Name: Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae /em (Vídeo) | JoVE Journal
Uploaded: 2011-04-07T13:00:00.000+00:00
Duration: 13 min 17 s
Description: Aprenda análise de microarray usando Saccharomyces cerevisiae para estudar expressão gênica sob estresse oxidativo. Este método computacional ensina técnicas de biologia molecular a estudantes de graduação.

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<p class="jove_content"&gt; Universidade de Vermont, Vermont Genetics Network. Esta publicação foi possível graças à Genética Vermont rede, através de Grant Número P20 RR16462 do Programa BRIN e Número Grant P20 RR16462 do Programa INBRE do Centro de Pesquisa de Recursos theNational (NCRR), um componente do National Institutes of Health (NIH) . Seu conteúdo são da exclusiva responsabilidade dos autores e não representam necessariamente a posição oficial da NCRR ou NIH.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Nós gostaríamos de agradecer a todas as nossas instituições participantes alcance à sua colaboração e de entrada no refino este módulo Castleton State College, Green Mountain College, Johnson State College, Lyndon State College, Marlboro College, Middlebury College, Norwich University e do Colégio de São Miguel.</p&gt;

<ol><li>Van Gelder, R. N., von Zastrow, M. E., Yool, A., Dement, W. C., Barchas, J. D., Eberwine, J. H. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Amplified+RNA+synthesized+from+limited+quantities+of+heterogeneous+cDNA%5BTitle%5D)+AND+%22Proc+Natl+Acad+Sci+U+S+A%22%5BJournal%5D)">Amplified RNA synthesized from limited quantities of heterogeneous cDNA.</a> Proc Natl Acad Sci U S A. 87, 1663-1667 (1990).</li>
<li>Gasch, A. P., Spellman, P. T., Kao, C. M., Carmel-Harel, O., Eisen, M. B., Storz, G., Botstein, D., Brown, P. O. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Genomic+expression+programs+in+the+response+of+yeast+cells+to+environmental+changes%5BTitle%5D)+AND+%22Mol+Biol+Cell%22%5BJournal%5D)">Genomic expression programs in the response of yeast cells to environmental changes.</a> Mol Biol Cell. 11, 4241-4257 (2000).</li>
<li>D'Autréaux, B., Toledano, M. B. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((ROS+as+signalling+molecules%3A+mechanisms+that+generate+specificity+in+ROS+homeostasis%5BTitle%5D)+AND+%22Nat+Rev+Mol+Cell+Biol%22%5BJournal%5D)">ROS as signalling molecules: mechanisms that generate specificity in ROS homeostasis.</a> Nat Rev Mol Cell Biol. 8, 813-824 (2007).</li>
<li>Shenton, D., Smirnova, J. B., Selley, J. N., Carroll, K., Hubbard, S. J., Pavitt, G. D., Ashe, M. P., Grant, C. M. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Global+translational+responses+to+oxidative+stress+impact+upon+multiple+levels+of+protein+synthesis%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">Global translational responses to oxidative stress impact upon multiple levels of protein synthesis.</a> J Biol Chem. 281, 29011-29021 (2006).</li>
<li>Godon, C., Lagniel, G., Lee, J., Buhler, J. M., Kieffer, S., Perrot, M., Boucherie, H., Toledano, M. B., Labarre, J. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((The+H2O2+stimulon+in+Saccharomyces+cerevisiae%5BTitle%5D)+AND+%22J+Biol+Chem%22%5BJournal%5D)">The H2O2 stimulon in Saccharomyces cerevisiae.</a> J Biol Chem. 273, 22480-229 (1998).</li>
<li>Vermont Genetics Network. <a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Microarray+Outreach%22">Microarray Outreach</a>. , (2008).</li>
<li><a target="_blank" href="http://scholar.google.com/scholar?hl=en&safe=off&q=%22Affymetrix+GeneChip+Expression+Analysis%3A+Technical+Manual%22">Affymetrix GeneChip Expression Analysis: Technical Manual</a>. , Affymetrix. Santa Clara, CA. (2004).</li>
<li>Huang, D. W., Sherman, B. T., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((Systematic+and+integrative+analysis+of+large+gene+lists+using+DAVID+Bioinformatics+Resources%5BTitle%5D)+AND+%22Nature+Protoc%22%5BJournal%5D)">Systematic and integrative analysis of large gene lists using DAVID Bioinformatics Resources.</a> Nature Protoc. 4, 44-57 (2009).</li>
<li>Dennis, G. Jr, Sherman, B. T., Hosack, D. A., Yang, J., Gao, W., Lane, H. C., Lempicki, R. A. <a target="_blank" href="http://www.ncbi.nlm.nih.gov/pubmed?term=((DAVID%3A+Database+for+Annotation%2C+Visualization%2C+and+Integrated+Discovery%5BTitle%5D)+AND+%22Genome+Biol%22%5BJournal%5D)">DAVID: Database for Annotation, Visualization, and Integrated Discovery.</a> Genome Biol. 4, P3-P3 (2003).</li>
</ol>

