Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

Высокоэффективная жидкостная хроматография, или ВЭЖХ, является очень универсальным методом, который разделяет компоненты жидкой смеси на основе их различных взаимодействий со стационарной фазой.

ВЭЖХ – это адаптация колоночной хроматографии. При колоночной хроматографии колонка заполняется микрогранулами, называемыми стационарной фазой. Шарики неподвижной фазы функционализированы химическими группами, которые индуцируют взаимодействие между шариком и компонентами смеси, находящимися в жидкой, или подвижной фазе. По мере того, как смесь протекает через колонну, компоненты по-разному взаимодействуют со стационарной фазой.

В ВЭЖХ колоночная хроматография выполняется при более высокой скорости потока и, следовательно, более высоком давлении, чем классическая колоночная хроматография. Это позволяет использовать шарики неподвижной фазы меньшего размера с большим отношением площади поверхности к объему, что значительно увеличивает взаимодействие неподвижной фазы и компонентов в подвижной фазе.

В этом видео мы познакомим с основами работы ВЭЖХ, продемонстрировав разделение компонентов различных диетических газированных напитков.

В лабораторных условиях используются два типа ВЭЖХ: аналитические и препаративные. В аналитической ВЭЖХ прибор используется для идентификации компонентов небольшого объема, а анализируемый образец затем отбраковывается как отходы. В препаративной ВЭЖХ инструмент используется для очистки смеси, и нужное количество каждого компонента собирается во фракции.

Контрольно-измерительные приборы ВЭЖХ состоят из ряда простых компонентов. Во-первых, подвижная фаза, содержащаяся в резервуарах с растворителем, прокачивается через систему одним или несколькими насосами с постоянным расходом. Образец впрыскивается в подвижный фазовый поток с помощью инжектора образца. Образец, разбавленный подвижной фазой, затем подается в колонну ВЭЖХ, где отделяются компоненты образца. Затем компоненты анализируются детектором и либо сохраняются в виде фракций для последующего использования, либо переносятся в бутылку для отходов.

Колонна ВЭЖХ является ключевым компонентом системы. Он состоит из металлического или пластикового цилиндра, наполненного микрогранулами неподвижной фазы или хроматографической смолой. Смесь образцов протекает через слой упакованных частиц с постоянной скоростью потока, и каждый компонент взаимодействует со стационарной фазой при прохождении мимо.

Соединения по-разному взаимодействуют со стационарной фазой, и поэтому проходят вниз по длине колонки к детектору с разной скоростью. Время, необходимое для выхода компонента из колонны или элюирования, называется временем удержания. Результатом является график зависимости времени удержания от интенсивности, или хроматограмма. Время хранения используется для идентификации компонента. Размер пика, в частности, площадь под пиком, используется для количественной оценки количества соединения в исходном растворе.

Выбор стационарной фазы зависит от свойств компонентов в смеси образцов. Наиболее часто используемой стационарной фазой являются гранулы диоксида кремния, так как они представляют собой инертный неполярный материал, который образует микроразмерные гранулы и обеспечивает достаточную плотность упаковки. Наиболее распространенным типом ВЭЖХ является обратимо-фазовая хроматография, в которой используется гидрофобная стационарная фаза, обычно гранулы диоксида кремния с цепями C18, связанными с поверхностью гранул. Компоненты элюируются в порядке убывания полярности.

Подвижная фаза, используемая в обращенно-фазовой хроматографии, обычно представляет собой смесь воды и органического растворителя, такого как ацетонитрил. В зависимости от образца, подвижной фазой может оставаться постоянное соотношение воды и органического растворителя, известное как изократический режим. Тем не менее, это может привести к широким пикам в случае высокого содержания воды или перекрывающимся пикам в случае высокого содержания органических веществ.

Подвижное фазовое соотношение также может изменяться линейно или ступенчато во время разделения для создания подвижного фазового градиента. Градиентное элюирование может предотвратить уширение пика менее полярных компонентов, тем самым улучшая разделение и сокращая время элюирования.

Теперь, когда основы ВЭЖХ изложены, метод ВЭЖХ будет продемонстрирован в лаборатории. В этом эксперименте ВЭЖХ будет использоваться для разделения и количественного определения трех распространенных компонентов диетической газировки.

Во-первых, чтобы приготовить подвижную фазу, добавьте 400 мл ацетонитрила к 1,5 л очищенной деионизированной воды. Затем осторожно добавьте 2,4 мл ледяной уксусной кислоты. Развести раствор до общего объема 2 л. Полученный раствор должен иметь pH от 2,8 до 3,2.

Отрегулируйте pH до 4,2, добавив 40% NaOH по каплям в раствор для перемешивания с помощью откалиброванного pH-метра.

Отфильтруйте подвижную фазу через мембранный фильтр 0,47 м под вакуумом, чтобы дегазировать раствор и удалить твердые частицы, которые могут засорить колонку. Важно проводить дегазацию раствора, так как пузырьки могут вызывать образование пустот в неподвижной фазе или проникать в ячейку детектора и вызывать нестабильность измерений.

Приготовьте трехкомпонентные растворы кофеина, бензоата и аспартама, которые являются тремя типичными компонентами диетических газированных напитков. Эти компонентные решения затем используются для подготовки стандартных решений, которые будут использоваться для определения неизвестных. Приготовьте 500 мл растворов кофеина и бензоата.

