Análise Comparativa da Estrutura de RNA de Transcritos Nascentes e Maduros em Saccharomyces cerevisiae

Estudamos o processamento cotranscricional de RNA, e isso inclui como o RNA nascente se dobra ao emergir da RNA polimerase que o sintetiza. Antes desse método, não conseguíamos monitorar como o RNA se dobra durante a síntese, e isso estava nos atrasando em nossa pesquisa. Então esse novo método supera essas lacunas.

O CoSTseq foi desenvolvido para investigar o dobramento de RNA nascente em leveduras. É particularmente eficaz para analisar RNAs altamente abundantes. Para começar, inocule a cepa BY4741 de Saccharomyces cerevisiae em 50 mililitros de substrato YPAD e incube a 30 graus Celsius com agitação a 200 rotações por minuto até que a cultura atinja a fase média do log.

Colete aproximadamente três mililitros de cultura de levedura correspondente a 1,8 unidades de densidade óptica e centrifuge a 2.500 x g por três minutos a quatro graus Celsius usando uma centrífuga pré-resfriada. Descarte o sobrenadante em um recipiente de resíduos. Ressuspenda o pellet em 10 mililitros de PBS frio e centrifuge novamente a 2.500 x g por três minutos a quatro graus Celsius.

Remova o sobrenadante e mantenha a pastilha de levedura no gelo. Suspenda cuidadosamente o pellet de levedura em 10 mililitros de sarkosil frio 0,5% sem criar bolhas. Incube a levedura ressuspensa no gelo por 20 minutos para permitir a permeação, depois faça pellets nas células a 400 x g por cinco minutos a quatro graus Celsius e ressuspenda as células permeáveis da levedura em 100 microlitros de água sem nuclease usando uma pipeta P-1000.

Prepare uma solução funcional de buffer de transcrição 2,5X com cinco milimolares ditiotreitol recém-adicionados e pré-aqueça um buffer de sondagem estrutural 2,5X a 30 graus Celsius. Em um tubo limpo de dois mililitros, adicione todos os componentes necessários da reação e misture bem. Em seguida, adicione 100 microlitros das células de levedura preparadas ao tubo de reação e incube-as no misturador térmico ajustado a 30 graus Celsius, com agitação a 500 rotações por minuto por dois minutos.

Depois, adicione rapidamente 200 microlitros do tampão de sondagem estrutural pré-aquecido 2,5X e 25 microlitros de reagente sulfato de dimetil simultaneamente. Faça vórtice no tubo suavemente em duas pulsações e coloque-o de volta na incubadora, ajustado a 30 graus Celsius e 500 rotações por minuto. Continue incubando na misturadeira térmica por quatro minutos, espaçando 30 segundos entre as amostras.

Prepare os buffers de parada e lavagem com antecedência e coloque-os no gelo até o uso. Interrompa a metilação do dimetil sulfato adicionando um mililitro de tampão de parada ao tubo de reação. Agora centrifuge as amostras marcadas com sulfato de dimetil a 3.500 x g por cinco minutos em uma centrífuga pré-resfriada.

Após a rodada, descarte o sobrenadante em um recipiente de resíduos apropriado. Adicione um mililitro de buffer de lavagem gelada ao pellet e ressuspenda. Repita a centrifugação a 3.500 x g por cinco minutos.

Proceda imediatamente à extração de RNA e não congele o pellet de levedura. Ressuspenda o pellet de levedura marcado com sulfato de dimetil em 600 microlitros de tampão de lise de RNA e, em seguida, transfira a suspensão para um tubo contendo 40 micrôlitros de dodecilsulfato de sódio a 20%. Incube a amostra a 65 graus Celsius por 30 segundos, com agitação a 950 rotações por minuto.

Em seguida, realize a extração de fenol-clorofórmio do RNA seguindo o procedimento padrão. Vártice as esferas magnéticas de estreptavidina e transfira 44 microlitros das esferas para um novo tubo para cada amostra de 80 microgramas de RNA total. Coloque as contas magnéticas em um suporte magnético até que elas se assentem.

Após remover o buffer de armazenamento, ressuspenda as esferas em um mililitro de buffer pré-wash A. Agora incube a suspensão por dois minutos em temperatura ambiente, depois magnetize e remova o sobrenadante. Após a lavagem, resuspenda as esferas em 88 microlitros de buffer de ligação 2X. Transfira 80 microlitros da suspensão para um tubo estéril de 1,5 mililitro contendo 80 microgramas de amostra de RNA biotinilado em 80 microlitros.

Gire a mistura da amostra de esferas em um rotador por 20 minutos em temperatura ambiente. Em seguida, coloque o tubo no suporte magnético para coletar o fluxo que contém RNA maduro e guardá-lo para a precipitação, realizando a seleção poli-A de RNAs maduros usando o fluxo de trabalho DMS-MaPseq. Em seguida, enxágue o complexo de RNA nascente com esferas duas vezes com 500 microlitros de tampão de alta teor de sal.

Depois, enxágue uma vez com 500 microlitros de tampão de ligação 1X, seguido de um enxágue final com 500 microlitros de tampão baixo em sal. Agora adicione 300 microlitros de reagente de RNA ao complexo de esferas = RNA nascente, ressuspenda completamente e incube no misturador térmico por cinco minutos a 60 graus Celsius. Em seguida, adicione 60 microlitros de clorofórmio, faça o vórtice e incube por três minutos em temperatura ambiente.

Centrifuge a amostra a 14.000 x g por cinco minutos na centrífuga pré-resfriada. Por fim, transfira a fase aquosa superior, aproximadamente 180 microlitros, para um novo tubo de coleta. Descarte a fase orgânica restante, deixando para trás as esferas e a solução aquosa residual.

Após purificar o RNA nascente, realizar transcrição reversa com troca de templates, ligar o adaptador 5' e selecionar bibliotecas para sequenciamento. A visualização dos produtos de teste de PCR em um gel de 1%agarosa revelou formação mínima de dímeros de primer e uma extensão característica em torno de 300 pares de bases para sequenciamento de co-transcrição estrutural ou bibliotecas CoSTseq e DMS-MaPseq. O eletroferograma da amostra CoSTseq um confirmou a distribuição do tamanho da biblioteca com um pico em torno de 285 pares de bases.

O alinhamento de leitura do mRNA ASC1 revelou que a biblioteca CoSTseq incluía cobertura em todo o intron, confirmando que o RNA está em fase inicial. Enquanto a biblioteca DMS-MaPseq não apresentava cobertura de introns, indicando que o RNA é maduro. A matriz de dobramento transcricional do 18S pré-rRNA revelou que a reatividade do DMS apresentou mudanças abruptas à medida que a RNA polimerase progredia da posição 790 para a 811 ao longo do locus de rDNA.

A análise de reatividade DMS do mRNA ADH1 mostrou perfis semelhantes entre formas nascentes e maduras, indicando regiões de estabilidade estrutural. Em contraste, o mRNA SSA2 apresentou regiões de diferente reatividade DMS entre formas nascentes e maduras, sugerindo mudanças estruturais durante a maturação. Com o CoSTseq, os pesquisadores podem determinar in vivo estruturas secundárias de RNA nascente e a posição da RNA polimerase ao longo dos transcritos de RNA.

O CoSTseq tem etapas sensíveis ao tempo, usa produtos químicos tóxicos. É melhor processar no máximo duas amostras por vez. A partir do RNA total gerado a partir do CoSTseq, RNAs não biotinilados podem ser usados para sondagem simultânea de estruturas maduras utilizando o DMS-MaPseq tradicional.