Name: De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2016-04-30T14:00:00.000+00:00
Duration: 12 min 59 s
Description: Aprenda a construir vetores CRISPR de alto rendimento e gerar raízes cabeludas mutantes de tomateiro para estudos genômicos funcionais. Este método simplifica a clonagem em uma única etapa, acelerando a pesquisa em genômica vegetal.

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Esta pesquisa foi apoiada pela National Science Foundation subvenção IOS-1025642 (GBM). Agradecemos Maria Harrison para fornecer a tensão ARqua1.

1. Guia de RNA Concepção e Construção Vector <ol><li> Identificar sequências alvo para os genes de interesse. Há uma variedade de programas de encontrar alvo CRISPR linha adequados para este passo 13,14. NOTA: Aqui usamos o GN 20 GG motivo alvo, mas outros desenhos podem ser adequadas, dependendo do sistema de aplicação ou vector usado. </li><li> Design 60-mer oligonucleótidos gRNA para incluir a porção GN 19 dos motivos alvo flanqueado em 5 &#39;e 3&#39; as sequências de 20 nt que são necessárias para a montagem de ADN. O motivo final de 60-mer é: 5&#39;-TCAAGCGAACCAGTAGGCTT-GN 19 -GTTTTAGAGCTAGAAATAGC-3 &#39;. NOTA: Padrão, primers já dessalgado funcionar bem. </li><li> Prepare os quatro DNAs de montagem (Figura 1). Veja arquivo suplementar para sequências de ADN. <ol><li> Digerir 1-5 ug de p201N: 10 Cas9 plasmídeo com a enzima de restrição Spe ​​I em 1X tampão de 4 a 37 ° C durante 2 h. Coluna-purificar a digerir umaegundo as instruções do fabricante. Ressuspender em ~ 15 ul de Tris-HCl a 10, e quantificar por espectrofotometria de UV. </li><li> Executar uma segunda digestão com a enzima de restrição Swa I em 1X tampão de 3,1 a 25 ° C durante 2 h. Verificar 100-200 ng sobre um gel de agarose a 0,8% para confirmar a digestão completa. NOTA: Um plasmídeo correctamente digerido terá uma única banda a 14313 pb. Nota: a inactivação térmica da enzima e desfosforilação não são necessários. plasmídeo digerido podem ser armazenadas a -20 ° C. </li><li> PCR amplificar o truncatula Medicago (Mt) de promotor U6 e andaime DNAs pela PUC gRNA Shuttle 10 plasmídeo utilizando os primers Swa I_MtU6F / MtU6R e ScaffoldF / Spe I_ScaffoldR, respectivamente. Usar uma polimerase de alta fidelidade com as condições de PCR: 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (98 ° C durante 20 seg, 60 ° C durante 15 seg, 72 ° C durante 30 seg); e 72 ° C durante 5 min. <ol><li> Visualize ~ 3 mL alíquotas de pr PCRodutos sobre um gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. O amplicon MtU6 é 377 pb e o fragmento amplificado andaime é de 106 pb. Coluna-purificar os produtos de PCR restantes de acordo com as instruções do fabricante, quantificar por espectrofotometria de UV e armazenar a -20 ° C. </li></ol></li><li> Ressuspender todo o tubo de oligos gRNA 100 mM em água de grau de laboratório. Adicionar 1 ml de oligo 100 uM a 500 ul de 1x tampão de 2,1. Misture bem. Se pooling múltiplos oligos, adicionar 1 ul de cada oligo 100 uM para o tubo do tampão 1x 2.1. oligos diluído pode ser armazenado a -20 ° C. </li></ol></li><li> Programar um termociclador para manter a 50 ° C, usando uma tampa aquecida. Combinar 100 ng (0,011 pmol) de vector linearizado, 50 ng (0,2 pmol) de promotor MtU6, 12 ng (0,2 pmol) de andaime, 1 ul (0,2 pmol) de oligo diluída gRNA (s), e água até um volume de 5 ul. Adicionar 5 ul de 2x de alta fidelidade montagem DNA mistura principal, misture bem e girar para baixo. Incubar de reacção durante 60 min no50 ° C termociclador. Em seguida, coloque a reação no gelo. Nota: Os volumes de reacção pode ser aumentada para acomodar os rendimentos baixos de ADN. </li><li> Transformar 2 ul da reacção em E. competente células de E. coli, utilizando técnicas padrão e placa em placas de LB suplementadas com 50 mg L-1 de canamicina (Kan 50). Crescer as células plaqueadas a 37 ° C durante a noite. Guardar a reacção