A produção deste vídeo-artigo foi patrocinado pela EMD-Millipore.

<p class="jove_step"&gt; Aplicações e importância.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; O Vermont Genética Rede programa de extensão, na Universidade de Vermont, conduz à inclusão de graduação bacharelado oito faculdades parceiras em todo o estado. O objetivo do Núcleo VGN Outreach é expor alunos de graduação no estado de Vermont para o estado-da-arte da tecnologia científica e recursos utilizando experiências práticas. O módulo de microarray descrito foi desenvolvido em 2003 e posteriormente atualizado. Foi oferecido como um mini-curso ou integrado no currículo de laboratório existentes nas instituições participantes.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Este projecto, entre os núcleos de pesquisa universitários e faculdades de graduação, promove colaborações em educação e pesquisa. Microarray de expansão em todo o estado aumentou currículo e criado pesquisa e oportunidades de networking para as instalações do núcleo, professores e alunos.</p&gt;<p class="jove_content"&gt; Como docente de graduação adotar o programa que eles são incentivados a elaborar experimentos único, desde há GeneChips apropriado Affymetrix e anotação disponíveis. Todas as informações para este módulo, incluindo o manual de laboratório, referências e apresentações PowerPoint estão disponíveis online (Vermont Genetics Network, 2008).</p&gt;<p class="jove_step"&gt; As etapas críticas:</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Spheroplasting:</em&gt; É importante observar spheroplasting bem sucedido sob o microscópio. O uso de SDS é altamente benéfica, pois faz com que o inchaço levedura resultando em esferóides. É importante observar que as células de brotamento forma esferóides também. Se spheroplasting parcial é observado, um tratamento prolongado com lyticase é recomendado.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Limpeza Pellet:</em&gt; Durante a reação de precipitação e lavagem posterior de etanol, é muito fácil perder o pellet cDNA. Extremo cuidado e atenção meticulosa ao pellet é um imperativo.</p&gt;<p class="jove_content"<em&gt; Aplicando a água para o centro da membrana:</em&gt; Durante a etapa de eluição RNA a partir da membrana, é importante para &quot;injetar&quot; o 30 de mL de água diretamente para o centro da membrana de sílica. Se isso não for realizado, a coluna pode ser centrifugado eo elutant resultante pode ser re-aplicada à membrana de sílica novamente. Isto pode ser repetido tantas vezes quanto necessário.</p&gt;<p class="jove_step"&gt; Modificações e substituições de produto:</p&gt;<ol&gt;<li&gt; Alternativa RNA clean-up colunas podem ser substituídos. Exemplos disso são o USB prep facilidade ea Invitrogen link Pure RNA kit, eo Omega RNA kit de limpeza para citar alguns.</li&gt;<li&gt; Schizosaccharomyces pombe é uma levedura opcional. O GeneChip Affymetrix contém ambos os genomas no mesmo chip</li&gt;<li&gt; Vários tratamentos e tempos podem ser usados. Isso pode incluir tratamentos com medicamentos, tratamentos de temperatura, anti-oxidantes, os tempos de tratamento, etc também podem ser ajustados.</li&gt;<li&gt; DNase tratamento pode não ser necessário porque os métodos descritos empregar o uso de um primer Oligo (dT).</li&gt;<li&gt; Não é necessário realizar uma eluição dobro do RNA fora da coluna com a alíquota de 30 mL mesma. Uma vez que quase sempre é adequada. Isto é sugerido para assegurar que uma recuperação completa é obtida. Além disso, a água usada para eluir o RNA a partir da coluna podem ser pré-aquecida a 65 ° C para aumentar ainda mais a capacidade de recuperar RNA a partir da coluna de sílica.</li&gt;<li&gt; Muitos métodos estão disponíveis para quantificar RNA. A Eppendorf e Nanodrop só foram escolhidos devido a sua facilidade de uso e testado precisão.</li&gt;<li&gt; Eletroforese em gel de Agarose muitos ser realizada utilizando equipamento de laboratório padrão. O E-Gel não é necessário, mas é desejável porque é RNase livre e não requer a solidificação do gel tempo de espera.</li&gt;<li&gt; Informações sobre pedidos de produtos tem sido fornecido. No entanto, muitos reagentes geral pode ser encomendado a partir de vários fornecedores.</li&gt;<li&gt; Uma reagentes Ciclo cDNA podem ser adquiridos separadamente se que é mais rentável.</li&gt;<li&gt; Existem métodos de preparação se destina, mas nós sentimos este oferece mais oportunidades de ensino para o aluno.</li&gt;</ol&gt;

