Visualização e Quantificação do Pareamento de Bases de RNA Intermolecular em Clusters de RNA in vitro usando repórteres de RNA de brócolis divididos

Aplicamos o ensaio repórter de RNA de brócolis dividido para detectar e quantificar o pareamento intermolecular de bases em clusters de RNA in vitro. Sondagem química e simulações sugerem interações com RNA, mas não podem medi-las diretamente. Esse protocolo permite uma avaliação direta e precisa dentro dos clusters de RNA.

Após preparar os moldes de DNA para transcrição in vitro de RNA, limpe a superfície de trabalho, os suportes de tubos e as pipetas com solução de descontaminação de ribonuclease. Use ponteiras filtradas sem ribonuclease para todas as etapas da pipeteação. Descongele o tampão de reação e as soluções de nucleotídeos fornecidos com o kit de transcrição junto com uridina trifosfato Cianina 5, ou UTP-Cy5, em gelo.

Centrifuge todos os tubos a 2.000g por dois segundos antes do uso. Depois, calcule o número de bases de timina no DNA. Determinar os volumes necessários de UTP e UTP-Cy5 para uma reação de transcrição de 20 microlitros, mantendo uma densidade consistente de marcação entre as espécies de RNA.

Em seguida, prepare uma reação de transcrição de 20 microlitros combinando os reagentes apresentados. Misture bem pipetando para cima e para baixo e centrifuge a 2.000g por dois segundos. Após incubar a reação a 37 graus Celsius por seis horas, adicione um microlitro de desoxirribonuclease fornecida com o kit, misture cuidadosamente por pipeteamento e centrifuge novamente.

Depois, incube a 37 graus Celsius por mais 15 minutos. Transfira a reação para um tubo de 1,5 mililitro. Adicione 115 microlitros de água sem nuclease e 15 microlitros de solução de parada de acetato de amônio fornecida com o kit.

Após a mistura, centrifuge a solução a 2.000g por dois segundos. Em seguida, adicione 150 microlitros de fenol clorofórmio ao tubo e misture delicadamente para combinar as fases. Centrifuge a 16.000g por 10 minutos a quatro graus Celsius.

Depois, transfira a fase aquosa superior para um novo tubo. Adicione um volume igual de clorofórmio à solução transferida e misture cuidadosamente para garantir a interação de fase adequada. Agora centrifuge a 16.000g por dois minutos a quatro graus Celsius e repita o processo de separação de fases mais uma vez.

Depois, transfere a camada aquosa de aproximadamente 100 a 150 microlitros para um novo tubo. Adicione 900 microlitros de isopropanol e misture bem. Após aliquotar a solução em tubos separados, armazene as amostras a menos 20 graus Celsius durante a noite ou até um mês.

Centrifuge a amostra de RNA em isopropanol a 16.000g por 15 minutos a quatro graus Celsius. Remova cuidadosamente o isopropanol sem perturbar o pellet de RNA. Depois, adicione um mililitro de etanol 70% preparado em água sem nuclease ao pellet.

Centrifuge a 16.000g por dois minutos a quatro graus Celsius. Após remover o etanol, adicione um mililitro de etanol a 70% preparado em água sem nuclease ao tubo e repita a centrifugação. Durante a lavagem final com etanol, remova a maior parte do etanol usando uma pipeta de 1.000 microlitros.

Centrifuge brevemente a 2.000g por dois segundos em uma mini centrífuga de bancada e remova qualquer etanol restante usando uma pipeta de 20 microlitros. Uma vez seco o pellet de RNA, ressuspenda-o em 20 microlitros de água sem nuclease. Mantenha a amostra no gelo e proteja-a da luz.

Usando um espectrofotômetro de microvolume, meça a concentração e pureza do RNA. Certifique-se de que a razão de absorção em 260 por 280 nanômetros seja aproximadamente 2,0 e a razão em 260 por 230 nanômetros seja maior que 2,0. Descongele um tubo de solução de espermina de 100 milimolares e 50% de polietilenoglicol 8.000 em gelo.

Prepare recentemente um buffer de redobragem de RNA 10X combinando os componentes mostrados. Após misturar cuidadosamente os componentes por pipetagem, centrifuge a 2.000g por dois segundos em uma mini centrífuga de bancada. Para a condição de co-dobramento, em um tubo PCR de 200 microlitros, combine RNA transcrito in vitro contendo sequência superior ou inferior, buffer de refolding de RNA e água livre de nuclease.