montagem ADN remanescente à temperatura de -20 ° C. </li><li> tela Colony por PCR utilizando o StUbi3P218R primers e ISceIR. Dilui-se uma alíquota da reacção de montagem ADN remanescente com água 1: 5. Use 1 ml como um controle positivo para a tela da colônia e 1 ng de p201N circular: plasmídeo Cas9 como um controle não-inserção. <ol><li> Amplificar por PCR com as condições; 95 ° C durante 3 min; 31 ciclos (95 ° C durante 30 seg, 58 ° C durante 30 seg, 72 ° C durante 30 seg); e a 72 ° C durante 5 min. Visualizar os produtos de PCR num gel de agarose a 1%. Certifique-se de que as inserções correctas têm uma banda de 725 pb e vetores witinserções hout (por exemplo, vetor sem cortes) terá uma banda de 310 pb. </li></ol></li><li> Crescer colónias positivas em LB Kan 50 culturas líquidas durante a noite a 37 ° C e purificar plasmideos de acordo com as instruções do fabricante. sequência Sanger plasmídeos com o primer StUbi3P218R e alinhar cromatogramas ao promotor MtU6, alvo, e sequências de andaime para garantir que não haja erros foram introduzidas durante a clonagem. </li><li> Realizar um diagnóstico digerir por digestão ~ 1 ug de plasmídeo com Eco RV e Sty I. Visualizar num gel de agarose a 0,8%. Fragments (em pb) são: 4192, 2001, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318 e 174. </li><li> Use montagem DNA para construir vectores com vários gRNAs. <ol><li> Para construir um vector com duas cassetes gRNA, amplificar por PCR a primeira posição gRNA com os iniciadores Swa I_MtU6F / UNS1_ScaffoldR e a segunda posição gRNA com os iniciadores UNS1_MtU6F / Spe I_ScaffoldR de 1 ng de cada um dos respectivosplasmídeos construídos nos passos 1.1 - 1.8. Use as condições de PCR no passo 1.3.3. Visualizar ~ 3 aliquotas ul de produtos de PCR num gel de agarose a 1% para confirmar a amplificação. Amplicons são ~ 500 pb. </li><li> Combinar e misturar quantidades aproximadamente iguais dos produtos de PCR purificados em un num tubo de 200 ul (tipicamente 3-4 mL de cada). Para a montagem, adicionar 1 ul de produtos de PCR combinados, 50 ng de Swa I e Spe I linearizado p201N: Cas9, água de grau laboratorial e 2,5 uL e 2,5 uL de 2x de alta fidelidade de ADN montagem mistura principal. Incubar em um termociclador a 50 ° C durante 15 min. Nota: Os manuais de montagem de DNA recomenda a 15 min de incubação por 2 - 3 fragmentos. </li><li> Transformação 1 - 2 ul em E. competente coli e placa em LB Kan 50. Cultivar células plaqueadas a 37 ° C durante a noite. Guardar a reacção restante à temperatura de -20 ° C. </li><li> tela Colony por PCR com primers StUbi3P218R e ISceIR com as mesmas condições que o passo 1.6. correcta clones terá um amplicon 1.200 pb. Crescer colónias positivas em LB Kan 50 culturas líquidas durante a noite e purificar plasmídeos. </li><li> Sanger plasmídeos sequência com o StUbi3P218R iniciadores (cobre primeira posição gRNA) e p201R (cobre-segunda posição gRNA). Alinhar cromatogramas para as sequências de promotor, de destino e de andaime MtU6. Diagnóstico digerir com Eco RV e Sty I irá resultar nos seguintes fragmentos (em pb): 4192, 2476, 1743, 1544, 1381, 995, 831, 702, 460, 423, 318, 174. fragmento em negrito contém a segunda gRNA. </li></ol></li><li> Após a reunião todas as expectativas de controle de qualidade, transformar plasmídeos em Agrobacterium rhizogenes estirpe ARqua1 15. Adicionar 1 ul da preparação de plasmídeo a 50 ul de células electrocompetentes e electroporar numa cuvete de um milímetro com as definições: 2,4 kV, 25 uF, 200 e Ω. Recuperar células em ~ 500 mL de SOC e agitar a 28 ° C durante 2 h. Placa em LB Kan 50 e glinha a 28 ° C durante 2 dias. tela colónia executar usando os mesmos iniciadores e condições de PCR como 1.3.3. Adicione estoques de glicerol a partir de clones positivos. </li></ol> Transformação 2. Hairy Root <ol><li> Esterilizar sementes de tomate em água sanitária de 20% para 15 min, com mistura constante. Em uma