Preparação Automatizada de Amostras para a Análise Multiplexada de Modificações Pós-Traducionais de Histonas de Célula Única (sc-hPTM2)
December 19th, 2025
Aqui, apresentamos um protocolo para automatizar a análise de modificação pós-translacional de histonas de célula única usando uma estratégia de rotulagem isotópica de dois plexos e digestão com ArgC. Esse fluxo de trabalho permite um perfil quantitativo, reproduzível e de alta sensibilidade da heterogeneidade da cromatina e respostas epigenéticas em resolução de célula única.
Estamos avançando a proteômica de célula única com um método automatizado de multiplexação para estudar a heterogeneidade global da cromatina para modificações pós-traducionais. O que torna esse protocolo desafiador é a preparação proteômica em escala picograma, a marcação multiplex, bem como a resolução de peptidos histonas modificados combinatórios complexos. Para começar, reconstitua as células hepatocelulares do carcinoma Hep G2/C3A em uma concentração final de 200 a 500 células por microlitro em PBS gelado.
Ajuste a largura de pulso e a tensão de acionamento de cada bico nos valores fornecidos pelo fabricante. Para máxima eficiência do captador, certifique-se de que o deslocamento Z entre os dois bicos diferia em menos de 50 micrômetros. Identifique a posição ótima de contato para cada bico e compare as leituras de altura Z na aba de configuração do bico.
Para o esquema de multiplexação tuplex, carregue um único slide no suporte do slide na capuza e depois transfira-o para o instrumento. Usando uma pipeta, coloque 150 microlitros de DMSO grau LCMS em um novo tubo de PCR. Coloque-o na posição dois da estação de lavagem com a tampa do tubo voltada para a porta do instrumento.
Comece a run DMSO. Obtenha uma queda estável depois que o DMSO foi aspirado. Note a mudança na transparência do PDC.
Pode ser necessário aumentar a tensão. Verifique a estabilidade realizando uma verificação de volume de queda. Execute o setup do assistente de câmera de cabeça para alinhar a câmera.
Dispense DMSO e permita que o instrumento lave automaticamente os bicos e capture imagens em todos os slides para controle de qualidade. Revise essas imagens para verificar uma gota DMSO uniforme em cada lâmina e para verificar gotas ausentes ou fora do alvo. Após aspirar a suspensão da célula, abra a célula em um módulo, realize uma captura de fundo e então execute a rotina de mapeamento para definir a zona de ejeção.
Execute a análise e então faça um gate para selecionar células com base no tamanho e alongamento. Agora, prepare uma mistura master de digestão fresca em água grau LCMS. Desgasifice a solução com uma bomba de vácuo por 10 minutos no gelo.
Após distribuir a mistura de digestão nas lâminas, deixe o instrumento lavar automaticamente os bicos e fotografar cada lâmina. Revise as imagens para verificar se cada gota recebe a mistura digestiva de forma uniforme. Incube as lâminas em temperatura ambiente durante a noite para realizar a digestão.
Após iniciar a evaporação e a digestão durante a noite, inspecione as imagens. Se as gotículas estiverem suficientemente secas, pare a corrida. Se não, clique em continuar e seque por mais cinco minutos.
Para a rotulagem, primeiro prepare soluções padrão para derivitização multiplexada de histonas. Após a dispensação, permita que o instrumento lave automaticamente os bicos e fotografe cada lâmina. Revise as imagens para confirmar a distribuição uniforme e a colocação correta das gotas em todas as lâminas.
Após a incubação, dispense a solução de hidroxilamina para têmpera. Para pegar a amostra, selecione a execução na aba principal e então inicie a execução na aba da execução. Depois que a coleta terminar, revise as imagens para verificar se há algum erro.
Depois de terminar com o captador, remova a tampa da placa do captador. Depois, secar as amostras em baixa temperatura em um concentrador a vácuo. Para aquisição de dados, programe o método de cromatografia líquida de alto desempenho.
Configure o experimento MS dois para conter janelas de isolamento de 50% de sobrecarga de massa, dissociação de colisão de alta energia de 27% e meta automática de controle de ganho de 1000%. Cubra a placa com um tapete de vedação de borracha e coloque-a dentro do autoamostrador. Após obter os arquivos brutos, verifique brevemente o cromatograma e então execute os dados brutos na versão 2.1 do EpiProfile. Revise a tabela de saída das abundâncias normalizadas de PTM de histonas e utilize-a para análises posteriores.
Os primeiros 20 peptidoformas H3 de histonas foram quantificados, exibindo suas abundâncias relativas em condições de controle e tratadas com butirato de sódio. Tanto a acetilação de H3 K9 quanto a acetilação de H3 K14 apresentaram maior abundância relativa durante o tratamento com butirato de sódio. Enquanto a acetilação H3 K9, a acetilação K14 parecia ainda mais enriquecida nas células tratadas.
Os níveis totais de acetilação aumentaram após o tratamento com butirato de sódio, com células tratadas apresentando uma distribuição de erros mais ampla em comparação com os controles, refletindo a maior heterogeneidade capturada no nível de célula única. A quantificação de modificações de histonas simples e coocorrentes demonstrou que os estados de acetilação combinatória foram mais fortemente afetados pelo butirato de sódio. A dispersão mais ampla das células tratadas com butirato de sódio indicou maior heterogeneidade biológica entre células individuais dentro dos esferoides.