<table border="1"&gt;<tbody&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Geral Equipamentos de Laboratório</strong</td<td<strongEmpresa&gt;</strong</td<td<strong&gt; Número do produto</strong</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Spetrophotometer</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Thermocyler</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Microcentrífuga</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Vortex</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mexa Placas (2)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-10s pipetadores</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<tdPipetadores&gt; P-20 é:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; P-200 de pipetadores:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<tdPipetadores&gt; P-1000 é:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Câmara e transiluminador</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Artigos - recomendado</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Aparelhos E-Gel</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6000-08</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E-Gels</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; G6018-02</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 1,7 ml. Claro</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT175C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen tubos de 0,5 ml clara</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT060C</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Axygen 2ml tubos de captação</td<td&gt; Krackler</td<td&gt; 383-MCT200NC</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Caixas de pontas P-10 ART:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT10XL</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Caixas de P-100 ART dicas:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT200</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Caixas de P-20 Dicas ART:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT20</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Caixas de Sugestões P-1000 ART:</td<td&gt; CLP</td<td&gt; BT1000</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fichas de levedura</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Geral Fontes do laboratório</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 25 ml estéril pipetas descartáveis</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 5ml pipetas estéreis descartáveis</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Tubo de racks Microcentrifugue</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KimWipes:</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lab Coats</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Mexa Bares</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Frascos Cultura</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Loops inoculação</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sharpies</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Luvas</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Fita Autoclave</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Agitador bares</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td colspan="3"&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td<strong&gt; Reagentes</strong</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Peróxido de Hidrogênio 30%</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-386790?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 386790</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; HBSS sem Ca, Mg, ou tintura</td<td&gt; Sigma-Aldrich</td<td&gt; H6648-100ml</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen Rneasy Mini Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 74104</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Qiagen DNase Kit:</td<td&gt; Qiagen</td<td&gt; 79254</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Remover Rnase</td<td&gt; Denville Scientific</td<td&gt; D1180</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Harleco Alcohol 100%</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/harleco-alcohol/EMD_CHEM-65347/p_uuid?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 65347</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; ENZO IVT Kit</td<td&gt; ENZO</td<td&gt; ENZ-42655-10</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Lyticase: uma garrafa</td<td&gt; VWR</td<td&gt; IC19012310</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; A água, grau de cultura de células</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4.86505?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,86505</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Cultura Fermento:</td<td&gt; ATCC</td<td&gt; 18824</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; YPD caldo em pó</td<td<a href="http://www.emdchemicals.com/products/EMD_CHEM-4.85040?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4,8504</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; D (+) glicose, anidro</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-346351?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 346351</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Sorbitol</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-56755?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 56755</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; EDTA</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-4005?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 4005</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SDS solução, 20%</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-7990-OP?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 7990-OP</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pintura Pellet</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69049?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69049</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; PCI RNase DNase livre (7 alíquotas):</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; AC32711-500</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 7.5M NH4OAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; ICN1987 5980</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; A fragmentação tampão (200 mM Tris-acetato, pH 8,1, 500 mM KOAc, 150 mM MgOA)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Trizma Base de Dados</td<td&gt; Fiaher</td<td&gt; 50-899-90034</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; KOAc</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9757725</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; MgOA</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; NC9681042</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Loading Dye</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; 10482055</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Marcadores PCR</td<td<a href="http://www.merck-chemicals.com/products/EMD_BIO-69278-3?WT.mc_id=2usen000105
"&gt; EMD Millipore</a</td<td&gt; 69278-3</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Phase Lock Gel</td<td&gt; Fisher</td<td&gt; FP2302820</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Um ciclo de Kit cDNA</td<td&gt; Invitrogen</td<td&gt; A10752-030</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Inclui;</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. coli DNA Pol</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; DNTP de</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Pol DNA T4.</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; T-7 oligod (T)</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; 0,5 ml EDTA pH 8,0</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Primeiro buffer Strand</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. RNaseH coli</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; Segundo buffer Strand</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; E. DNA ligase coli</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; SuperScript II</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;<tr&gt;<td&gt; TDT</td<td&gt;</td<td&gt;</td</tr&gt;</tbody&gt;</table&gt;