capela de fluxo laminar, retire a água sanitária e lave em água de grau de laboratório estéril 3 vezes. </li><li> Placa 30 sementes em uma caixa GA-7 contendo meio ½ MS (2,22 g L -1 MS sais + Gamborg vitaminas, 10 g L -1 de sacarose, 3 g L -1 goma de gel, pH 5,8). Germinar para ~ 2 dias no escuro, em seguida, passar GA-7 caixas de luz. A produção de mudas para ~ 4 mais dias na luz. </li><li> No dia antes da transformação, raia fora A. rhizogenes culturas acesa LB Kan 50 e crescer a 28 ° C durante a noite. </li><li> Dia da transformação, na capela de fluxo laminar montar materiais estéreis: 12 ml tubos de cultura, tubo de 50 ml, ½ MS líquido (sem gelana gum), 200? M acetoseringona, papel de filtro, placas de Petri, pinça e bisturi, pipetas e ponteiras. Adicionar 25 ul de acetossiringona a 50 ml de ½ MS e despeje ~ 6 ml em cada tubo de cultura. </li><li> Use uma inclinação ponta de 200 mL para raspar A. rhizogenes células da placa e os ressuspender em 6 ml de ½ MS líquido. Vortex do tubo para voltar a suspender as células. Após ressuspender as células de cada vector, medir a densidade óptica (OD) de 1 ml de células a um comprimento de onda fixo de 600 nm. Certifique-se de OD é entre 0,2 e 0,4; diluir ou adicionar mais células como necessário. Repita o procedimento para cada construção. </li><li> Adicionar 2 ml de ~ ½ MS líquido para uma placa de Petri com papel de filtro estéril. cotilédones especiais sobre o consumo de mudas e coloque sobre o papel de filtro umedecido. Uma vez que todos os cotilédones foram recolhidos, cortar as distais ~ 1 cm fora dos cotilédones, resultando em peças de cotilédones, com duas extremidades cortadas. Adicionar explantes com A. soluções rhizogenes, misturar e incubar por 20 mincom inversão ocasional. Nota: Cerca de 12 explantes por construção são rotineiramente utilizados, embora até 80 explantes foram inoculados em 6 ml de A. solução rhizogenes. </li><li> Durante a A. rhizogenes incubação, adicionar papel de filtro para placas de Petri, um por construto transformado. Também definir ½ MS meios sólidos, sem antibióticos, na capela de fluxo laminar para secar. </li><li> Colher cotilédones de A. solução rhizogenes com uma pinça estéril e coloque sobre papel de filtro seco. Cubra com Petri tampa para garantir tecidos não sequem enquanto prosseguir para a próxima transformação. cotilédones mancha no papel de filtro e transferência, com o lado abaxial para cima, a ½ meio MS. Enrole placas com fita cirúrgica e co-cultivar no escuro à temperatura ambiente durante 2 dias. </li><li> Após o co-cultivo, cotilédones de transferência, com o lado abaxial para cima, para meio de cultura MS suplementado com 300 mg L-1 ticarcilina / ácido clavulânico (Tm 300, para impedir o crescimento de residual A. rhizogenes) e Kan 50 (para seleção de plantas) e enrole com fita cirúrgica. Manter culturas sob luzes fluorescentes à temperatura ambiente com um fotoperíodo de 16 horas. </li><li> Depois de ~ 1,5 - 2 semanas raízes, pelo menos, 2 cm de comprimento são excisados ​​a partir dos cotilédones, utilizando fórceps estéreis e um bisturi e transferidos para meio MS Kan 50 300 Tm meios. Transferir 10 a 15 raízes de uma única placa. Marcar a posição das pontas de raiz com um marcador, enrole com fita cirúrgica, e manter na sala de cultura. </li><li> Após uma semana, as raízes transformadas são vistas crescer nos meios selectivos. Colher uma subamostra de raízes transformadas para extração de DNA utilizando o método de DNA de extracção preferido. Nota: Placas com cotilédones pode ser mantido por 2 - 3 colheitas semanais, após o que apontam as raízes crescem em um emaranhado e são difíceis de isolar. tecidos da raiz não colhidas pode ser mantida indefinidamente. Uma variedade de ensaios pode ser realizado na amostra de DNA isolados para determinar a freqüência mutação do DNA e tipo. Os resultados de algumas dessas análises estão descritos a seguir. </li></ol>

