Método de Interação DNA-DNA de Cromatina Associada a RNA
30 de abril de 2026
Aqui, apresentamos um protocolo para capturar as interações DNA-DNA de cromatina associadas ao RNA para mapear a organização do genoma tridimensional relacionada ao RNA.
Desenvolvemos o método de interação DNA-DNA de cromatina associado a RNA, ou método RDD, para mapear o contato com cromatina organizado por moléculas específicas de RNA. A RDD mapeia robustamente a faixa de faixas específicas de RNA e a interação de longo alcance entre RNAs endógenos e exógenos. Para começar, ressuspenda o pellet de núcleos permeabilizados derivado de células duplas reticuladas de Drosophila S2 em 15 mililitros de tampão de lise 0,1% FA contendo Triton X-100.
Aliquota 1,5 mililitro da suspensão nuclear em um tubo de ensaio de fundo redondo de 14 mililitros, evitando a formação de bolhas. Sonice a suspensão com uma amplitude de 38% por 4,5 minutos usando ciclos de 30 segundos ligado e desligado de 30 segundos. Colete a cromatina sonicada em um tubo de 15 mililitros e centrifuge a 3.200g por 20 minutos em temperatura ambiente.
Transfira aproximadamente 13 mililitros do sobrenadante para um novo tubo de 15 mililitros. Agora, adicione 100 microlitros de esferas preparadas de estreptavidina C1 no tubo contendo cromatina sonicada e gire por 20 minutos em temperatura ambiente. Depois, coloque o tubo em um suporte magnético por um minuto e transfira o sobrenadante contendo a cromatina pré-liberada para um novo tubo de 50 mililitros.
Armazene uma alíquota de 10 microlitros a menos 20 graus Celsius para análise. Incube 26 mililitros de tampão de hibridização recém-preparado com 13 mililitros de cromatina pré-limpa em um rotador por 30 minutos à temperatura ambiente. Em seguida, aliquota a mistura de hibridização em três tubos de 15 mililitros e adicione seis microlitros de sondas biotiniladas de 100 micromolares a cada amostra.
Após selar as tampas dos tubos com filme, gire os tubos a 37 graus Celsius durante a noite. Após bloquear as esferas de estreptavidina C1, remova o tampão bloqueador e resuspenda as esferas em 400 microlitros de tampão de hibridização. Agora, adicione as esferas de estreptavidina C1 tratadas com tampão bloqueante à cromatina hibridizada correspondente preparada anteriormente.
Gire a mistura por 2,5 horas em temperatura ambiente. Após descartar o sobrenadante e transferir as esferas para um tubo de 1,5 mililitro, lave as esferas cinco vezes com 800 microlitros de tampão de lavagem e depois duas vezes com tampão TE. Após a lavagem final, descarte o sobrenadante e ressuspenda as esferas em 1.000 microlitros de tampão TE contendo 1X inibidor de protease em temperatura ambiente.
Para bloquear os sítios desocupados nas esferas de estreptavidina C1 ligadas ao complexo sonda-cromatina, adicione 220 microlitros de IPB desnaturado às esferas e gire o tubo em temperatura ambiente por 15 minutos. Após a incubação, lave as esferas de estreptavidina C1 cinco vezes usando o tampão TE. Em seguida, adicione 693 microlitros de mistura de reparo final à cromatina nas esferas de estreptavidina C1 e misture bem.
Depois, adicione sete microlitros de DNA polimerase T4. Incube a mistura em um termomisturador a 800 rotações por minuto e 12 graus Celsius por 30 minutos. Depois, incube a amostra em uma batedeira a 16 graus Celsius por 15 minutos.
Lave as esferas três vezes com 800 microlitros de tampão ChIA-PET gelado e depois uma vez com tampão TE. Depois, adicione 693 microlitros de mistura A-tailing à cromatina das contas de estreptavidina C1 e misture bem. Em seguida, adicione sete microlitros do fragmento de Klenow três primos para cinco primos da exonuclease negativa.
