Um método HPLC-QQQ-MS eficiente e rápido para a quantificação de alcaloides tropanos em plantas medicinais

Desenvolvemos um método HPLC-QQQ-MS para quantificar rapidamente três principais alcaloides tropanos em Anisodus tanguticus. O HPLC convencional não apresenta sensibilidade para alcaloides de tropanos. Esse método utiliza espectrometria de massa altamente sensível para resolver esse problema.

Para começar, pese com precisão 10,0 miligramas de padrões de referência de hiosciamina, hidrobrometo de anisodamina e escopolamina hidrobrometo. Coloque-as em um frasco volumétrico separado de 10 mililitros. Adicione metanol de grau cromatográfico à linha marcada em cada frasco volumétrico.

Dissolva os padrões completamente com tratamento ultrassônico para preparar soluções padrão únicas com concentração de 1,0 miligrama por mililitro. Depois, transfira as soluções de estoque para frascos de reagente marrom e armazene-as a quatro graus Celsius no escuro. Para preparar uma solução intermediária padrão mista de 10 microgramas por mililitro, pipete 100 microlitros de cada solução de estoque previamente preparada em um frasco volumétrico de 10 mililitros.

Depois, adicione metanol de grau cromatográfico à linha marcada para diluir a solução. Em seguida, faça a liofilização do material fresco de Sophora flavescens. Depois, usando um moedor de alta velocidade, pulverize o material seco até formar um pó homogêneo.

Peneira a pólvora por um peneirado padrão de 0,25 milímetros. Pesar com precisão 20 miligramas do pó peneirado. Transfira para um frasco volumétrico de 100 mililitros e adicione metanol de grau cromatográfico logo abaixo da linha marcada.

Em seguida, realize extração ultrassônica em temperatura ambiente por 30 minutos. Depois, retire o frasco volumétrico e deixe esfriar até 25 graus Celsius em temperatura ambiente. Adicione metanol de grau cromatográfico à linha marcada de 100 mililitros e vórtice para misturar por dois minutos.

Depois, pipete um mililitro do extrato preparado em um frasco volumétrico de 100 mililitros. Adicione metanol à linha marcada. Agite bem para misturar bem e obtenha a solução mãe para a injeção de HPLC.

Para filtragem por amostra, prepare uma seringa descartável sem agulha de um mililitro e uma membrana microporosa em fase orgânica de 0,22 micrômetro. Aspire 1,2 mililitros da solução mãe para injeção na seringa e filtre a solução empurrando-a lentamente pela membrana. Colete o filtrado em um frasco de amostra de dois mililitros com um inserto interno e fele o frasco firmemente com uma tamponha.

Prepare a fase móvel A medindo 1000 mililitros de água ultrapura. Adicione 1,0 mililitro de ácido fórmico de grau cromatográfico e misture uniformemente usando um agitador magnético por 10 minutos. Em seguida, prepare a fase B móvel utilizando metanol de grau cromatográfico diretamente, sem tratamento adicional.

Desgasifica as fases móveis A e B a 40 quilohertz por 15 minutos usando unidades de desgaseificação ultrassônica separadas. Conecte as fases móveis desgaseificadas em frascos de solvente separados às linhas A e B correspondentes do sistema HPLC. Use uma coluna C18 para separação cromatográfica.

Equilibre a coluna com metanol e água em uma proporção de 80 a 20 por 30 minutos com vazão de 0,3 mililitros por minuto. Ajuste a temperatura do forno em coluna para 30 graus Celsius e pré-aqueça com 10 minutos de antecedência. Depois, ajuste a vazão para 0,60 mililitros por minuto, o volume de injeção para dois microlitros e o comprimento de onda de detecção para 210 nanômetros.

Depois disso, defina o programa de elução de gradiente com as condições apresentadas. Realizar detecção por espectrometria de massa usando um espectrômetro de massa quadrupolo triplo equipado com uma fonte de ionização por eletrospray operando em modo de ionização positiva. Ajuste a pressão do nebulizador para 15 libras por polegada quadrada, a tensão capilar para 4.000 volts, a temperatura do gás para 300 graus Celsius e o fluxo de gás para 11 litros por minuto.

Depois, defina os parâmetros para múltiplos pares de íons de monitoramento de reação. Para identificar íons precursores, infunde diretamente soluções padrão individuais no modo de varredura MS2. Após a validação do método, realize a aquisição de dados em modo de monitoramento de múltiplas reações.

Use os parâmetros otimizados, incluindo íons precursores, transições iônicas de produto, tensão do fragmentador e energia de colisão para cada analito conforme apresentado aqui. Inicie o software de análise qualitativa. Selecione o arquivo e escolha importar dados para importar todos os arquivos coletados.

Verifique a simetria de pico e a consistência do tempo de retenção dos picos alvo em cada cromatógrama de íons extraído. No módulo de quantificação, selecione a transição MRM. Insira os pares de íons precursores e íons produto para cada componente e extraia os cromatogramas iônicos extraídos correspondentes.

Calcule a área máxima para análise quantitativa. Todos os três alcaloides tropanos alvo foram separados com sucesso em 20 minutos sob as condições otimizadas do HPLC. A resolução entre escopolamina e anisodamina foi de 8,67.

Enquanto o valor entre anisodamina e hiosciamina atingiu 11,58, todos os valores de resolução excederam significativamente o critério de separação de base de 1,5. Todos os analitos apresentaram boa linearidade em uma faixa de concentração de 0,014 a 0,320 microgramas por mililitro, com coeficientes de correlação maiores que 0,99. As recuperações médias foram 101,44% para escopolamina, 100,25% para anisodamina e 99,56% para hiosciamina, com desvios padrão relativos de 1,85%, 2,35% e 1,9%, respectivamente.

A quantificação de três alcaloides de tropanos em 10 amostras de Anisodus tanguticus mostrou que o teor de escopolamina variou de 0,3667 miligramas por grama na amostra seis a 1,0356 miligramas por grama na amostra sete. O teor de anisodamina variou de 0,0269 miligramas por grama na amostra seis a 0,3590 miligramas por grama na amostra 10. O teor de hiosciamina variou de 0,2930 miligramas por grama na amostra dois a 1,4989 miligramas por grama na amostra 10, com níveis mais altos observados nas amostras quatro, sete, nove e décimana.

Esse protocolo permite a quantificação rápida e precisa de três alcaloides principais de tropanos. O principal desafio é garantir o procedimento dos instrumentos e a preparação padronizada da amostra para medições precisas. Esse método pode ser estendido para explorar e quantificar outros metabólitos em Anisodus tanguticus.