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</ol>

Os autores não têm nada para revelar.

Como a montagem de DNA é usada para recombinar quaisquer sequências de DNA sobrepostas, esse método de clonagem pode ser aplicado a qualquer construção de vetor CRISPR. A maioria dos esquemas de clonagem CRISPR usa síntese gênica do gRNA, enzimas de restrição tipo IIS17,18 ou PCR de extensão de sobreposição19. Cada uma dessas técnicas tem vantagens e desvantagens inerentes, mas normalmente exigem várias etapas práticas de clonagem. A principal vantagem do método de clonagem apresentado aqui é que to...

A capacidade de gerar modificações no DNA orientadas e dotadas de CRISPR / Cas9 tem um grande potencial para estudos de genômica funcional. Existem dois componentes do sistema CRISPR / Cas9; a nuclease Cas9, derivada de Staphylococcus pyogenes e um 100-nt ARN guia (gRNA) de aproximadamente molécula que dirige Cas9 ao local de ADN alvo (s) 1. Reconhecimento do alvo é conferido pelo primeiro ~ 20 nt do gRNA, que permite a produção de alto rendimento de segmentação vetores 2,3. A maioria dos organismos que podem ser modificadas, já esteve com CRISPR tecnologia / Cas9 4,5. Em plantas, os promotores constitutivos, tais como o promotor CaMV 35S, são vulgarmente utilizados para dirigir a expressão da nuclease Cas9 6. Os gRNAs são expressas usando a polimerase III U6 ou U3 promotores de ARN, o que limita a primeira base do gRNA, quer um G, para U6, ou R para U3, para a transcrição eficiente. No entanto prom RNA polimerase IIoters, que são livres de tais restrições, também têm sido utilizados 7,8. Diferentes gRNAs induzir mutações de DNA com eficiências diferentes, e por isso pode ser importante para o primeiro validar vetores CRISPR antes de investir em transformações de toda a planta ou a criação de amplas telas fenotípicas. A expressão transiente de construções de CRISPR em plantas, utilizando agroinfiltração por exemplo, geralmente resulta em uma menor frequência de modificação do ADN, em comparação com as plantas estáveis ​​6, tornando a detecção de mutações difíceis e ensaios fenotípicos impraticáveis ​​com tais abordagens. Os chamados raízes peludas são um sistema conveniente, alternativa uma vez que grande número de elementos independentes, transformadas de forma estável podem ser gerados dentro de algumas semanas, ao contrário de meses para plantas estáveis. Vectores CRISPR são muito eficazes na indução de mutações de ADN nas raízes 9,10. métodos de montagem de ADN eficiente ligar fragmentos de ADN contendo Overlapping extremidades 11. Uma grande vantagem de alguns métodos de montagem de ADN é a capacidade de incorporar ADNcs (isto é, os oligos) para os produtos montados. Desde gRNAs são apenas ~ 20 nt de comprimento e novos alvos pode ser feita com os oligos sintetizados, estes métodos de montagem de ADN são bem adequados para a clonagem de CRISPR. Os protocolos aqui descritos baseiam-se na série de vectores de p201 CRISPR que tem sido utilizado com sucesso em plantas de soja 10, 12 e choupo agora tomate. O procedimento de clonagem apresentado oferece várias vantagens sobre o método de clonagem de corrente 10. Nomeadamente, os vectores totalmente funcionais podem ser gerados numa única reacção de clonagem num único dia. construção do vector também podem ser agrupados para gerar múltiplos vetores CRISPR em paralelo, reduzindo ainda mais hands-on tempo e custos de materiais. Nós também apresentamos um protocolo para a geração de tomate raízes peludas como um método eficiente para a produção de materiais transgênicos com deleções de genes-alvo. raízes peludas são usados ​​para válidacomeu os vetores CRISPR e fornecer material para experimentos posteriores.