microarray analysis for saccharomyces cerevisiae</em

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

Neste protocolo, a expressão gênica em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) é alterada após a exposição ao estresse oxidativo induzido pela adição de peróxido de hidrogênio (H 2 O 2), um agente oxidante. No experimento, o fermento é cultivado por 48 horas em caldo YPD 1/2X contendo glicose 3X. A cultura é dividido em um controle e grupo tratado. A cultura experimento é tratada com 0,5 mM H 2 O 2 em Buffered Saline Hanks (HBSS) por 1 hora. A cultura de controle é tratado com HBSS só. Total de RNA é extraído de ambas as culturas e é convertido em um produto marcado com biotina cRNA através de um processo de várias etapas. O produto final é a síntese levado de volta para o Mecanismo de Núcleo UVM Microarray e hibridizada com o fermento GeneChips Affymetrix. Os dados expressão resultante gene são enviados para bioinformática software de análise de dados.

Neste protocolo a expressão do gene, em leveduras (<em&gt; Saccharomyces cerevisiae</em&gt;) É alterada após a exposição ao estresse oxidativo induzido pela adição de peróxido de hidrogênio (H<sub&gt; 2</sub&gt; O<sub&gt; 2</sub&gt;), Um agente oxidante.

Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae</em

Neste protocolo, a expressão gênica em leveduras (Saccharomyces cerevisiae) é alterada após a exposição ao estresse oxidativo induzido pela adição de peróxido de hidrogênio...

