Name: Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2) (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2025-12-19T13:25:00.000+00:00
Duration: 7 min 21 s
Description: Aprenda a preparação automatizada de amostras para análise multiplexada de modificações pós-traducionais de histonas em célula única. Este método permite perfilamento quantitativo de alta sensibilidade da heterogeneidade cromatínica.

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<ol><li>Bannister, A. J., Kouzarides, T. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Regulation+of+chromatin+by+histone+modifications%5BTitle%5D)+AND+%22Cell+Res%22%5BJournal%5D)">Regulation of chromatin by histone modifications.</a> Cell Res. 21 (3), 381-395 (2011).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
<li>Sidoli, S., Bhanu, N. V., Karch, K. R., Wang, X., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Complete+workflow+for+analysis+of+histone+post-translational+modifications+using+bottom-up+mass+spectrometry%3A+from+histone+extraction+to+data+analysis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Complete workflow for analysis of histone post-translational modifications using bottom-up mass spectrometry: from histone extraction to data analysis.</a> J Vis Exp. (111), e54112(2016).</li>
<li>Budnik, B., Levy, E., Harmange, G., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((SCoPE-MS%3A+mass+spectrometry+of+single+mammalian+cells+quantifies+proteome+heterogeneity+during+cell+differentiation%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">SCoPE-MS: mass spectrometry of single mammalian cells quantifies proteome heterogeneity during cell differentiation.</a> Genome Biol. 19 (1), 161(2018).</li>
<li>Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Single-cell+protein+analysis+by+mass+spectrometry%5BTitle%5D)+AND+%22Curr+Opin+Chem+Biol%22%5BJournal%5D)">Single-cell protein analysis by mass spectrometry.</a> Curr Opin Chem Biol. 60 (1), 1-9 (2021).</li>
<li>Leduc, A., Khoury, L., Cantlon, J., Khan, S., Slavov, N. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Massively+parallel+sample+preparation+for+multiplexed+single-cell+proteomics+using+nPOP%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Protoc%22%5BJournal%5D)">Massively parallel sample preparation for multiplexed single-cell proteomics using nPOP.</a> Nat Protoc. 19 (12), 3750-3776 (2024).</li>
<li>Lund, P. J., Kori, Y., Zhao, X., Sidoli, S., Yuan, Z. F., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Isotopic+labeling+and+quantitative+proteomics+of+acetylation+on+histones+and+beyond%5BTitle%5D)+AND+%22Methods+Mol+Biol%22%5BJournal%5D)">Isotopic labeling and quantitative proteomics of acetylation on histones and beyond.</a> Methods Mol Biol. 1977 (1), 43-70 (2019).</li>
<li>Cutler, R., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Mass+spectrometry-based+profiling+of+single-cell+histone+post-translational+modifications+to+dissect+chromatin+heterogeneity%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Communications%22%5BJournal%5D)">Mass spectrometry-based profiling of single-cell histone post-translational modifications to dissect chromatin heterogeneity.</a> Nature Communications. , (2025).</li>
<li>Davie, J. R. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Inhibition+of+histone+deacetylase+activity+by+butyrate%5BTitle%5D)+AND+%22J+Nutr%22%5BJournal%5D)">Inhibition of histone deacetylase activity by butyrate.</a> J Nutr. 133 (7 Suppl), 2485S-2493S (2003).</li>
<li>Stransky, S., Cutler, R., Aguilan, J., Nieves, E., Sidoli, S. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Investigation+of+reversible+histone+acetylation+and+dynamics+in+gene+expression+regulation+using+3D+liver+spheroid+model%5BTitle%5D)+AND+%22Epigenetics+Chromatin%22%5BJournal%5D)">Investigation of reversible histone acetylation and dynamics in gene expression regulation using 3D liver spheroid model.</a> Epigenetics Chromatin. 15 (1), 35-35 (2022).</li>
<li>Stransky, S., et al. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Semi-automated+phenotypic+analysis+of+functional+3D+spheroid+cell+cultures%5BTitle%5D)+AND+%22J+Vis+Exp%22%5BJournal%5D)">Semi-automated phenotypic analysis of functional 3D spheroid cell cultures.</a> J Vis Exp. (1), e65086(2023).</li>
<li>Yuan, Z. F., Sidoli, S., Marchione, D. M., Simithy, J., Janssen, K. A., Szurgot, M. R., Garcia, B. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((EpiProfile+2.0%3A+a+computational+platform+for+processing+epi-proteomics+mass+spectrometry+data%5BTitle%5D)+AND+%22J+Proteome+Res%22%5BJournal%5D)">EpiProfile 2.0: a computational platform for processing epi-proteomics mass spectrometry data.</a> J Proteome Res. 17 (7), 2533-2541 (2018).</li>
<li>Jenuwein, T., Allis, C. D. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Translating+the+histone+code%5BTitle%5D)+AND+%22Science%22%5BJournal%5D)">Translating the histone code.</a> Science. 293 (5532), 1074-1080 (2001).</li>
</ol>