<table><tbody><tr><td>NEBuilder&reg; (Mistura de montagem de DNA HiFi)</td><td>New England Biolabs</td><td>E5520</td><td></td></tr><tr><td>p201N:Cas9</td><td>Addgene</td><td>59175</td><td>O plasmídeo p201H:Cas9 (59176) também é compatível com as sobreposições e enzimas relatadas.</td></tr><tr><td>pUC gRNA Shuttle</td><td>Addgene</td><td>47024</td><td></td></tr><tr><td>SwaI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0604S</td><td></td></tr><tr><td>SpeI</td><td>New England Biolabs</td><td>R0133S</td><td></td></tr><tr><td>Zymo limpeza e concentrador-5 purificação de coluna</td><td>Zymo Research</td><td>D4003</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 2.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7202S</td><td></td></tr><tr><td>NEB CutSmart (Buffer 4)</td><td>New England Biolabs</td><td>B7204S</td><td></td></tr><tr><td>NEB Buffer 3.1</td><td>New England Biolabs</td><td>B7203S</td><td></td></tr><tr><td>EconoSpin Mini Spin Column (preparação de plasmídeos)</td><td>Epoch Life Sciences</td><td>1910-050/250</td><td></td></tr><tr><td>EcoRV-HF&reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3195S</td><td></td></tr><tr><td>StyI-HF&reg;</td><td>New England Biolabs</td><td>R3500S</td><td></td></tr><tr><td>MS Salts + Gamborg Vitaminas</td><td>Fitotecnologia Laboratórios</td><td>M404</td><td></td></tr><tr><td>Phytagel&trade; (goma gelana)</td><td>Sigma Aldrich</td><td>P8169</td><td></td></tr><tr><td>GA-7 Caixas</td><td>Sigma Aldrich</td><td>V8505</td><td></td></tr><tr><td>Micropore&trade; fita cirúrgica</td><td>3M</td><td>1535-0</td><td></td></tr><tr><td>Timentin&reg; (Ticarcilina/ácido clavulânico)</td><td>Vários</td><td>0029-6571-26</td><td></td></tr><tr><td>Primers 5' &#8594; 3'SwaI_MtU6F</td><td></td><td></td><td></td></tr><tr><td>&nbsp;</td><td>GATATTAATCTCTTCGATGA AATTTATGCCTATCTTATAT GATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>MtU6R&nbsp; &nbsp;</td><td>AAGCCTACTGGTTCGCTTG AAG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ScaffoldF&nbsp;</td><td>GTTTTAGAGCTAGAAATAGC AAGTT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>SpeI_Scaffold R</td><td>GTCATGAATTGTAATACGACTC AAAAAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>StUbi3P218R&nbsp;</td><td>ACATGCACCTAATTTCACTA GATGT</td><td></td><td></td></tr><tr><td>ISceIR</td><td>GTGATCGATTACCCTGTTAT CCCTAG</td><td>Não pode ser usado para sequenciamento de Sanger, pois há um segundo sítio de ligação no plasmídeo</td><td></td></tr><tr><td>UNS1_Scaffold R&nbsp;</td><td>GAGAATGGATGCGAGTAATGAA AAAAAGCACCGACTCGGTG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>UNS1_MtU6 F&nbsp; &nbsp;</td><td>CATTACTCGCATCCATTCTCAT GCCTATCTTATATGATCAATGAGG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>p201R&nbsp;</td><td>CGCGCCGAATTCTAGTGATCG</td><td></td><td></td></tr><tr><td>As sequências em negrito denotam sobreposições de 20 nt com p201N:Cas9 linearizado.</td><td></td><td></td><td></td></tr></tbody></table>