O objetivo geral deste procedimento é apresentar a estudantes universitários de ciências a tecnologia de microarranjos, examinando as diferenças de expressão em leveduras submetidas a estresse oxidativo. Isso é realizado primeiramente isolando o RNA total de culturas de levedura tratadas com peróxido de hidrogênio e dos controles não tratados. O segundo passo do procedimento consiste em gerar e purificar cDNA a partir dessas amostras de RNA.O DNAc é então utilizado para preparar cRNA marcado com biotina por meio de transcrição in vitro. O passo final do procedimento é a fragmentação dos cRNAs marcados com biotina para hibridização com os chips gênicos de levedura AFI metrics. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as diferenças de expressão nas duas amostras de levedura e, por meio de bioinformática, demonstrar o poder da análise por microarranjo para estudantes de graduação.A equipe de Extensão da Rede de Genética de Vermont teve pela primeira vez a ideia deste método ao ser encarregada de disponibilizar a tecnologia de microrrevestimento para estudantes de ciências em todo o estado de Vermont, com o objetivo de aprimorar sua educação científica. Até o momento, este método foi implementado em múltiplos locais de oito faculdades de graduação em todo o estado. Assim, a principal vantagem do uso do microrrevestimento em módulos educacionais é que ele nos dá a capacidade de ensinar técnicas gerais de biologia molecular, utilizadas diariamente em laboratórios, a um grupo de indivíduos.E também utilizamos isso para ensinar a estudantes, professores e nossos grupos. Temos, de fato, estudantes e professores trabalhando juntos no mesmo projeto. Eles aprendem certas técnicas que exigem bastante habilidade, como o manuseio de RNA, que não é uma tarefa fácil.Eles aprendem como precipitar DNA utilizando reagentes de visualização. Eles realmente aplicam as técnicas que encontrarão nos estudos de pós-graduação ou nos laboratórios de biologia molecular do dia a dia. Embora este método seja adequado para obter informações sobre estresse oxidativo e leveduras, certamente pode ser aplicado a outros organismos modelo e a outros sistemas biológicos que você possa querer analisar.Alterações na expressão gênica, sejam elas associadas a mudanças no desenvolvimento, toxinas ambientais, estados específicos de doenças ou, de fato, a muitos outros fatores. Para examinar as diferenças de expressão em leveduras submetidas a estresse oxidativo, o RNA total é primeiramente extraído de dois cultivos de levedura por lise enzimática. Um cultivo foi exposto ao estresse oxidativo por meio de um tratamento de uma hora com 0,5 milimolar de peróxido de hidrogênio em solução salina tamponada de Hank, enquanto o outro cultivo foi tratado apenas com HBSS como controle.Inicie rotulando dois tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro com as informações de identificação apropriadas. Transfira 1,5 mililitro da cultura de levedura apropriada para cada tubo. Centrifugue os tubos a 5.000 Gs por dois minutos à temperatura ambiente.Após a centrifugação, use uma pipeta microlitros para remover e descartar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o precipitado. Verifique se o precipitado é grande o suficiente antes de prosseguir com o procedimento. Se o precipitado for muito pequeno, adicione 1,5 mililitros de cultura no mesmo tubo contendo o precipitado e, em seguida, centrifugue para obter um precipitado maior.Descarte o sobrenadante com uma pipeta microliter, removendo o máximo possível do líquido do pellet de levedura. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão SG e 30 microlitros de solução de liase ao pellet de levedura e vortexie para homogeneizar. Incube ambos os tubos por 30 minutos à temperatura ambiente durante a incubação.Agite suavemente cada tubo a cada 10 minutos para gerar plátas. Um dos passos mais críticos ao realizar o plaqueamento esférico de levedura é garantir que você realmente criou 100% de plástico esférico após o tratamento. Isso significa que nem todas as enzimas líticas são iguais.Portanto, você precisa verificar se a boa enzima lítica está proporcionando um bom esferoplastamento, o que significa que você deve coletar essas amostras, colocá-las em uma lâmina de microscópio e examinar ao microscópio após adicionar SDS a 0,1% para garantir que haja formação de protoplastos. Para observar o esferoplastamento completo, pipete 10 microlitros da amostra de levedura sobre uma lâmina de microscópio enquanto