Incube o tubo em uma batedeira a 12 rotações por minuto e a 37 graus Celsius por 50 minutos. Lave as esferas três vezes com 800 microlitros de tampão ChIA-PET gelado e depois uma vez com tampão de elução pipetando suavemente. Agora, adicione 1.390 microlitros de mistura de ligadura de proximidade à cromatina em esferas de estreptavidina C1 e incube em uma batedeira em temperatura ambiente por cinco minutos.
Adicione 10 microlitros de ligase de DNA T4 à mistura e incube com rotação a 20 rotações por minuto em temperatura ambiente por cinco minutos, depois mude para 12 rotações por minuto em temperatura ambiente por 50 minutos e continue a incubação a 16 graus Celsius durante a noite. Em seguida, lave as esferas três vezes com 800 microlitros de tampão ChIA-PET gelado e depois duas vezes com tampão TE. Para liberar cromatina, adicione 480 microlitros de tampão de elução LC ChIP à cromatina nas esferas de estreptavidina C1 e misture bem.
Adicione 20 microlitros de 20 miligramas por mililitro de proteinase K para descruzar a reticulação. Incube o tubo em um termomisturador a 950 rotações por minuto e 65 graus Celsius durante a noite, depois purifique o DNA ligado por proximidade usando um reagente fenol:clorofórmio:isoamil. Adicione todos os componentes necessários para o teste de marcação Tn5 em um volume total de reação de 50 microlitros em um tubo PCR sobre gelo.
Incube a reação de marcação a 55 graus Celsius por 10 minutos em um termociclador com a tampa ajustada a 70 graus Celsius, e então mantenha a quatro graus Celsius. Adicione 50 microlitros de tampão de elução ChIP e um micrôlitro de proteinase K ao DNA marcado. Misture a solução e incube em um termomisturador a 65 graus Celsius e 900 voltas por minuto durante 30 minutos.
Purifique o DNA usando um kit de purificação de DNA e quantifique o DNA usando um sistema automático de eletroforese capilar. Adicione todo o DNA fragmentado e ligado a esferas M280 pré-bloqueadas com tampão bloqueante e DNA genômico e misture a suspensão. Gire o tubo na batedeira em temperatura ambiente por 45 minutos.
Após uma breve volta, coloque o tubo em um suporte magnético e descarte o sobrenadante. Seguindo as etapas de lavagem, adicione 30 microlitros de tampão de elução às esferas sem misturar. Prepare a mistura de PCR de acordo com o kit de preparação da biblioteca de DNA.
Transfira os tubos de PCR para uma máquina de PCR e configure o programa de amplificação. Por fim, após purificar o produto de PCR usando esferas magnéticas, meça de 10 a 30 nanogramas de DNA de biblioteca usando um quantificador de ácidos nucleicos para preparar a amostra para sequenciamento. Fragmentos de cromatina sonicada variaram de aproximadamente 1.000 a 3.000 pares de bases, indicando fragmentação bem-sucedida.
A cromatina associada ao RNA apresentou uma variação de tamanho de fragmentos de aproximadamente 1.000 a 3.000 pares de bases. A cromatina marcada com Tn5 mostrou uma distribuição de fragmentos indicativa da eficiência da marcação da cromatina. A biblioteca de sequenciamento após a amplificação apresentou uma distribuição do tamanho dos fragmentos variando de aproximadamente 180 a 1.000 pares de bases.
Após a seleção de tamanho, os fragmentos da biblioteca de sequenciamento foram predominantemente enriquecidos na faixa de aproximadamente 250 a 600 pares de bases. A interação DNA-DNA de cromatina associada a RNA, ou método RDD, detectou as localizações genômicas da ligação RNA NC roX2 e 7SK, juntamente com os respectivos loops de interação remota da cromatina. Dados da RNA polimerase II ChIA-PET revelam uma clara relação regulatória entre esses RNAs NC e a expressão gênica, com picos indicando força de interação.
A análise multidimensional foi realizada integrando interações ancoradas em RDD com mapas de conformação de cromatina em todo o genoma do Hi-C e marcas epigenômicas, transcrição nascente e dados da RNA polimerase II ChIA-PET. Nessas regiões, domínios topologicamente associados foram claramente visualizados, com laços de cromatina guiados por RNA frequentemente situados em seus limites ou abrangendo múltiplos desses domínios. Além disso, foram determinados os centros reguladores centrados no RNA.
