Microarray Analysis for Saccharomyces cerevisiae

O objetivo geral deste procedimento é apresentar aos estudantes de graduação a tecnologia de microarray, examinando as diferenças de expressão em leveduras submetidas ao estresse oxidativo. Isso é feito isolando primeiro o RNA total de culturas de levedura tratadas com peróxido de hidrogênio e os controles não tratados. A segunda etapa do procedimento é gerar e purificar o CDNA a partir dessas amostras de RNA.

O CDNA é então usado para preparar CRNA marcado com biotina via transcrição in vitro. A etapa final do procedimento é a fragmentação dos CRNAs marcados com biotina para hibridização com os chips de genes de levedura de métricas AFI. Em última análise, podem ser obtidos resultados que mostram as diferenças de expressão nas duas amostras de levedura e, por meio da bioinformática, demonstram o poder da análise de microarray para estudantes de graduação.

A equipe de extensão da Vermont Genetics Network teve a ideia desse método quando foi encarregada de fornecer tecnologia de microraios para estudantes de ciências em todo o estado de Vermont, a fim de aprimorar sua educação científica. Até o momento, esse método foi entregue a vários locais em oito faculdades de bacharelado em todo o estado. Portanto, a principal vantagem de usar microray de módulos de ensino nos dá a capacidade de ensinar técnicas gerais de biologia molecular que são usadas todos os dias em todo o laboratório para um grupo de indivíduos.

E também podemos usar isso para ensinar a alunos e professores e aos nossos grupos. Na verdade, temos alunos e professores trabalhando juntos no mesmo projeto. Eles aprendem certas técnicas que exigem muita sutileza, como manusear RNA, o que não é uma tarefa fácil.

Eles aprendem a precipitar o DNA usando reagentes de visualização. Eles realmente podem usar as técnicas que encontrarão em estudos de pós-graduação ou em laboratórios de biologia molecular do dia a dia. Embora esse método seja adequado para obter informações sobre estresse oxidativo e leveduras, certamente é aplicável a outros organismos modelo e outros sistemas biológicos que você pode querer examinar.

A expressão gênica muda se estiver associada a mudanças no desenvolvimento, toxinas ambientais, estados específicos de doenças e muito mais. Para examinar as diferenças de expressão em leveduras submetidas a estresse oxidativo, o RNA total é primeiro extraído de duas culturas de leveduras por lise enzimática. Uma cultura foi exposta ao estresse oxidativo por um tratamento de uma hora com peróxido de hidrogênio 0,5 milimolar em solução salina tamponada por Hank, enquanto a outra cultura foi tratada apenas com HBSS como controle.

Comece rotulando dois tubos de microcentrífuga de 1,7 mililitro com as informações de identificação apropriadas. Transfira 1,5 mililitros da cultura de levedura apropriada para cada tubo. Centrifugar os tubos a 5 000 Gs durante dois minutos à temperatura ambiente.

Após a centrifugação, use uma micropipeta para remover e descartar cuidadosamente o sobrenadante sem perturbar o pellet. Verifique se o pellet é grande o suficiente antes de continuar com o procedimento. Se o pellet for muito pequeno, adicione 1,5 mililitros de cultura no mesmo tubo que contém o pellet e centrifugue para obter um pellet maior.

Descarte o sobrenadante com uma micropipeta, removendo o máximo possível do líquido do pellet de fermento. Em seguida, adicione 100 microlitros de tampão SG e 30 microlitros de solução de liase ao vórtice de pellets de levedura para misturar. Incube ambos os tubos por 30 minutos em temperatura ambiente durante a incubação.

Agite suavemente cada tubo a cada 10 minutos para gerar placas. Uma das etapas mais críticas quando você está fazendo o revestimento de levedura é certificar-se de que você realmente criou cem por cento de Sphero plast após o tratamento. Isso significa que nem todas as enzimas líticas são criadas iguais.

Portanto, você deve verificar se uma boa enzima lítica está lhe dando um bom revestimento de esferas, o que significa que você deve coletar essas amostras, colocá-las em uma lâmina de microscópio e verificar sob o microscópio adicionando 0,1% de SDS para garantir que você tenha formação de protoplastos. Para observar o revestimento completo do esfera, pipete 10 microlitros da amostra de levedura em uma lâmina de microscópio enquanto examina a amostra ao microscópio a um microlitro de 0,1% SDS para fazer com que as células de levedura inchem e formem esferas ou esferóides perfeitos. É importante observar que as células em brotamento também formam esferóides S.