examina a amostra ao microscópio com um microlitro de SDS a 0,1%, o que faz com que as células de levedura inchem e formem esferas ou esferoides perfeitos. É importante observar que as células em brotamento também formam esferoides em forma de S.Se for observada placa esférica parcial, recomenda-se um tratamento prolongado com liase. Uma vez confirmada a placa esférica completa com 350 microlitros de tampão BRLT para cada tubo, adicione 250 microlitros de etanol a 100%. Certifique-se de que o tubo está bem fechado segurando a tampa fechada e vortexe vigorosamente por um minuto.Este procedimento irá lisear as placas Sphero. Após isso, utilize colunas R e easy Z spin para coletar e purificar o RNA das duas culturas. Por fim, avalie a qualidade do RNA extraído utilizando gel de agarose pré-moldado a 1,2% para eletroforese, a fim de preparar cRNA marcado com biotina.O RNA total extraído das células de levedura é inicialmente utilizado para sintetizar o CD NA por transcrição reversa. Após a geração do CD NA, prepare os tubos com gel de travamento de fase para uso na precipitação do CD NA; centrifugue os tubos com gel de travamento de fase em velocidade máxima por um minuto para garantir que o gel esteja na parte inferior do tubo. Não agite os tubos com gel por vortex para precipitar o CD NA; pipete 162 microlitros da camada inferior de uma mistura de fenol, cloreto de benzila, álcool isoamílico tamponada com tris em pH 8,0, ou mistura PCI, e adicione ao conteúdo de 162 microlitros do segundo filamento, no tubo de reação de síntese de CD NA; volumes iguais das misturas aquosa e orgânica são necessários nesta etapa.Vortex por cinco segundos para misturar o conteúdo. Em seguida, use uma micropipeta para transferir toda a mistura de CD N-A-P-C-I para o tubo com gel de bloqueio de fase. Não vortex o tubo com gel de bloqueio de fase; centrifugue em velocidade máxima por dois minutos.Em seguida, utilize uma micropipeta para transferir a camada superior do tubo com gel de bloqueio de fase para um novo tubo rotulado de 1,7 mililitro. Tente coletar o máximo possível dessa camada. Adicione ao tubo microcentrífugo de 1,7 mililitro: 405 microlitros de etanol a 100%, 80 microlitros de acetato de amônio e um microlitro de pellet paint vortex.Coloque brevemente o tubo na centrífuga com a dobradiça virada para fora e centrifugue em velocidade máxima por 20 minutos. Ao término da centrifugação, à temperatura ambiente, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar o pellet de CD NA. O pellet deve ser rosa devido à tinta marcadora e ter aproximadamente o tamanho de um grão de sal.Na lateral do tubo, sob a dobradiça, coloque o pellet de DNA no gelo e prossiga imediatamente para a limpeza do pellet. Para iniciar o procedimento de limpeza do pellet de DNA, utilize uma micropipeta P1000 para remover cuidadosamente todo o sobrenadante do tubo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet.Adicione sua amostra de 500 microlitros de etanol a 80% frio ao tubo. Tampe o tubo suavemente e inverta-o lentamente várias vezes. Observe atentamente o seu pellet para garantir que ele não se solte da parede do tubo.Se o pellet se soltar, você pode fazê-lo voltar para o fundo do tubo colocando o tubo novamente no suporte e deixando o pellet sedimentar até o fundo ou centrifugando o tubo em velocidade máxima por 15 segundos. Em seguida, use uma micropipeta P1000 para remover cuidadosamente o etanol sem perturbar o pellet. Incline o tubo para permitir a remoção da maior quantidade possível de líquido.Adicione uma nova porção de etanol a frio, a 80%, tampe o tubo e inverta-o lentamente várias vezes. Após remover todo o etanol possível utilizando uma micropipeta P1000, centrifugue o tubo em velocidade máxima durante cinco segundos.Em seguida, utilize uma micropipeta P10 para remover os últimos microlitros de etanol sem perturbar o pellet. Coloque o tubo aberto em uma caixa de secagem por 10 a 20 minutos para evaporar o etanol remanescente. O pellet pode ser facilmente perdido quando seco, portanto, tenha cuidado para manipular o tubo suavemente e fechar a tampa.Quando a secagem estiver concluída, visualize o pellet seco para confirmar sua presença no tubo. Por fim, reconstitua o pellet seco em 22 microlitros de água livre de RNA e coloque o tubo em gelo. Este cDNA é então utilizado para preparar cRNA marcado com biotina por transcrição in vitro usando o kit Enzo BioArray.Após o CRNA marcado com biotina ter sido purificado e quantificado, ele é fragmentado