<table><tbody><tr><td>Tubos microcentrífugas de 1,5 mL</td><td>Bio-Rad</td><td>2239480</td><td></td></tr><tr><td>1000 & micro; Pontas de pipeta de amplo calibre L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222703</td><td></td></tr><tr><td>200 & micro; Pontas de pipeta de amplo calibre L</td><td>Fisher Scientific</td><td>14222730</td><td></td></tr><tr><td>Placa de PCR de 384 poços Lo Bind&nbsp;</td><td>Eppendorf</td><td>30129547</td><td></td></tr><tr><td>Coletor de vácuo de 96 poços</td><td>Millipore</td><td>MAVM0960R</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila, grau Optima LC-MS/MS</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-1</td><td></td></tr><tr><td>Folhas adesivas de placas PCR</td><td>Thermo Fisher</td><td>AB0626</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrila anidro</td><td>Fisher Scientific</td><td>AA42311AK</td><td>Solução de estoque para etiquetas e lotes</td></tr><tr><td>Arg-C Ultra, grau de espectrometría de massa</td><td>Promega</td><td>VA1831</td><td></td></tr><tr><td>Água de grau de cultura celular</td><td>Corning</td><td>25-055-CV</td><td></td></tr><tr><td>CellenVIALs</td><td>DISCIPLINA</td><td>/</td><td>O número do catálogo vem acompanhado de uma citação</td></tr><tr><td>DMSO, Anidro</td><td>Thermo Fisher</td><td>D12345</td><td>Solução de estoque para etiquetas</td></tr><tr><td>DTT</td><td>Sigma</td><td>D0632-5G</td><td></td></tr><tr><td>Eagle's Medium Modificado (DMEM) de Dulbecco</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT17205CV</td><td></td></tr><tr><td>Soro Fetal Bovino</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT35010CV</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico</td><td>Termodinâmica</td><td>28905</td><td></td></tr><tr><td>Ácido fórmico 98%&ndash; 100% para LC-MS LiChropur</td><td>Sigma</td><td>5330020050</td><td></td></tr><tr><td>Solução Equilibrada de Sal de Hank (HBSS)</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT21022CV</td><td></td></tr><tr><td>HEPES (Ultra Puro)</td><td>Thermo Fisher</td><td>11344041</td><td></td></tr><tr><td>Acetonitrilo grau HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>A955-4</td><td></td></tr><tr><td>Água de qualidade HPLC</td><td>Fisher Scientific</td><td>W5-4</td><td></td></tr><tr><td>Solução de hidroxilamina 50% em H2O</td><td>Sigma</td><td>438227-50ML</td><td></td></tr><tr><td>L-glutamina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25015CI</td><td></td></tr><tr><td>Detergente n-Dodecil-beta-Maltoside (DDM)</td><td>Fisher Scientific</td><td>BN2005</td><td></td></tr><tr><td>Aminoácidos não essenciais</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT25025CI</td><td></td></tr><tr><td>Espectrômetro de Massa Orbitrap Exploris 480</td><td>Thermo Fisher</td><td>BRE725539</td><td></td></tr><tr><td>Paraformaldeído 16% Solução Aquosa Grau EM</td><td>Ciências da Microscopia Eletrônica</td><td>15710-S</td><td></td></tr><tr><td>PDC-CM (revestimento tipo 2)</td><td>DISCIPLINA</td><td>/</td><td>O número do catálogo vem acompanhado de uma citação</td></tr><tr><td>Penicilina-Estreptomicina</td><td>Fisher Scientific</td><td>MT3002CI</td><td></td></tr><tr><td>Soro salino tamponado com fosfato (PBS), 10x, pH 7,4, livre de RNase</td><td>Thermo Fisher</td><td>AM9625</td><td></td></tr><tr><td>Dimetilsulfóxido de Pierce (DMSO), grau LC-MS</td><td>Thermo Fisher</td><td>85190</td><td></td></tr><tr><td>Pistola de pipeta</td><td>Eppendorf</td><td>Z666467 (Milipore Sigma)</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido propiônico &ge; 99%</td><td>Sigma</td><td>240311-50G</td><td></td></tr><tr><td>Anidrido propiônico-d10 &ge; 98 átomos % D, &ge; 99% (CP)</td><td>Sigma</td><td>615692-1G</td><td></td></tr><tr><td>Centrífuga refrigerada</td><td>Termodinâmica</td><td>75-217-420</td><td></td></tr><tr><td>Slides de vidro revestido SciCHIP H1</td><td>DISCIPLINA</td><td>/</td><td>O número do catálogo vem acompanhado de uma citação</td></tr><tr><td>Concentrador a vácuo SpeedVac (placas de 96 poços)</td><td>Termodinâmica</td><td>15308325</td><td>Savant SPD1010</td></tr><tr><td>Capuz estéril</td><td>Termodinâmica</td><td>1375</td><td></td></tr><tr><td>Pipetas sorológicas estéreis</td><td>Fisher Scientific</td><td>1367549</td><td></td></tr><tr><td>Coloração SYTOX Green Dead Cell, para citometria de fluxo</td><td>Thermo Fisher</td><td>S34860</td><td></td></tr><tr><td>TrypLE Express Enzima (1X), sem fenol vermelho</td><td>Thermo Fisher</td><td>12604013</td><td></td></tr><tr><td>Vórtice</td><td>Sigma</td><td>Z258415</td><td></td></tr><tr><td>Banho-maria</td><td>Fisher Scientific</td><td>FSGPD10</td><td></td></tr></tbody></table>

