Clonagem de ônibus espacial baseada em CRISPR: um método de clonagem de alto rendimento

Descrevemos nosso protocolo para um método de clonagem de alto rendimento, o CRISPRshuttle. Que envolve a transferência de fragmentos de DNA alvo entre vetores sem a necessidade de amplificação por PCR dos fragmentos de DNA. Técnicas existentes, como infusão de gateway e amplificação de PCR de clonagem univetorial. Essa abordagem requer procedimentos específicos de fragmentos, incluindo design primário e validação de secreção. Essas etiquetas são trabalhosas e demoradas. O transporte CRISPR elimina a PCR enquanto transfere fragmentos de DNA alvo entre vetores para reações sequenciais em tubos de ensaio. Este método supera a necessidade de manuseio específico de fragmentos e, assim, acelera a construção do corpo de prova.

[Narrador] Para começar, prepare uma mistura mestre para um determinado número de reações de digestão, combinando os reagentes mostrados na tela. Disponha os tubos de 0,2 mililitro devidamente rotulados em um bloco de resfriamento de alumínio no gelo. Prepare a mistura principal para o número N de reações, misturando quantidades apropriadas de tampão CAS9 sgRNA 10 CAS9 e água tratada com DEPC. Misture bem a mistura principal e gire-a para baixo. Alíquota de 3,75 microlitros da mistura principal em cada tubo de reação. Adicione 0,75 microlitros de plasmídeo PLX 304 ORF 0,03 micromolar a cada tubo bem misturado e incube os tubos a 37 graus Celsius por uma hora. Prepare uma master mix combinando 0,14 microlitros de 3,36 microlitros linearizados pBIDC-UASC-pLXvect lineares de 3,36 microlitros e 1,8 microlitros de master mix de montagem Gibson. Misture bem a mistura principal e gire-a para baixo. Agora alíquota 1,94 microlitros da mistura mestre em cada tubo. Adicione 1,66 microlitros de plasmídeo clivado CAS9 em cada tubo. Misture bem e incube a 50 graus Celsius por uma hora. Descongele as células bacterianas competentes no gelo. Alíquota de 10 microlitros das células descongeladas em cada tubo pré-resfriado de 1,5 mililitro. Misture suavemente 10 microlitros das células competentes com um microlitro de produto de montagem Gibson. Coloque os tubos no gelo por 30 minutos. Choque térmico dos tubos a 42 graus Celsius por um minuto e depois leve à geladeira por dois minutos. Adicione 100 microlitros de meio SOC pré-aquecido em cada tubo e agite a 250 RPM por uma hora a 37 graus Celsius. Finalmente, coloque as células em placas de ágar LB contendo 15 microgramas por mililitro de cloranfenicol e incube-as durante a noite a 37 graus Celsius. Esta figura exibe os resultados representativos da análise de restrição de plasmídeos UAS-cDNA/ORF gerados usando o sistema CRISPRshuttle. Nesta análise, a digestão de restrição de 15 construções UAS-cDNA/ORF com PVU2 revelou que todas as amostras exibiram os padrões de fragmentos esperados em aproximadamente 1072 pares de bases e 1.820 pares de bases.