Preparação de Proteômica de Célula Única para Análise de Espectrometria de Massa usando Lise de Calor Congelante e um Transportador Isobárico

SCoPE2 pode quantificar milhares de proteínas de milhares de células de mamíferos individuais sem anticorpos. Este protocolo pode ajudar a descobrir a heterogeneidade do proteoma que, de outra forma, seria invisível para análises em massa. A proteômica de célula única, usando a abordagem SCoPE2, foi projetada para ser acessível a pesquisadores com uma variedade de recursos, desde apenas uma pipeta até robótica de manuseio de líquidos.

O SCoPE2 é amplamente aplicável a muitas áreas de pesquisa, incluindo câncer e imunologia, fornecendo informações sobre como as proteínas são diferenciais em abundância entre células individuais da mesma população. Para começar, inicie o procedimento de lise celular colocando uma placa de 384 poços com células únicas classificadas no termociclador, aquecendo-a por 10 minutos a 90 graus Celsius, seguida de resfriamento a 12 graus Celsius. Gire a placa brevemente em um girador de placa de bancada a 18 a 22 graus Celsius.

Sonicate a placa por cinco minutos em um sonicator de banho de água a 18 a 22 graus Celsius. Em seguida, coloque-o no gelo. Para prosseguir com a digestão da tripsina, prepare 100 microlitros da mistura mestra e adicione 0,2 microlitros da mistura mestra a cada poço da placa de 384 poços usando um manipulador de líquidos.

Sele a placa, o vórtice por cinco segundos e gire para baixo em um girador de placa de bancada a 18 a 22 graus Celsius. Aqueça a placa de 384 poços por três horas a 37 graus Celsius com a temperatura da tampa ajustada para 52 graus Celsius. Para definir uma reação de marcação de massa tandem, retire os estoques de 85 milimolares de tags de massa tandem do freezer de menos 80 graus Celsius.

Antes de abri-los, aqueça os tubos à temperatura ambiente e dilua os rótulos para 22 milimoles em acetonitrila anidra. Usando essa estratégia de rotulagem, adicione 0,5 microlitros de etiquetas de massa em tandem diluídas a cada poço da placa de 384 poços, usando um robô de dosagem de líquidos ou uma pipeta manual. Sele a placa, o vórtice por cinco segundos e gire para baixo em um girador de placa de bancada a 18 a 22 graus Celsius.

Deixe a reação de rotulagem prosseguir a 18 a 22 graus Celsius por uma hora. Para a têmpera da reação de marcação de massa tandem, adicione 0,2 microlitros de hidroxilamina a 0,5%, diluídos em água de grau HPLC, a cada poço da placa de 384 poços usando um manipulador de líquidos. Sele a placa, o vórtice por cinco segundos e gire para baixo em um girador de placa de bancada antes de manter a placa a 18 a 22 graus Celsius por 30 minutos.

A preparação da análise LC-MS é iniciada removendo o transportador combinado ou o material de referência do congelador de menos 80 graus Celsius. Para cada conjunto, pipetar um microlitro de suporte e material de referência para o primeiro poço, fará parte de um único conjunto. Pipetar o volume completo do primeiro poço para o poço subsequente.

Continue pipetando o volume completo de um poço para o outro até que todos os poços incluídos em um único conjunto tenham sido combinados no poço final. Para cada conjunto, adicionar cinco microlitros de acetonitrila a 50% diluídos em água de grau de HPLC para o primeiro poço de célula única a ser incluído em cada conjunto. Pipetar o volume completo do primeiro poço para o poço subsequente.

Continue pipetando o volume completo de uma célula para a próxima, até que todos os poços incluídos em um único conjunto tenham sido combinados no poço final. Agora transfira cada conjunto para suas inserções de vidro do amostrador automático. Seque as amostras assim que todos os conjuntos forem combinados e colocados em inserções de vidro.

Antes da análise LC-MS-MS, adicione 1,2 microlitros de ácido 0,1% fórmico a cada conjunto para ressuspender os peptídeos marcados. Coloque as inserções do amostrador automático nos frascos para injetáveis do amostrador automático de vidro e feche cada amostra com uma tampa. Vórtice cada frasco para injetáveis durante cinco segundos para se certificar de que a ressuspensão está completa e, em seguida, gire para baixo num rotador de frasco para injetáveis a 18 a 22 graus Celsius.

Certifique-se de que cada amostra esteja na parte inferior da pastilha, em vez de espirrada nas laterais. Coloque os frascos para injetáveis no tabuleiro do amostrador automático e, para cada conjunto, injete uma amostra de um microlitro para análise LC-MS-MS. A eficiência de digestão e rotulagem das células individuais pode não ser diretamente ensaiada como com o transportador, mas o software DO-MS fornece gráficos que estimam a eficiência de digestão e rotulagem.

A má digestão é indicada por uma alta proporção da intensidade dos peptídeos misclivados para suas contrapartes completamente clivadas. Outro fator a ser considerado nos conjuntos é a fração de dados ausentes na intensidade mediana do íon repórter em cada canal de marcação de massa tandem. Quando células individuais são preparadas com sucesso, os dados faltantes por célula e o controle positivo são muito menores do que as amostras de controle negativo.

O manuseio cuidadoso do líquido durante a preparação da amostra LC-MS-MS é fundamental para a máxima recuperação dos peptídeos. Pequenas amostras de aproximadamente 100 picogramas a 100 nanogramas por poço podem ser preparadas para análise proteômica usando um transportador isobárico. O SCoPE2 torna as medições proteômicas de célula única acessíveis a pesquisadores em todo o mundo, usando apenas reagentes comuns e equipamentos comercialmente disponíveis.

É passível de processamento manual ou automação de alto rendimento por manuseio robótico de líquidos.