para a preparação do alvo. Uma vez que o cDNA tenha sido gerado, utilizamos então a metodologia padrão de transcrição in vitro para gerar CRNA biotinilado. O CRNA precisa passar por fragmentação antes de poder ser aplicado no chip de micromatriz.Para iniciar este procedimento, transfira uma quantidade equivalente a cinco microgramas de CRNA para um tubo PCR de 0,5 mililitro identificado. Adicione água livre de RNAses suficiente para atingir um volume total de 16 microlitros e, em seguida, adicione quatro microlitros de tampão de fragmentação 5x ao tubo. O volume total no tubo deve ser de 20 microlitros.Vortex a tubo e centrifugue por 10 segundos. Em seguida, incube o tubo a 94 graus Celsius por 30 minutos. Em um termociclador, coloque o tubo sobre gelo após a incubação.O RNac fragmentado e não fragmentado de cada amostra é então avaliado por eletroforese utilizando um gel AROS pré-moldado a 1,2%. Quando a corrida é concluída, o gel é visualizado em um transiluminador e uma imagem é adquirida. O produto final da síntese é hibridizado aos chips genéticos de levedura atric e aqui são apresentados resultados representativos da análise de microarray.Esta primeira figura é um exemplo de uma imagem digitalizada de um chip genético de levedura atrics gerada pelo software operacional do chip genético atrics. Este é um gráfico de dispersão bidimensional de todos os transcritos genéticos, cerca de 6.700 genes, comparando dados de levedura controle e tratados. Cada ponto representa um único gene.Genes coloridos em roxo indicam genes que são diferencialmente expressos, enquanto genes coloridos em vermelho não são. Neste exemplo, a maioria dos genes diferencialmente expressos são aqueles envolvidos no controle do ciclo celular, conforme indicado por suas descrições. Este fluxograma do banco de dados para anotação, visualização e descoberta integrada ilustra genes diferencialmente expressos em uma via biológica afetada.Os genes indicados com uma estrela vermelha indicam os genes subexpressos na via mitótica. Por fim, são apresentados aqui resultados representativos de um gráfico de volcão gerado usando o software Geo Species Gene Sifter. As amostras controle e tratadas foram comparadas com um valor de P de corte de 0,05 e uma alteração de expressão de 1,5 vezes como valor de corte.Escolhemos usar levedura porque as leveduras são fáceis de cultivar rapidamente, mas também percebemos que a parte mais crítica do trabalho com levedura é, na verdade, criar uma esferoplastia adequada. Uma das coisas que não queremos fazer na microarray é realizar uma digestão incompleta e, consequentemente, esferoplastar apenas células que estejam em fase G1 ou G2/M. E aí você realiza um experimento de microarray com leveduras que estão em uma determinada fase de replicação.Outro ponto complicado que tentamos destacar neste exercício é que o pellet de DNA, do qual as pessoas falam todos os dias, nem sempre é fácil de obter. No nosso módulo, utilizamos tubos especializados e reagentes de visualização. Assim, conseguimos centrifugar o DNA e visualizar o pellet, o que facilita o processo tanto para alunos quanto para professores.De modo que possa ser utilizado em todas as fases do trabalho com DNA e RNA após seu desenvolvimento. Este módulo realmente abriu caminho para que os docentes nas instituições de graduação explorem, possivelmente, outros organismos modelo ou outros regimes de tratamento que possam ser compatíveis com os currículos existentes ou, talvez, com seus próprios interesses de pesquisa. E para lhes dar um exemplo de algumas das modificações realizadas, houve um local que investigou os efeitos do tratamento com herbicida em levedura, outro que analisou o tratamento com LAMP IDE em levedura, enquanto outro local examinou as alterações no desenvolvimento em uma linhagem celular de mamífero na qual tinham particular interesse.E, por último, outro estudo analisou o impacto de diferentes fontes de luz em arabidopsis ou plantas. Após assistir a este vídeo, você deverá ter uma boa compreensão de como montar um experimento de microrrevestimento com estudantes universitários, incluindo o isolamento de RNA total de levedura, a geração de CDNA e a fragmentação de CRNA marcado com biotina. Experiências práticas com tecnologias de alto nível como essa ajudam a reforçar e fortalecer a educação científica em nível universitário.

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Research

JoVE Journal

Biology

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