Método RDD e interações de cromatina ancorada revelando sítios de ligação de RNA e interações DNA-DNA associadas na organização do genoma 3D. Ensinamentos-chave são manter as proporções adequadas de sonda, ligador e cromatina e bloquear sítios ilimitados de estreptavidina com a biotina natural antes da ligação da polimerase. Estudos futuros podem explorar como o RNA enrola dinamicamente as interações da cromatina através do desenvolvimento, perturbações e infecções.
Visão Geral
O Método de Interação DNA-DNA da Cromatina Associada a RNA (RDD) é uma abordagem direcionada para mapear interações da cromatina ancoradas por RNAs específicos. Esta técnica permite a identificação simultânea de locos genômicos associados a um RNA alvo e a resolução de contatos de longo alcance entre DNA-DNA nesses locos, fornecendo insights sobre a organização espacial do genoma e mecanismos regulatórios.
Principais Componentes do Estudo
Área de Ciência
- Genômica
- Epigenética
- Biologia Molecular
Contexto
- As interações da cromatina desempenham um papel crucial na regulação gênica e na arquitetura do genoma.
- Os RNAs, incluindo tipos codificantes e não codificantes, podem organizar a cromatina e influenciar a expressão gênica.
- Os métodos existentes frequentemente carecem da capacidade de mapear interações da cromatina ancoradas especificamente por RNAs.
- Compreender a organização da cromatina mediada por RNA é essencial para dissecar redes regulatórias.
Objetivo do Estudo
- Desenvolver um método robusto para mapear interações da cromatina ancoradas por RNAs específicos.
- Permitir a identificação de alta resolução de loci genômicos associados a RNA e seus contatos espaciais.
- Facilitar o estudo do pareamento entre enhancer-promotor e da regulação gênica de longo alcance mediada por RNAs.
Métodos Utilizados
- Uso de sondas antissenso biotiniladas complementares ao RNA alvo para enriquecimento de complexos RNA-cromatina.
- Reticulação celular, fragmentação da cromatina e reparo de extremidades.
- Ligação por proximidade utilizando um ligante projetado para unir fragmentos de DNA adjacentes espacialmente dentro dos complexos capturados.
- Purificação dos produtos de ligação, preparação da biblioteca de sequenciamento e sequenciamento de alto rendimento.
- Análise bioinformática para gerar mapas de interação da cromatina ancorados no RNA.
Resultados Principais
- RDD permite o mapeamento de alta resolução e específico para o locus de contatos da cromatina ancorados por RNAs.
- O método é aplicável a RNAs endógenos e exógenos, incluindo aqueles provenientes de vírus e microrganismos.
- RDD é compatível com diversos tipos celulares e condições experimentais.
- O fluxo de trabalho é robusto e reprodutível, gerando perfis detalhados de contatos para estudos regulatórios.
Conclusões
- RDD fornece uma ferramenta poderosa para dissecar a arquitetura tridimensional do genoma associada a RNAs regulatórios.
- O método aprofunda a compreensão de como os RNAs organizam a cromatina e regulam a expressão gênica.
- RDD é amplamente aplicável para o estudo de interações entre enhancers e promotores e regulação genômica de longo alcance.
Perguntas Frequentes
Relevância Executiva para a Indústria
O Método de Interação DNA-DNA Associado à Cromatina (RDD, na sigla em inglês) permite que equipes de P&D da indústria biofarmacêutica mapeiem interações cromatínicas ancoradas por RNAs específicos, fornecendo uma visão de alta resolução da arquitetura regulatória do genoma. Essa capacidade apoia a desmistificação mecanicista e a validação de alvos em estágios iniciais de descoberta e em pontos pré-clínicos críticos, especialmente para vias regulatórias mediadas por RNA. A compatibilidade do RDD com diversos tipos celulares e com RNAs endógenos e exógenos aumenta sua relevância para modelos de doenças complexas e estudos de interação entre hospedeiro e patógeno.