Misture bem pipetando para cima e para baixo e centrifuge, como demonstrado anteriormente. Aqueça a amostra a 90 graus Celsius por dois minutos. Transfira imediatamente a amostra para a temperatura ambiente.

Proteja-se da luz e incube por uma hora. Para a condição de dobragem separada, aqueça a amostra de RNA em um tubo de PCR de 200 microlitros e depois coloque imediatamente sobre gelo por pelo menos 15 minutos. Em um tubo de PCR de 200 microlitros, combine RNA transcrito in vitro contendo sequência superior ou inferior, buffer de refolding de RNA 10 vezes e água livre de nuclease.

Incube a reação em temperatura ambiente por 30 minutos, protegido da luz. Agora combine as amostras de RNA contendo as sequências superior e inferior em um único tubo de PCR e misture cuidadosamente pipetando para cima e para baixo. Centrifuge a 2.000g por dois segundos em uma mini centrífuga de bancada.

Incube em temperatura ambiente por 30 minutos. Para ambas as condições, adicione seis microlitros de um a dois pré-misturas de 100 milimolares de espertina e 50% de polietilenoglicol 8.000. Após misturar o conteúdo, centrifuge a 2.000g por dois segundos em uma mini centrífuga de bancada.

Agora misture dois microlitros de um milimolar DFHBI-1T na reação e centrifuge novamente. Coloque a reação em um vidro com câmara de tambor. Incube a câmara em temperatura ambiente por quatro horas no escuro, com a tampa para minimizar a evaporação.

Coloque o vidro com cobertura em câmara no palco do microscópio. Ligue o laser e use as oculares para localizar e focar na amostra. Configure o microscópio para capturar cada região de interesse com o canal de cianina 5 primeiro em cada plano Z.

Depois, imageie a mesma região de interesse usando o canal fluorescente verde da proteína. Defina o tempo de exposição para 500 milissegundos para todos os canais. Depois, ajuste a potência do laser para 80% para o canal fluorescente verde da proteína e 40% para o canal 5 de cianina.

Usando um passo Z de 150 nanômetros, imagine uma região de deslizamento de cobertura fora da gota de reação em temperatura ambiente. Depois, quantifique o pareamento de bases intermoleculares usando software de análise de imagem. Após a indução do agrupamento de RNA, ambos os RNAs formaram agrupamentos, seja individualmente ou juntos.

A fluorescência do DFHBI-1T dentro dos clusters de RNA foi substancialmente menor apenas para RNAs superiores ou inferiores em comparação com a condição de co-dobramento. Na condição de dobramento separado, o sinal normalizado do DFHBI-1T foi 0,031, comparável aos níveis de referência observados apenas no topo ou no fundo. Shu-top, shu-bottom, shu-anti-top e shu-anti-bottom apresentaram individualmente fluorescência mínima de DFHBI-1T.

A co-dobragem do shu-top com o shu-bottom ou do shu-anti-top com o shu-anti-bottom produzia um sinal DFHBI-1T mais alto do que o dobramento separado. O co-dobramento do shu-top e do shu-bottom resultou em um aumento de 5,63 vezes na fluorescência normalizada do DFHBI-1T. O dobramento separado do shu-top e do shu-bottom mostrou apenas um aumento de 1,04 vezes comparável aos níveis base.

Shu-top misturado com shu-anti-bottom e shu-anti-top misturado com shu-bottom apresentou maior fluorescência DFHBI-1T do que pares de mesma orientação em ambas as condições de dobramento. O co-dobramento do shu-top com shu-anti-bottom e shu-anti-top com shu-bottom resultou em aumentos de 61,86 e 82,60 vezes na fluorescência do DFHBI-1T, respectivamente. O dobramento separado desses pares mistos resultou em aumentos menores, de 2,69 e 4,94 vezes, respectivamente.

A consideração mais importante é que a geração robusta de sinais pode exigir reagentes de aglomeração, enquanto a sensibilidade depende da dimerização eficiente e do dobramento dos RNAs de brócolis divididos. Este ensaio complementa abordagens de puxão de RNA para baixo e eletroforese em gel para estudar o pareamento intermolecular de bases em aglomerados de RNA. Este ensaio pode examinar os efeitos de sequências de RNA, helicases e íons sobre o pareamento intermolecular de bases dentro de aglomerados de RNA.