preparação automatizada de amostras para a análise multiplexada de modificações pós-traducionais de histonas de célula Única (sc-hptm2)

Automated Sample Preparation for the Multiplexed Analysis of Single-Cell Histone Post-Translational Modifications (sc-hPTM2)

Para demonstrar a aplicação do nosso fluxo de trabalho de proteômica de histonas unicelulares usando nosso sistema, analisamos esferoides de células HepG2/C3A tratadas com 5 mM de butirato de sódio por 24 horas. Após a aquisição de LC-MS/MS, os dados brutos foram processados com EpiProfile tanto para marcação leve (anidrido propiônico) quanto pesada (anidrido propiônico-d10), obtendo dados normalizados que representam as abundâncias dos peptídeos e marcas de histonas. O pacote QuantQC R foi então usado para mapear os met...

Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2)

Histone post-translational modifications (hPTMs) are central regulators of chromatin organization and gene expression. Their dysregulation is implicated ...

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Research

JoVE Journal

Biochemistry

Bioquímica

Este protocolo descreve um fluxo de trabalho totalmente integrado para a caracterização de histonas modificações pós-traducionais, utilizando espectrometria de massa (MS). O fluxo de trabalho inclui a purificação histona de culturas de células ou tecidos, derivação histona e digestão, análise de MS utilizando cromatografia líquida de nano-fluxo e instruções para a análise de dados. O protocolo é projetado para a conclusão dentro de 2 - 3 dias.

Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

Este manuscrito descreve métodos para a aplicação de tecnologia de microarrays de péptidos para o perfil específico de anticorpos que reconhecem histonas e suas modificações pós-tradução.