Aplicações Estratégicas em P&D de Biofármacos
Descoberta Inicial e Validação de Alvo
- Permite a investigação de mecanismos regulatórios mediados por RNA e da organização espacial do genoma.
- Apóia a validação funcional de alvos por meio da identificação de contatos da cromatina associados ao RNA.
- Facilita a redução de riscos mecanicistas para alvos que modificam RNA e cromatina.
- Fornece dados específicos de locus para embasar a confiança preditiva na seleção de alvos.
Triagem e Desenvolvimento de Ensaios
- Prepara mapas validados de interações da cromatina para fluxos de trabalho de triagem downstream.
- Fornece perfis de contato reprodutíveis e quantitativos para padronização de ensaios.
- Permite a reutilização da plataforma em alvos de RNA codificantes e não codificantes.
- Apoia a avaliação confiável de compostos que afetam interações entre RNA e cromatina.
Pesquisa Translacional e Pré-clínica
- Alinha-se a sistemas relevantes para doenças ao mapear interações de RNA regulatórios em diversos tipos celulares.
- Oferece continuidade do descobrimento até a validação pré-clínica de vias mediadas por RNA.
- Permite decisões de avanço ajustadas ao risco para terapêuticas direcionadas ao RNA.
- Apoia a identificação de biomarcadores por meio de perfis de contato de cromatina de alta resolução.
Integração de Pipeline e Fluxo de Trabalho
A RDD integra-se ao continuum de descoberta, desde estudos mecanicistas iniciais até a validação em modelos pré-clínicos, apoiando tanto a identificação de alvos quanto a pesquisa translacional.
- Biologia da Descoberta: Revela interações de cromatina ancoradas em RNA para esclarecer vias regulatórias e reduzir riscos em hipóteses biológicas.
- Triagem: Fornece mapas de contato quantitativos e reprodutíveis para o desenvolvimento de ensaios e triagem de compostos.
- Análises: Gera dados de sequenciamento de alta resolução para análise comparativa de contatos de cromatina entre diferentes condições.
- Pesquisa Translacional: Permite o mapeamento de interações de RNA relevantes para doenças em sistemas primários ou modelos.
- Reutilização Empresarial: Oferece um fluxo de trabalho robusto e adaptável para diversas aplicações em pesquisas de RNA e cromatina.
Impacto Operacional e Empresarial
- Valor Científico: Aumenta a confiança preditiva e reduz a ambiguidade mecanicista na regulação mediada por RNA.
- Valor Operacional: Fornece mapeamento padronizado, escalável e reprodutível de interações da cromatina.
- Valor Estratégico: Melhora as decisões de prosseguir ou não prosseguir e a eficiência do capital ao esclarecer mecanismos regulatórios precocemente.
- Impacto na Carteira: Apoia a priorização ajustada ao risco de alvos que modificam RNA e cromatina.
Considerações de Implementação
- Exige experiência em biologia da cromatina, bioquímica de RNA e sequenciamento de nova geração.
- Requer acesso a infraestrutura de sequenciamento de alto rendimento e bioinformática.
- Exige padronização entre equipes para o design de sondas e análise de dados.
- Adaptável a diversos tipos celulares e condições experimentais mediante otimização do protocolo.
- Depende da especificidade das sondas e da profundidade de sequenciamento para resolução e reprodutibilidade.
Perguntas Frequentes sobre Biotecnologia Farmacêutica
Chapters in this video
0:00
Introduction
0:25
Chromatin Fragmentation and Preclearing with Streptavidin C1 Beads
1:51
Chromatin-RNA Probe Hybridization and Immobilization on Streptavidin C1 Beads
3:42
On-Bead Chromatin End-Repair and A-Tailing
4:59
Chromatin Proximity Ligation and Release from the Streptavidin C1 Beads
6:22
Tn5 Tagmentation of Proximity-Ligated DNA
7:19
Immobilization and PCR Amplification of Ligated DNA on M280 Beads
8:23
Results
10:18
Conclusion