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High-throughput CRISPR Vector Construction and Characterization of DNA Modifications by Generation of Tomato Hairy Roots

Mutações de DNA direcionadas geradas por vetores com tecnologia de repetições palindrômicas curtas agrupadas regularmente interespaçadas (CRISPR)/Cas9 provaram ser úteis para estudos de genômica funcional. Embora a maioria das estratégias de clonagem seja simples de executar, elas geralmente usam várias etapas e podem levar vários dias para gerar as construções finais. O método apresentado aqui é baseado na montagem de DNA e pode produzir vetores CRISPR totalmente funcionais em uma única reação de clonagem. A construção vetorial também pode ser agrupada, aumentando ainda mais a eficiência e a utilidade do processo. Uma modificação do método é usada para criar vetores CRISPR com vários alvos genéticos. Os vetores CRISPR são então transformados em raízes peludas de tomate para gerar materiais transgênicos com modificações de DNA direcionadas. As raízes peludas são um sistema útil para testar a funcionalidade do vetor, pois são tecnicamente simples de gerar e passíveis de produção em larga escala. Os métodos apresentados aqui terão ampla aplicação, pois podem ser usados para gerar uma variedade de vetores CRISPR e ser usados em uma ampla gama de espécies de plantas.

construção CRISPR vector com montagem de DNA normalmente gera dezenas a centenas de clones independentes. Triagem Colony por PCR facilmente identifica clones corretos e pode distinguir entre plasmídeos com e sem inserções (Figura 2A) que é útil para solução de problemas. Normalmente, todos os clones contêm uma inserção e um usuário pode optar por ignorar as etapas de triagem colónia completamente. Digestões de diagnóstico (Figura 2B) e Sanger de sequenci...

Usando o conjunto de DNA, vectores de múltiplos CRISPR podem ser construídos em paralelo numa única reacção de clonagem, tornando a construção de um grande número de vectores CRISPR uma tarefa simples. Tomate raízes peludas são um excelente sistema modelo para validar vetores CRISPR e gerar materiais mutantes.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

Targeted DNA mutations generated by vectors with clustered regularly interspaced short palindromic repeats (CRISPR)/Cas9 technology have proven useful for ...

O objetivo geral deste procedimento de clonagem e transformação é gerar com eficiência vetores CRISPR e raízes mutantes de tomateiro com genes interrompidos, que podem ser utilizados em estudos funcionais de genômica. Este método é uma ferramenta útil na área de genômica vegetal, pois pode gerar um grande número de mutantes nulos que podem ser empregados em diversos processos radiculares. A principal vantagem desta técnica é que o procedimento de clonagem pode ser realizado em um único passo, o que permite obter os materiais do grupo em apenas algumas semanas.Primeiro, projete oligonucleotídeos de RNA guia ou gRNA para incluir a porção GN19 dos motivos alvo cercada pelas sequências de 20 nucleotídeos nas extremidades cinco prime e três prime, necessárias para a montagem do DNA. Digestione de um a cinco microgramas do plasmídeo P201N caznine com a enzima de restrição Spe1 a 37 graus Celsius por duas horas. Após a purificação por coluna da digestão de acordo com as instruções do fabricante, reconstitua em 15 microlitros de Tris-HCl 10 milimolar.Quantifique a quantidade de DNA por espectrofotometria UV. Realize uma segunda digestão com a enzima de restrição Swa1 a 25 graus Celsius por

