De alto rendimento CRISPR Vector construção e caracterização de DNA Modificações pela geração de raízes de tomateiro Cabeludo

O objetivo geral deste procedimento de clonagem e transformação é gerar com eficiência vetores CRISPR e eliminar raízes de tomate mutantes que podem ser usadas em estudos genômicos funcionais. Este método é uma ferramenta útil no campo da genômica de plantas porque pode gerar um grande número de mutantes knockout que podem ser usados em uma variedade de processos radiculares. A principal vantagem dessa técnica é que o procedimento de clonagem pode ser realizado em uma única etapa, consolidando que os materiais do grupo podem ser obtidos em apenas algumas semanas.

Primeiro, projete oligos de RNA ou gRNA para incluir a porção GN19 dos motivos-alvo flanqueados pelas cinco sequências de nucleotídeos primos e três primos 20 necessárias para a montagem do DNA. Digerir de um a cinco microgramas de plasmídeo de caczina P201N com a enzima de restrição Spe1 a 37 graus Celsius durante duas horas. Após a purificação do digesto em coluna de acordo com as instruções do fabricante, ressuspenda em 15 microlitros de 10 milimolares Trs HCL.

Quantifique a quantidade de DNA por espectrofotometria UV. Realize uma segunda digestão com uma enzima de restrição Swa1 a 25 graus Celsius por duas horas. Verifique 100 a 200 nanogramas em um gel de agarose de oito por cento de ponto zero para confirmar a digestão completa.

Um plasmídeo digerido corretamente terá uma única banda em 14.313 pares de bases. Para amplificar o truncatula medicago use seis DNAs promotores e andaimes do plasmídeo do plasmídeo do gRNA do disco. Use o primer Swa1 e Mtu6F e MTU6R, e o andaime F no andaime Spe1 R, em uma polimerase de alta fidelidade.

Visualize aliquats de três microlitros de produtos de PCR em um gel de agarose a um por cento para confirmar a amplificação. O amplicon MTU6 é de 377 pares de bases e o amplicon de andaime é de 106 pares de bases. A coluna purifica os demais produtos de PCR de acordo com as instruções do fabricante.

Quantificar por espectrofotometria UV como antes e armazenar a 20 graus Celsius negativos. Em seguida, ressuspenda todo o tubo de oligos de gRNA a 100 micromolares em água de laboratório. Adicione um microlitro dos oligos a 500 microlitros de tampão 1xNEB dois vírgula um e misture bem.

Programe um termociclador com tampa aquecida para manter a 50 graus Celsius. Combine 100 nanogramas do vetor linearizado, 50 nanogramas do promotor MtU6, 12 nanogramas de Scaffold e um microlitro de oligo de gRNA diluído em água para um volume final de cinco microlitros. Adicione cinco microlitros de 2X Mastermix de montagem de DNA de alta fidelidade.

Misture bem e gire para baixo. Incube a reação por 60 minutos no termociclador de 50 graus Celsius. Após a hora a 50 graus Celsius, coloque a reação no gelo e use dois microlitros para transformar células E.Coli competentes usando técnicas padrão.

Placa a transformação em ágar LB suplementado com 50 miligramas por mililitro de canamicina e incubar a 37 graus Celsius durante a noite. Selecionar as colónias através de PCR com o primário StUb3p 218R e 1Sce1R. Dilua um alequat da reação de montagem de DNA restante com água de um a cinco e use um microlitro como controle positivo para a triagem da colônia.

Inclua também um nanograma de plasmídeo circular P201N casnine como um controle sem inserção. Após a amplificação por PCR usando os parâmetros contidos na parte escrita do protocolo, visualize o produto de PCR em um gel de agarose a um por cento. As inserções corretas têm 725 pares de bases com faixas e os vetores sem inserções terão uma banda de 310 pares de bases.

Cultive colônias positivas em culturas líquidas LB Can50 durante a noite a 37 graus Celsius. No dia seguinte, purifique os plasmídeos usando um kit de purificação de plasmídeos de acordo com as instruções do fabricante. Depois de Sanger sequenciar os plasmídeos purificados com o primer StuB3P218R, alinhe os cromatogramas ao promotor MtU6, alvo e sequências de andaime para garantir que nenhum erro foi introduzido durante a clonagem.

Efectuar uma digestão diagnóstica digerindo um micrograma de plasmídeo com EcoR5 e Sti1. Quando visualizado em um gel de agarose zero vírgula oito, esse padrão de bandas deve ser visto. Finalmente, transforme os plasmídeos em Agrobacterium rhizogenes cepa ARqua1 adicionando um microlitro da preparação do plasmídeo a 50 microlitros de células eletrocompetentes e eletroporando em uma cubeta de um milímetro.