Análise da especificidade de anticorpo com histona com microarrays de péptidos

O objetivo deste artigo é fornecer um guia abrangente, sistemático para a purificação eficiente das histonas H3 e H4 e quantificação dos resíduos de histona acetilado.

Purificação de H3 e H4 histona proteínas e a quantificação do Histone acetilado marcas em células e tecidos cerebrais

Este fluxo de trabalho descreve o desempenho do enriquecimento tempo e econômico de múltiplas modificações pós-translacionais de proteínas (PTMs) simultaneamente para análise proteômica global quantitativa. O protocolo utiliza o enriquecimento ptm em nível de peptídeo com múltiplos anticorpos conjugados, seguido pela análise de espectrometria de aquisição independente de dados para obter insights biológicos sobre o crosstalk PTM.

Enriquecimento de afinidade simultânea de duas modificações pós-translacionais para quantificação e localização do site

Aqui, os autores apresentam a utilidade de MULTI-seq para fenotipagem e posterior emparelhamento scRNA-seq e scATAC-seq na caracterização dos perfis de acessibilidade transcriptômica e cromatina na retina.

Análise multiplexada da expressão genética da retina e acessibilidade da Chromatina usando scRNA-Seq e scATAC-Seq

Este protocolo descreve como um sistema de cultura celular tridimensional pode ser usado para modelar, tratar e analisar modificações de cromatina em um estado quase fisiológico.

Quantificação de nível global de modificações pós-translacionais histone em um modelo de cultura celular 3D de tecido hepático

Este trabalho descreve um protocolo para quantificação de modificações globais de histonas utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada. O trabalho também contém o protocolo de isolamento da micróglia que foi utilizado para a coleta de dados.

Quantificação de modificações pós-traducionais globais de histona utilizando citometria de fluxo intranuclear em microglia cerebral isolada de camundongos

Um fluxo de trabalho analítico baseado em cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo (LC-TIMS-ToF MS/MS) para alta confiança e análise "bottom-up" altamente reprodutível de modificações e identificação de histonas com base em parâmetros principais (tempo de retenção [TR], seção transversal de colisão [CCS] e relação massa-carga [m/z] precisa).

Triagem de modificação de histona usando cromatografia líquida, espectrometria de mobilidade iônica aprisionada e espectrometria de massa por tempo de voo

Esse protocolo permite a extração eficiente de histonas de várias amostras clínicas para análise subsequente de modificações pós-traducionais por LC-MS/MS. Ao facilitar a detecção robusta de modificações chave de histonas, serve como uma ferramenta valiosa para o perfil epigenético abrangente em grandes coortes clínicas.

Extração de histonas de amostras clínicas para perfilamento epigenético por espectrometria de massa

Variantes genéticas no Membro da Família Spindlina 4 (SPIN4) humano foram recentemente identificadas em pacientes com crescimento ósseo, um novo distúrbio do desenvolvimento. Um protocolo e novos resultados descrevendo a identificação bioquímica de histonas modificadas no contexto de nucleossomos como substratos de ligação ao SPIN4 são apresentados.

Identificação de histonas modificadas como substratos de ligação do membro humano da família spindlina 4 (SPIN4) por matrizes peptídicas e pulldown nativo de nucleossomos

Este estudo apresenta um protocolo multioma espacial Trekker–CUT&amp;Tag que combina codificação de barras espacial direta de uma seção de tecido com análise multioma de célula única. Essa abordagem permite o perfilamento espacialmente resolvido de uma única célula da expressão gênica e a modificação da histona H3K27ac simultaneamente, oferecendo insights mecanicistas sobre a regulação gênica no contexto da microanatomia tecidual.

Perfilamento Multiômico Integrado de Célula Única Espacialmente Resolvido do Transcriptoma e Alvos Epigenômicos em Seções de Tecido Congelado

Aprenda a preparação automatizada de amostras para análise multiplexada de modificações pós-traducionais de histonas em célula única. Este método permite perfilamento quantitativo de alta sensibilidade da heterogeneidade cromatínica.

Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2) (Vídeo) | JoVE Journal

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