Esse protocolo fecha a lacuna na pesquisa epigenética ao permitir que cientistas estudem estados de cromatina em solução unicelular. Esse fluxo de trabalho permite a preparação de amostras de alta potência, multiplexação de amostras e espectrometria de massa imparcial para produzir dados epigenéticos de células únicas sensíveis e quantitativos. Pesquisas futuras explorarão como a regulação da cromatina está alterando estados de doença como câncer, doenças metabólicas e envelhecimento.
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Visão Geral
Este artigo apresenta um protocolo para automatizar a análise de modificação pós-traducional de histonas em células individuais usando uma estratégia de marcação isotópica two-plex. O fluxo de trabalho permite o perfil quantitativo e de alta sensibilidade da heterogeneidade da cromatina em resolução de célula única.
Componentes Principais do Estudo
Área da Ciência
- Proteômica de célula única
- Modificações pós-traducionais de histonas
- Análise da cromatina
Fundamentos
- A análise de célula única é crucial para entender a heterogeneidade celular.
- As modificações pós-traducionais desempenham um papel fundamental na regulação da estrutura e função da cromatina.
- Métodos automatizados podem melhorar a reprodutibilidade e sensibilidade em estudos proteômicos.
- Os desafios incluem lidar com tamanhos de amostra pequenos e misturas complexas de peptídeos.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um protocolo robusto para analisar modificações de histonas em resolução de célula única.
- Melhorar a eficiência da marcação multiplex em fluxos de trabalho proteômicos.
- Abordar os desafios dos peptídeos de histona de baixa abundância.
Métodos Utilizados
- Reconstituição de células Hep G2/C3A em PBS a uma concentração especificada.
- Ajuste dos parâmetros do bico para a coleta ideal da amostra.
- Implementação da marcação isotópica two-plex para quantificação.
- Uso da digestão ArgC para preparação do peptídeo.
Principais Resultados
- Automação bem-sucedida da análise de modificação de histonas em células individuais.
- Alta sensibilidade e reprodutibilidade demonstradas no perfil.
- Resolução efetiva de peptídeos de histona modificados combinatoriamente complexos.
- Insights sobre heterogeneidade da cromatina e respostas epigenéticas.
Conclusões
- O protocolo desenvolvido aprimora o estudo da dinâmica da cromatina em resolução de célula única.
- A automação melhora significativamente a eficiência da análise de modificações de histonas.
- Este método pode ser aplicado a várias questões biológicas relacionadas à epigenética.
Perguntas Frequentes
Executive Industry Relevance
Automated single-cell histone PTM analysis addresses the critical challenge of resolving chromatin heterogeneity and epigenetic regulation at cellular resolution. This workflow enhances predictive confidence in early discovery by enabling quantitative, multiplexed profiling of histone modifications across individual cells. The approach supports risk-adjusted portfolio decisions by providing high-content, reproducible data on epigenetic states relevant to disease and therapeutic modulation.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of chromatin regulatory mechanisms at the single-cell level.
- Supports functional target validation by quantifying histone PTM changes in response to perturbations.
- Facilitates mechanistic de-risking through direct measurement of epigenetic heterogeneity.
- Improves predictive confidence for target selection and triage in epigenetic drug discovery.
Screening & Assay Development
- Prepares validated single-cell systems for downstream screening of epigenetic modulators.
- Delivers standardized, reproducible, and quantitative histone PTM readouts for assay development.
- Enables multiplexed comparison of treatment conditions using isotopic labeling strategies.
- Supports scalable, high-throughput workflows for compound evaluation in chromatin biology.
Translational & Preclinical Research
- Aligns single-cell epigenetic profiling with disease-relevant models such as tumor spheroids.
- Provides continuity from discovery to preclinical validation by capturing cellular heterogeneity in response to therapeutic agents.
- Enables risk-adjusted advancement decisions based on quantitative chromatin state data.
- Supports translational biomarker identification for epigenetic drug development.
Pipeline & Workflow Integration
This automated protocol integrates into the discovery-to-preclinical continuum by enabling high-content, quantitative analysis of histone PTMs at single-cell resolution.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing and pathway clarification by resolving cell-to-cell chromatin variability.
- Screening: Provides assay-ready, multiplexed outputs for robust compound screening and comparison.
- Analytics: Delivers quantitative, normalized histone PTM abundance tables for statistical analysis and condition comparison.
- Translational Research: Connects single-cell epigenetic data to disease models and therapeutic response evaluation.
- Enterprise Reuse: Establishes a scalable, automated capability for ongoing epigenetic profiling across programs.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence and reduces mechanistic ambiguity in chromatin-targeted discovery.
- Operational Value: Standardizes and automates sample preparation for reproducibility and scalability.
- Strategic Value: Enables better go/no-go decisions and capital efficiency by providing high-content, quantitative data.
- Portfolio Impact: Supports risk-adjusted prioritization and advancement of epigenetic targets and compounds.
Implementation Considerations
- Requires expertise in single-cell proteomics and mass spectrometry data analysis.
- Needs access to automated nano liquid handling and high-resolution LC-MS instrumentation.
- Demands cross-team standardization for sample preparation and data processing workflows.
- Adaptation may be needed for different cell types or disease models.
- Throughput and sensitivity are limited by instrument capacity and sample handling precision.
