas CRISPR-Cas e proteínas anti-CRISPR foram integrados ao esquema de portões booleanos em Saccharomyces cerevisiae. Os novos circuitos lógicos pequenos mostraram bom desempenho e aprofundaram a compreensão dos fatores de transcrição baseados em dCas9/dCas12a e das propriedades das proteínas anti-CRISPR.

Circuitos Digitais Gênicos Baseados em Sistemas CRISPR-Cas e Proteínas Anti-CRISPR

Apresentamos um protocolo para montagem modular baseada em CRISPR (CRISPRmass), um método para construção de alto rendimento da biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF em Drosophila usando recursos de cDNA/ORF disponíveis publicamente. O CRISPRmass pode ser aplicado à edição de várias bibliotecas de plasmídeos.

Montagem modular baseada em CRISPR para construção de alto rendimento de uma biblioteca de plasmídeos UAS-cDNA/ORF

A linhagem celular THP-1 é amplamente utilizada como modelo para investigar as funções de monócitos/macrófagos humanos em várias áreas de pesquisa relacionadas à biologia. Este artigo descreve um protocolo para engenharia eficiente baseada em CRISPR-Cas9 e isolamento de clone de célula única, permitindo a produção de dados fenotípicos robustos e reprodutíveis.

Nocaute de gene mediado por CRISPR-Cas9 baseado em eletroporação em células THP-1 e isolamento de clone de célula única

Aprenda o método de clonagem CRISPRshuttle de alto rendimento para transferência de fragmentos de DNA entre vetores sem PCR. Esta técnica aumenta a eficiência e reduz recursos em engenharia genética.

Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento

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