Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2)

Estamos avançando a proteômica de célula única com um método automatizado de multiplexação para estudar a heterogeneidade global da cromatina para modificações pós-traducionais. O que torna esse protocolo desafiador é a preparação proteômica em escala picograma, a marcação multiplex, bem como a resolução de peptidos histonas modificados combinatórios complexos. Para começar, reconstitua as células hepatocelulares do carcinoma Hep G2/C3A em uma concentração final de 200 a 500 células por microlitro em PBS gelado.

Ajuste a largura de pulso e a tensão de acionamento de cada bico nos valores fornecidos pelo fabricante. Para máxima eficiência do captador, certifique-se de que o deslocamento Z entre os dois bicos diferia em menos de 50 micrômetros. Identifique a posição ótima de contato para cada bico e compare as leituras de altura Z na aba de configuração do bico.

Para o esquema de multiplexação tuplex, carregue um único slide no suporte do slide na capuza e depois transfira-o para o instrumento. Usando uma pipeta, coloque 150 microlitros de DMSO grau LCMS em um novo tubo de PCR. Coloque-o na posição dois da estação de lavagem com a tampa do tubo voltada para a porta do instrumento.

Comece a run DMSO. Obtenha uma queda estável depois que o DMSO foi aspirado. Note a mudança na transparência do PDC.

Pode ser necessário aumentar a tensão. Verifique a estabilidade realizando uma verificação de volume de queda. Execute o setup do assistente de câmera de cabeça para alinhar a câmera.

Dispense DMSO e permita que o instrumento lave automaticamente os bicos e capture imagens em todos os slides para controle de qualidade. Revise essas imagens para verificar uma gota DMSO uniforme em cada lâmina e para verificar gotas ausentes ou fora do alvo. Após aspirar a suspensão da célula, abra a célula em um módulo, realize uma captura de fundo e então execute a rotina de mapeamento para definir a zona de ejeção.

Execute a análise e então faça um gate para selecionar células com base no tamanho e alongamento. Agora, prepare uma mistura master de digestão fresca em água grau LCMS. Desgasifice a solução com uma bomba de vácuo por 10 minutos no gelo.

Após distribuir a mistura de digestão nas lâminas, deixe o instrumento lavar automaticamente os bicos e fotografar cada lâmina. Revise as imagens para verificar se cada gota recebe a mistura digestiva de forma uniforme. Incube as lâminas em temperatura ambiente durante a noite para realizar a digestão.

Após iniciar a evaporação e a digestão durante a noite, inspecione as imagens. Se as gotículas estiverem suficientemente secas, pare a corrida. Se não, clique em continuar e seque por mais cinco minutos.

Para a rotulagem, primeiro prepare soluções padrão para derivitização multiplexada de histonas. Após a dispensação, permita que o instrumento lave automaticamente os bicos e fotografe cada lâmina. Revise as imagens para confirmar a distribuição uniforme e a colocação correta das gotas em todas as lâminas.

Após a incubação, dispense a solução de hidroxilamina para têmpera. Para pegar a amostra, selecione a execução na aba principal e então inicie a execução na aba da execução. Depois que a coleta terminar, revise as imagens para verificar se há algum erro.

Depois de terminar com o captador, remova a tampa da placa do captador. Depois, secar as amostras em baixa temperatura em um concentrador a vácuo. Para aquisição de dados, programe o método de cromatografia líquida de alto desempenho.

Configure o experimento MS dois para conter janelas de isolamento de 50% de sobrecarga de massa, dissociação de colisão de alta energia de 27% e meta automática de controle de ganho de 1000%. Cubra a placa com um tapete de vedação de borracha e coloque-a dentro do autoamostrador. Após obter os arquivos brutos, verifique brevemente o cromatograma e então execute os dados brutos na versão 2.1 do EpiProfile. Revise a tabela de saída das abundâncias normalizadas de PTM de histonas e utilize-a para análises posteriores.

Os primeiros 20 peptidoformas H3 de histonas foram quantificados, exibindo suas abundâncias relativas em condições de controle e tratadas com butirato de sódio. Tanto a acetilação de H3 K9 quanto a acetilação de H3 K14 apresentaram maior abundância relativa durante o tratamento com butirato de sódio. Enquanto a acetilação H3 K9, a acetilação K14 parecia ainda mais enriquecida nas células tratadas.

Os níveis totais de acetilação aumentaram após o tratamento com butirato de sódio, com células tratadas apresentando uma distribuição de erros mais ampla em comparação com os controles, refletindo a maior heterogeneidade capturada no nível de célula única. A quantificação de modificações de histonas simples e coocorrentes demonstrou que os estados de acetilação combinatória foram mais fortemente afetados pelo butirato de sódio. A dispersão mais ampla das células tratadas com butirato de sódio indicou maior heterogeneidade biológica entre células individuais dentro dos esferoides.

Esse protocolo fecha a lacuna na pesquisa epigenética ao permitir que cientistas estudem estados de cromatina em solução unicelular. Esse fluxo de trabalho permite a preparação de amostras de alta potência, multiplexação de amostras e espectrometria de massa imparcial para produzir dados epigenéticos de células únicas sensíveis e quantitativos. Pesquisas futuras explorarão como a regulação da cromatina está alterando estados de doença como câncer, doenças metabólicas e envelhecimento.