Приготовьте 100 мл раствора компонента аспартама. Храните раствор в холодильнике, когда он не используется, чтобы избежать разложения.

Далее приготовьте 7 стандартных растворов, каждый из которых содержит разную концентрацию кофеина, бензоата и аспартама. Дозируйте нужное количество каждого компонента в мерную колбу и разбавьте до отметки 50 мл подвижной фазой.

Первые 3 решения содержат по одному компоненту для обеспечения идентификации пиков. Остальные 4 раствора содержат диапазон концентраций всех 3 компонентов, чтобы соотнести высоту пика с концентрацией.

Налейте каждый стандартный раствор в промаркированный флакон в штативе для образцов. Храните штатив с образцами и оставшимися растворами в холодильнике.

Во-первых, установите мобильную фазу и контейнеры для отходов. Убедитесь, что мусоропроводы подаются в контейнер для отходов и не возвращаются в мобильную фазу. Убедитесь, что входная мобильная фазовая линия подается в контейнер с подвижной фазой.

Убедитесь, что скорость потока подвижной фазы установлена на уровне 0,5 мл/мин. Такая скорость потока позволяет всем компонентам размываться в течение 5 минут, но она достаточно медленная, чтобы обеспечить разрешение отдельных пиков.

Затем проверьте минимальное и максимальное давление в системе подачи растворителя. Эти настройки отключают насос в случае утечки или засорения соответственно.

Нажмите «ноль» на передней панели датчиков, чтобы установить заглушку. Промыть 100-? Л шприца с деионизированной водой, затем с несколькими объемами 1 из 7 рабочих норм. Затем наполните шприц этим раствором. Начните с 3 однокомпонентных выборок, чтобы определить пик каждого компонента.

Далее введите раствор вручную, поставив ручку инжектора в положение загрузки. Медленно вводите 100 ? Л раствора через порт перегородки.

Убедитесь, что программа сбора данных настроена на сбор данных в течение 300 с, что дает достаточно времени для того, чтобы все 3 пика прошли через детектор. Когда вы будете готовы начать испытание, поверните ручку инжектора в положение для инъекции, чтобы ввести образец в подвижную фазу. Сразу же нажмите «Начать пробную версию» в программе сбора данных. Когда сканирование будет завершено, повторите процесс для каждого из 7 стандартных решений. Для каждого из первых 3 стандартов появляется только один из 3 пиков. Обратите внимание на местоположение пика, которое используется для идентификации компонента.

Выберите 3 образца диетической газировки и оставьте их в открытых контейнерах на ночь, чтобы удалить карбонизацию.

После ночной дегазации наберите примерно по 3 мл каждой диетической газировки в пластиковый шприц. Далее прикрепите наконечник фильтра к шприцу и протолкните соду через фильтр в стеклянный флакон, чтобы удалить любые твердые частицы.

Разбавьте 2 мл каждого образца 2 мл подвижной фазы, чтобы снизить концентрацию соды вдвое.

Розыгрыш 100 ? L одного из образцов соды в шприц и ввести его в контур образца. Запустите пробную версию с параметрами, идентичными стандартным решениям. Повторите для каждого образца газировки.

Во-первых, соотнесите пиковые площади стандартных образцов с известными концентрациями. Для этого необходимо определить пиковые площади на хроматографах для каждого стандартного образца с помощью треугольного метода. Вычислите время пиковой высоты с шириной в половине высоты и используйте это значение в качестве пиковой площади.

Используя пиковую площадь и известные концентрации, создайте калибровочную кривую для каждого компонента и определите метод наименьших квадратов, подходящий для каждой калибровочной кривой.

Рассчитайте концентрацию каждого компонента в рационе газированных напитков с пиковых участков. Помните, что все газированные напитки были разбавлены в 2 раза перед введением в ВЭЖХ. Основываясь на этих результатах, рассчитайте мг каждого компонента в банке газировки объемом 12 унций.

Неудивительно, что все 3 протестированные газированные напитки содержали примерно одинаковое количество консерванта бензоата. Тем не менее, продукты Coca-Cola содержали больше кофеина. Рассчитанные значения для всех компонентов хорошо коррелировали с отчетными значениями производителей.

ВЭЖХ – это универсальный прибор, который используется в широком спектре анализов.

ВЭЖХ часто используется для очистки пептидных молекул. В этом примере были получены трансмембранные пептидные комплексы, а затем стабилизированы путем окислительного сшивания белков дисульфидными связями.

Затем белки растворяли в муравьиной кислоте и очищали с помощью ВЭЖХ в обращенной фазе. Затем образец элюировали с помощью линейного градиента из двух растворителей, и чистота была подтверждена с помощью масс-спектрометрии.

ВЭЖХ также может быть использована для идентификации органических соединений, синтезированных в лаборатории. В эксперименте Миллера-Юри изучался абиотический синтез органических соединений на первичной земле. Первичные газы, такие как метан и аммиак, были введены в колбу с водой, имитируя ранние океаны. Затем применялся электрический разряд, имитирующий удары молнии на первозданной земле.

Затем воду анализировали с помощью ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией и сравнивали с известными стандартами аминокислот. В этом эксперименте было синтезировано и идентифицировано 23 аминокислоты.

Вы только что посмотрели введение JoVE в ВЭЖХ. Теперь вы должны понять основы работы с прибором и анализа полученных данных.

Спасибо за просмотр!