Se for observada plaqueagem parcial de esferas, recomenda-se um tratamento prolongado com liase. Uma vez que o revestimento completo do sphero tenha sido confirmado em 350 microlitros de tampão BRLT a cada tubo, adicione 250 microlitros de etanol 100%. Certifique-se de que o tubo esteja bem tampado, mantendo a tampa fechada e vortex vigorosamente por um minuto.

Este procedimento irá cortar as placas Sphero. Depois disso, use as colunas de rotação R e Z fácil para coletar e limpar o RNA das duas culturas. Finalmente, avalie a qualidade do RNA extraído usando gel aros pré-moldado a 1,2% para eletroforese para preparar CRNA marcado com biotina.

O RNA total extraído das células de levedura é usado pela primeira vez para sintetizar CD NA por transcrição reversa. Após a geração do CD NA, prepare os tubos de gel de bloqueio de fase para uso em tubos de gel de bloqueio de fase de centrífuga de precipitação CD NA em velocidade máxima por um minuto para garantir que o gel esteja no fundo do tubo. Não faça tubos de bloqueio de fase de vórtice para precipitar CD NA pipete 162 microlitros da camada inferior de uma mistura de fenilclorofórmio tamponada com pH 8.0 tris, álcool isoamílico ou PCI e adicione ao conteúdo de 162 microlitros da segunda fita, tubo de reação de síntese de CD NA, volumes iguais de misturas aquosas e orgânicas são necessários para esta etapa.

Vortex por cinco segundos para misturar o conteúdo. Em seguida, use uma micropipeta para transferir toda a mistura de CD N-A-P-C-I para o tubo de gel de bloqueio de fase. Não faça vórtices na centrífuga do tubo de gel de bloqueio de fase em velocidade máxima por dois minutos.

Em seguida, use uma micropipeta para transferir a camada superior do tubo de gel de bloqueio de fase para um tubo de 1,7 mililitro recém-rotulado. Tente coletar o máximo possível da camada. Adicione o seguinte ao tubo de microcentrífuga de 1,7 mililitro, 405 microlitros de etanol 100%, 80 microlitros de acetato de amônio e um microlitro de vórtice de tinta em pellets.

Coloque brevemente o tubo na centrífuga com a dobradiça do tubo voltada para fora e centrifugue em velocidade máxima por 20 minutos. À temperatura ambiente, quando a centrifugação estiver concluída, remova cuidadosamente o tubo da centrífuga, tomando cuidado para não perturbar o pellet de CD NA. O pellet deve ser rosa por causa da tinta pellet e aproximadamente do tamanho de um grão de sal.

E na lateral do tubo sob a dobradiça, coloque o pellet CD NA no gelo e proceda imediatamente à limpeza do pellet. Para iniciar o procedimento de limpeza do pellet CD NA, use uma micropipeta P 1000 para remover cuidadosamente todo o sobrenadante do tubo. Tenha cuidado para não perturbar o pellet.

É a sua amostra a 500 microlitros de frio, 80% de etanol para o tubo. Tampe suavemente o tubo e inverta-o lentamente várias vezes. Observe seu pellet bem de perto para garantir que ele não se solte da lateral do tubo.

Se o pellet se soltar, você pode colocá-lo de volta no fundo do tubo, colocando o tubo de volta no rack e deixando o pellet assentar no fundo ou centrifugando o tubo em velocidade máxima por 15 segundos. Em seguida, use uma micropipeta P 1000 para remover cuidadosamente o etanol sem perturbar o pellet. Incline o tubo para permitir a remoção do máximo de líquido possível.

Adicione um novo Eloqua de frio, 80% de etanol, tampe o tubo e inverta-o lentamente várias vezes. Depois de remover todo o etanol possível usando uma micropipeta P 1000. Centrifugue o tubo em velocidade máxima por cinco segundos.

Em seguida, use uma micropipeta P 10 para remover os últimos microlitros de etanol sem perturbar o pellet. Coloque o tubo aberto em uma caixa de secagem por 10 a 20 minutos para evaporar o etanol restante. O pellet é facilmente perdido quando está seco, portanto, tome cuidado para manusear o tubo com cuidado e fechar a tampa.

Quando a secagem estiver concluída, visualize o pellet seco para confirmar se ele está presente no tubo. Por fim, ressuspenda o pellet seco em 22 microlitros de água livre de RNA e coloque o tubo no gelo. Este CDNA é então usado para preparar CRNA marcado com biotina por transcrição in vitro usando o kit Enzo BioArray.