Adicione aproximadamente 500 microlitros de SOC Media e agite a 28 graus Celsius por duas horas. Em seguida, coloque em placas LB Can50 e cresça a 28 graus Celsius por dois dias. Comece esta seção do procedimento esterilizando as sementes de tomate em alvejante doméstico a 20% por 15 minutos com mistura constante.

Em seguida, transfira as sementes para uma capela de fluxo laminar. Remova o alvejante e lave em água estéril de laboratório três vezes. Coloque 30 sementes em uma caixa GA7 contendo metade do meio MS.

Deixe germinar por cerca de dois dias no escuro. Assim que as sementes germinarem, mova as caixas de GA7 para a luz No dia anterior à transformação, risque as culturas de A.rhizogenes em LB sólido contendo Can50 e cresça a 28 graus Celsius durante a noite. No dia da transformação, trabalhe na capela de fluxo laminar para adicionar 25 microlitros de acetosiringona a 50 mililitros de meio MS e despeje seis mililitros em cada tubo de cultura.

Use uma ponta dobrada de 200 microlitros para raspar as células de A. rhizogenes da placa e ressuspender nos seis mililitros de meio líquido MS. Vortex o tubo para ressuspender completamente as células. Depois de ressuspender as células de cada vetor, pegue um mililitro de células e meça a densidade óptica em um comprimento de onda fixo de 600 nanômetros.

Adicione dois mililitros de meio líquido MS a uma placa de Petri com um papel de filtro estéril. Extirpar os cotilédones das mudas e colocá-los sobre o papel de filtro umedecido. Uma vez que todos os cotilédones tenham sido coletados, corte o centímetro mais distal dos cotilédones, resultando em pedaços de cotilédones com duas pontas cortadas.

Adicione as plantas ex às soluções de A.rhizogenes e misture. Incube por 20 minutos com inversão ocasional. Durante a incubação de A.rhizogenes, adicione um pedaço de papel de filtro a uma placa de Petri para cada transformada de construção.

Além disso, coloque metade do meio sólido MS sem antibióticos na capela de fluxo laminar para secar. Use uma pinça estéril para retirar os cotilédones da solução de A. rhizogenes e coloque em papel de filtro seco. Cubra com uma tampa de placa de Petri para garantir que os tecidos não sequem durante a próxima transformação.

Em seguida, seque os cotilédones no papel de filtro e transfira o lado abaxial até a metade do meio MS. Enrole as placas com fita cirúrgica e co-cultive no escuro em temperatura ambiente por dois dias. Após o co-cultivo, transfira os cotilédones com o lado abaxial para cima em meio MS suplementado.

Enrole com fita cirúrgica. Mantenha as culturas sob luzes fluorescentes em temperatura ambiente com um período fotográfico de 16 horas. Após um vírgula cinco a duas semanas, use uma pinça estéril e um bisturi para extirpar raízes de pelo menos dois centímetros de comprimento dos cotilédones e transfira para o ácido ticarcillon / clavulanato e a canamicina suplementada com metade do meio de EM.

Transfira de dez a 15 raízes para um único prato. Marque a posição das pontas da raiz com um marcador. Envolva com fita cirúrgica e mantenha na sala de cultura.

Após uma semana, as raízes transformadas são vistas crescendo no meio seletivo. Colha uma subamostra de raízes transformadas para extração de DNA usando o método de extração de DNA preferido. Raízes peludas podem ser vistas emergindo dos cotilédones 11 dias após a transformação.

As raízes são selecionadas em ácido ticarcillon / clavulanato e canamicina suplementada com metade do meio MS por aproximadamente uma semana. As barras cinzas denotam a posição das pontas das raízes no momento do revestimento. Este é um exemplo de clonagem e sequenciamento de produtos de PCR para determinar mutações de DNA com dois alvos genéticos diferentes em quatro eventos diferentes de raízes pilosas.

A caixa cinza denota a sequência alvo GN20 GG e delta indica o tipo de mutação. O número de clones com a mutação indicada é mostrado à direita. Este é um exemplo de gel de poliacrilamida para determinar mutações no DNA.

Grandes deleções e bandas heterduplex indicam a presença de mutações de DNA nas sequências alvo. Seis dos 12 eventos independentes foram pontuados como mutantes, conforme indicado pelo símbolo delta. WT indica o controle de tipo wild e NT o controle no template.

Uma vez dominados, dezenas a centenas de vetores CRISPR podem ser produzidos em uma única semana e materiais do grupo trendulado podem ser obtidos em questão de semanas. Ao tentar este procedimento, é importante remover e inibir o crescimento de qualquer Agrobacterium residual. O crescimento excessivo de Agrobacterium inibirá e matará qualquer material radicular.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como gerar vetores CRISPR usando a montagem de DNA e como testar esses vetores usando um sistema de modelo de raiz peluda e tomate.