Fluxo de trabalho completo para Análise de histona modificações pós-traducionais Usando Bottom-up Espectrometria de Massa: De histona Extração de Análise de Dados

O objetivo geral deste protocolo é fornecer um procedimento simples para avaliar a abundância relativa de modificações pós-traducionais de histonas, que desempenham papéis essenciais na biologia da cromatina, como regulação da expressão gênica e condensação cromossômica. Este método pode ajudar a responder a questões-chave no campo da biologia da cromatina. Por exemplo, quais modificações de histonas alteram sua abundância relativa na estimulação ou tratamento de determinadas células ou tecidos.

A principal vantagem dessa técnica é que, usando proteômica baseada em espectrometria de massa, podemos quantificar simultaneamente a maioria dos PTMs conhecidos em proteínas conhecidas em uma única análise. A análise de modificação de histonas tem inúmeras aplicações, incluindo a estimativa de alterações epigenéticas e operação da cromatina de indivíduos ou sistema modelo após tratamento medicamentoso ou estresse. Além de Simone, outros dois membros do meu laboratório demonstrarão os procedimentos deste protocolo.

Natarajan Bhanu, especialista em pesquisa, e Kelly Karch, estudante de pós-graduação. Conforme mostrado neste fluxo de trabalho, este é um protocolo de 10 etapas que inclui purificação de histonas de culturas de células ou tecidos, derivatização de histonas, digestão e dessalinização e análise de espectrometria de massa usando cromatografia líquida de nanofluxo. Apenas os procedimentos selecionados serão demonstrados neste vídeo.

Para iniciar o procedimento de isolamento de núcleos de células intactas, descongele no gelo, células que foram previamente colhidas e armazenadas a 80 graus Celsius negativos. E prepare o buffer de isolamento nuclear, ou NIB, conforme descrito no texto do protocolo. Remova um quinto do volume do NIB e adicione a alternativa NP-40 a uma concentração final de 0,2%O volume restante de quatro quintos será usado para lavagens.

Lave o pellet celular com NIB sem alternativa NP-40, usando uma proporção de 1:10 entre o volume do pellet celular e o volume tampão. Centrifugar a 700 RCF durante cinco minutos e retirar o sobrenadante. Lise o pellet celular colocando-o no gelo e adicionando NIB com 0,2% NP-40 Alternative na proporção de 1:10 do volume do pellet celular para o volume tampão.

Homogeneizar as células por pipetagem suave. Incube as células homogeneizadas no gelo por cinco a 10 minutos para que as células se lisem e liberem os núcleos. Centrifugue a 1000 RCF por cinco a 10 minutos a quatro graus Celsius.

O pellet conterá principalmente núcleos celulares, enquanto o sobrenadante conterá principalmente componentes citoplasmáticos. Salve a fração citoplasmática, se desejar. Lave o pellet de núcleos ressuspendendo-o suavemente NIB sem alternativa NP-40, usando uma proporção de 1:10 do volume do pellet para o volume do tampão.

Centrifugue a 1000 RCF por cinco minutos a quatro graus Celsius e remova o sobrenadante. Depois que o NP-40 Alternative for completamente removido do pellet de núcleos, adicione ácido sulfúrico molar 0,2 molar gelado a uma proporção de 1:5 do volume de núcleos para o volume de ácido sulfúrico. Ressuspenda os núcleos no ácido sulfúrico por pipetagem suave.

Incubar a amostra com rotação constante ou agitação suave por duas a quatro horas a quatro graus Celsius. Em seguida, centrifugue a amostra a 3400 RCF a quatro graus Celsius por cinco minutos e transfira o sobrenadante para um novo tubo. Centrifugue novamente e transfira o sobrenadante para um novo tubo para remover qualquer material insolúvel.

Para precipitar as histonas, adicione ácido tricloroacético 100% resfriado, ou TCA, ao sobrenadante coletado em uma proporção de volume de 1:3. A presença de histonas é indicada pela amostra ficando turva. Misture invertendo o tubo algumas vezes.

Incube a mistura no gelo por pelo menos uma hora. Centrifugar a 3400 RCF durante cinco minutos. Após a centrifugação, as histonas revestirão as laterais do tubo e também se depositarão no fundo.

Um pellet branco e insolúvel também se formará no fundo do tubo, que contém principalmente proteínas não histonas e outras biomoléculas. Remova cuidadosamente o sobrenadante por aspiração, sem raspar as laterais do tubo ou o pellet no fundo do tubo. Usando uma pipeta Pasteur de vidro, enxágue o tubo com acetona gelada a 100% mais ácido clorídrico a 0,1%, de modo a cobrir as proteínas precipitadas que revestem as laterais e o fundo.