Depois que o CRNA marcado com biotina foi limpo e quantificado, ele é fragmentado para preparação do alvo. Uma vez que o CDNA tenha sido gerado, usamos a metodologia de transcrição in vitro padrão para gerar CRNA biotinilado. O CRNA precisa passar por fragmentação antes de poder ser aplicado ao chip de microray.

Para iniciar este procedimento, transfira uma quantidade equivalente a cinco microgramas de CRNA para um tubo de PCR de 0,5 mililitro rotulado. Adicione água livre de RNAs suficientes para elevar o volume total para 16 microlitros e, em seguida, adicione quatro microlitros de cinco tampão de fragmentação ao tubo. O volume total no tubo deve ser de 20 microlitros.

Vortex o tubo e centrifugue por 10 segundos. Em seguida, incube o tubo a 94 graus Celsius por 30 minutos. Em um termociclador, coloque o tubo no gelo após a incubação.

O CRNA fragmentado e não fragmentado de cada amostra é então avaliado por eletroforese usando um gel AROS pré-moldado a 1,2%. Quando a execução é concluída, o gel é visualizado em um transiluminador e uma imagem é adquirida. O produto final da síntese é hibridizado com os chips de genes de levedura átrica e os resultados representativos da análise de microarray são mostrados aqui.

Esta primeira figura é um exemplo de uma imagem digitalizada do chip do gene da levedura atrics gerada pelo software operacional do chip do gene atrics. Este é um gráfico de dispersão 2D de todos os transcritos genéticos, cerca de 6.700 genes comparando dados de levedura de controle e tratada. Cada ponto representa um único gene.

Os genes coloridos em roxo indicam genes que são diferencialmente expressos, enquanto os genes coloridos em vermelho não são. Neste exemplo, a maioria dos genes diferencialmente expressos são aqueles envolvidos no controle do ciclo celular, conforme indicado por suas descrições. Este fluxograma do banco de dados para visualização de anotações e descoberta integrada ilustra genes diferencialmente expressos em uma via biológica afetada.

Os genes indicados com uma estrela vermelha indicam os genes regulados negativamente na via miótica. Finalmente, os resultados representativos de um gráfico de vulcão gerado usando o software de peneira de genes de espécies geográficas são mostrados aqui. As amostras controle e tratadas foram comparadas com um ponto de corte de valor de P de 0,05 e um ponto de corte de mudança de expressão de 1,5 vezes.

Escolhemos usar fermento porque o fermento é fácil de cultivar rapidamente, mas também percebemos que a parte mais crítica de trabalhar com fermento é, na verdade, criar um revestimento de sphero decente. Uma das coisas que não queremos fazer no microarray é realmente fazer uma digestão incompleta e, na verdade, apenas células sphero plast que estão em uma fase G um ou G dois M. E então você está fazendo um experimento de microarray em leveduras que estão em uma certa fase de replicação.

Outro ponto complicado que tentamos trazer para casa neste exercício é que as pessoas falam sobre peletização de CD NA todos os dias, mas não é necessariamente fácil. E o que fizemos em nosso módulo foi realmente usar tubos especializados e reagentes de visualização. Assim, podemos realmente reduzir o DNA e você pode visualizar a apelação, o que torna mais fácil para alunos e professores.

Para que possa ser usado em todas as fases do trabalho de DNA e RNA após seu desenvolvimento. Este módulo realmente abriu o caminho para o corpo docente dos institutos de bacharelado explorarem, possivelmente olhando para outros organismos modelo ou outros regimes de tratamento que podem ser compatíveis com os currículos existentes ou possivelmente com seus próprios interesses de pesquisa. E para dar um exemplo de algumas das modificações que foram feitas, havia um site que analisou os efeitos do tratamento com herbicidas em leveduras ou outro que analisou o tratamento LAMP IDE em leveduras, enquanto outro site analisou as mudanças de desenvolvimento em uma linhagem celular de mamíferos nas quais eles estavam particularmente interessados.

E, por último, outro local analisou o impacto de fontes de luz diferenciais em arabidopsis ou plantas. Depois de assistir a este vídeo, você deve ter uma boa compreensão de como configurar um experimento de microraios com estudantes de graduação em ciências, incluindo o isolamento do RNA total da levedura, a geração de CDNA e a fragmentação do CRNA marcado com biotina. Experiências práticas com essas tecnologias de alto nível ajudam a reforçar e fortalecer o ensino de ciências de graduação.