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Geração de plantas em Composite Medicago truncatula Utilizado para Ensaios Nodulação

Plantas oferecer um novo sistema para a produção de proteínas farmacêuticas, em escala comercial, que é mais escalável e de custo eficaz e segura que paradigmas expressão corrente. Neste estudo, apresentamos uma abordagem simples e conveniente, mas escalável para introduzir genes alvo...

Agroinfiltration eficiente de plantas para alto nível de expressão transiente de proteínas recombinantes

Agroinfiltração e agroinfecção PVX são ensaios funcionais de rotina para expressão ectópica transitória de genes nas plantas. Esses métodos são ensaios eficientes em estratégias de efeitoomia (resistência rápida e descoberta genética de avirulência) e cruciais para pesquisas modernas em patologia molecular vegetal. Eles atendem à demanda por uma análise funcional robusta de alto rendimento nas plantas.

Agroinfiltração e Agroinfecção PVX em Batata e Nicotiana benthamiana

As análises de expressão do promotor são cruciais para melhorar a compreensão da regulação gênica e a spatiotemporal expressão de genes-alvo. Aqui apresentamos um protocolo para identificar, isolar e clonar um promotor da planta. Além disso, descrevemos a caracterização do promotor nódulo específicos nas raízes peludo feijão comum.

Análise do promotor de planta: Identificação e caracterização de raiz nódulo promotor específico no feijão comum

Expressão heteróloga transitória de enzimas biossintéticas em folhas de Nicotiana benthamiana pode desviar fontes endógenas de 2,3-oxidosqualene para a produção de novos produtos de alto valor triterpeno. Aqui é descrito um protocolo detalhado para produção em escala preparativa rápida (5 dias) de triterpenos e analogs utilizando esta poderosa plataforma baseada em vegetais.

Expressão transiente em Nicotiana Benthamiana deixa triterpeno produção em escala preparativa

Aqui, apresentamos um método versátil para transformação da raiz do tomate seguido de inoculação com Ralstonia solanacearum para realizar análise genética simples para o estudo da doença de murcha bacteriana.

Transformação da Raiz do Tomate Seguida de Inoculação com Ralstonia Solanacearum para Análise Genética Direta da Doença de Wilt Bacteriano

Este protocolo descreve microinjeção e eletroporação in vivo para edição do genoma mediada por CRISPR regionalmente restrita no oviduto de camundongos.

Modelos de camundongos com engenharia genômica somática usando microinjeção e eletroporação in vivo

Apresentamos um protocolo para a produção de raízes pilosas de soja transgênica de alta eficiência.

Transformação de raízes pilosas de soja para análise da função gênica

Aqui, apresentamos o protocolo detalhado de um método de transformação em uma etapa mediado por Agrobacterium tumefaciens para produzir plantas compostas.

Um Método Eficiente e Reprodutível para Produção de Compósitos por Transformação de Raízes Pelosas à Base de Agrobacterium rhizogenes

O protocolo descreve indução de raízes pilosas utilizando hastes primárias de inflorescência de Arabidopsis e hipocótilos de Brassica napus . As raízes pilosas podem ser cultivadas e usadas como explantes para regenerar plantas transgênicas.

Transformação e regeneração de raízes pilosas em Arabidopsis thaliana e Brassica napus

Aprenda a construir vetores CRISPR de alto rendimento e gerar raízes cabeludas mutantes de tomateiro para estudos genômicos funcionais. Este método simplifica a clonagem em uma única etapa, acelerando a pesquisa em genômica vegetal.

De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

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