Centrifugar a 3400 RCF durante dois minutos. Aspirar o sobrenadante com cuidado, sem raspar os lados ou o pellet. Enxágue o tubo com acetona 100% gelada, centrifugue novamente e remova o sobrenadante sem raspar as laterais ou o pellet.

Posteriormente, a quantificação de histonas e a análise de pureza são realizadas conforme descrito no texto do protocolo. Um fracionamento opcional de variantes de histonas por HPLC de fase reversa também pode ser realizado antes da derivatização de histonas. Comece este procedimento dissolvendo as amostras de histonas em 40 microlitros de bicarbonato de amônio 50 milimolar, pH 8,0.

Verifique o pH inserindo uma ponta de pipeta P10 na amostra sem aspiração e tocando a ponta da pipeta em uma tira indicadora de pH. Use hidróxido de amônio e ácido fórmico para ajustar o pH para 8,0. A partir daqui, todas as etapas que envolvem o uso de anidrido propiônico devem ser realizadas em uma capela de exaustão.

Processe no máximo três a quatro amostras por vez, a fim de manter o anidrido propiônico reativo. Preparar o reagente de propionilação fresco misturando anidrido propiónico com acetonitrilo numa proporção de volume de 1:3. Adicionar o reagente de propionilação a cada amostra numa proporção volumétrica de 1:4.

Adicione rapidamente hidróxido de amônio para restabelecer o pH 8,0 à solução. Normalmente, a adição de hidróxido de amônio à amostra com uma proporção de volume de 1:5 é apropriada para restabelecer o pH 8,0. Misture imediatamente por vórtice.

Verifique o pH. Incubar as amostras à temperatura ambiente durante 15 minutos. Depois que todas as amostras tiverem sido submetidas à propionilação, seque as amostras até 10 a 20 microlitros em um concentrador a vácuo.

Ressuspenda ou dilua as amostras com ddH20 até que 40 microlitros de volume final sejam alcançados. Uma vez que os sais impedem a cromatografia líquida e a espectrometria de massa, as amostras devem ser dessalinizadas antes da análise. Para os fins deste vídeo, apenas a construção das dicas de palco será demonstrada.

Use uma ponta de pipeta P1000 para perfurar um disco de material C18 de um disco de extração em fase sólida. Use um capilar de sílica fundida para empurrar o minidisco para fora da ponteira P1000 e para a parte inferior de uma ponteira de pipeta P100 ou P200. Certifique-se de que o disco esteja firmemente preso na parte inferior da ponta.

Se dessalinizar mais de 25 microgramas de amostra, utilizar dois minidiscos C18 na mesma ponta P100 ou P200. Use um adaptador de centrífuga para manter as pontas do estágio no lugar em tubos de microcentrífuga de 1,5 ou dois mililitros. Lave a resina girando com 50 microlitros de acetonitrila a 100% para ativar o material C18 e remover possíveis contaminantes.

A dessalinização da amostra é realizada posteriormente, conforme descrito no texto do protocolo. Os peptídeos de histonas estão presentes em uma variedade de formas isobáricas. Dois exemplos comumente abundantes na análise de histonas são mostrados.

O cromatograma de íons extraído de sua massa precursora e isótopos relativos, mostrado acima, é idêntico. No entanto, o cromatograma de íons extraído dos íons produtos, mostrado abaixo, permite a discriminação das duas formas isobáricas. Apenas íons de fragmentos únicos, destacados em vermelho, devem ser usados para estimar a abundância relativa das duas espécies.

Histonas extraídas de células-tronco embrionárias humanas, com e sem estimulação com ácido retinóico, foram analisadas. A quantificação relativa de dois peptídeos de histonas H3 revelou uma clara redução da acetilação em células-tronco embrionárias humanas, estimuladas para diferenciação. Isso é consistente com relatos anteriores de maior acetilação em células-tronco embrionárias, em comparação com células diferenciadoras.

Uma vez dominada, essa técnica pode ser feita em três dias se executada corretamente. Um dia para extração de histonas, o segundo dia para derivatização e digestão de proteínas e o terceiro dia para derivatização de peptídeos, inclinação de estágio e análise de LC-MS. A purificação de histonas pode ser explorada para outros fins além da análise de peptídeos, incluindo proteômica de meio para baixo e de cima para baixo, onde é possível caracterizar modificações combinatórias de histonas.

Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como identificar e quantificar a modificação pós-traducional de histonas usando proteômica baseada em espectrometria de massa.