Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ)

1. Переход на мобильную фазу

1. Приготовьте подвижную фазу, добавив 400 мл ацетонитрила примерно к 1,5 л очищенной деионизированной воды.
2. Осторожно добавьте в этот раствор 2,4 мл ледяной уксусной кислоты.
3. Раствор развести до общего объема 2,0 л в мерной колбе с очищенной деионизированной водой. Полученный раствор должен иметь pH от 2,8 до 3,2.
4. Отрегулируйте pH до 4,2, добавив 40% гидроксида натрия по каплям с помощью откалиброванного цифрового pH-метра. Добавляйте очень медленно, как только pH достигнет 4,0. Для этого потребуется около 50 капель.
5. Отфильтруйте подвижную фазу через мембранный фильтр Nylon 66 толщиной 0,47 мкм под вакуумом, чтобы дегазировать раствор и удалить твердые частицы, которые могут засорить хроматографическую колонку. Важно дегазировать подвижную фазу, чтобы избежать образования пузырьков, которые могут либо вызвать пустоту в неподвижной фазе на входе в колонку, либо проникнуть в ячейку детектора, вызывая нестабильность поглощения ультрафиолетового излучения.

2. Создание компонентных решений

Три компонента, которые необходимо производить: это кофеин (0,8 мг/мл), бензоат калия (1,4 мг/мл) и аспартам (L-аспартил-L-фенилаланин метиловый эфир) (6,0 мг/мл). Эти концентрации, будучи разбавленными таким же образом, устанавливают стандарты на уровнях, обнаруженных в образцах газировки.

1. Добавьте 0,40 г кофеина в мерную колбу объемом 500 мл, затем разбавьте до отметки 500 мл деионизированной водой.
2. Добавьте 0,70 г бензоата в мерную колбу объемом 500 мл, затем разбавьте до отметки 500 мл деионизированной водой.
3. Добавьте 0,60 г аспартама в мерную колбу объемом 100 мл, затем разбавьте до отметки 100 мл деионизированной водой. Поместите этот раствор в холодильник, чтобы избежать разложения при хранении.

3. Создание 7 стандартных решений

Все три компонента имеют разные коэффициенты распределения, что влияет на то, как каждый из них взаимодействует с обеими фазами. Чем больше коэффициент распределения, тем больше времени компонент проводит в неподвижной фазе, что приводит к более длительному времени удержания при достижении детектора.

1. Следуя таблице в таблице 1, нанесите нужное количество каждого компонента в мерную колбу объемом 50 мл.
2. Развести каждый из стоковых растворов до отметки 50 мл на мерных колбах с подвижной фазой.
3. Разлейте каждый стандартный раствор по промаркированным маленьким флаконам в штативе для образцов.
4. Храните штативы с образцами в холодильнике вместе с оставшимися растворами в мерных колбах объемом 50 мл.

4. Проверка начальных настроек системы ВЭЖХ

1. Убедитесь, что мусоропровод находится в контейнере для отходов и не перерабатывается обратно в мобильную фазу.
2. Убедитесь, что скорость потока подвижной фазы установлена на уровне 0,5 мл/мин. Это достаточно высоко, чтобы все пики размылись в течение 5 минут, и достаточно медленно, чтобы обеспечить хорошее разрешение.
3. Убедитесь, что минимальное и максимальное давление и расход установлены на правильные значения на передней панели системы подачи растворителя (насоса).
   1. Минимальная настройка давления: 250 фунтов на квадратный дюйм (это для отключения насоса в случае утечки).
   2. Настройка максимального давления: 4 000 фунтов на квадратный дюйм (это необходимо для защиты насоса от поломки в случае образования засорения).
4. Нажмите «ноль» на передней панели датчика, чтобы установить заготовку (заготовка — это чисто мобильная фаза).
5. Промойте шприц объемом 100 мкл деионизированной водой, затем несколькими объемами одного из анализируемых рабочих стандартов и наполните шприц этим раствором. Начните с 3 однокомпонентных образцов, которые позволяют определить пик каждого интересующего компонента.

5. Ручное внедрение образца и сбор данных

1. С ручкой инжектора в положении нагрузки медленно введите 100 мкл раствора через порт перегородки.
2. Убедитесь, что программа сбора данных настроена на сбор данных в течение 300 с, что дает достаточно времени для того, чтобы все 3 пика прошли через детектор.
3. Когда вы будете готовы начать испытание, поверните ручку инжектора в положение инъекции (что переводит образец в мобильную фазу) и немедленно нажмите «Начать испытание» в программе сбора данных компьютера. Для стандартов 1-3 во время прогона на экране появляется только один из трех последовательных пиков (рис. 1).
4. По прошествии 300 секунд система сбора данных отправляет запрос на сохранение файла данных. Сохраните данные под подходящим именем файла (например, STD#1).
5. Обратите внимание на время в секундах для пика каждого испытания, которое используется для идентификации этого компонента.
6. Извлеките шприц из перегородки и повторите процесс для каждого из оставшихся рабочих стандартов, используя то же время на хроматограмму, которое было определено при первом запуске.

Рисунок 1. Хроматограмма 3 компонентов. Слева направо это кофеин, аспартам и бензоат.

6. Образцы диетических газированных напитков

Diet Coke, Diet Pepsi и Coke Zero - это "неизвестные." Они были оставлены в открытых контейнерах на ночь, чтобы избавиться от карбонизации, так как пузырьки не полезны для системы ВЭЖХ. Это в достаточной степени избавляет от любых газов в образцах.

1. Наберите около 2 мл диетической соды в пластиковый шприц.
2. Прикрепите наконечник фильтра к шприцу с помощью люэр-лока, повернув его на место.
3. Протолкните жидкость в шприце через фильтр в небольшой стеклянный флакон. Это избавляет от нежелательных частиц, которые потенциально могут засорить разделительную колонну.
4. Разбавьте каждый образец равным количеством воды DI, чтобы они были с чистотой 50%.
5. Введите 100 мкл образца в контур отбора проб и проведите испытания с теми же параметрами, что и для стандартов.

7. Вычисления

1. Исходя из концентраций составляющих растворов, рассчитайте концентрацию всех компонентов в стандартах, основываясь на разведениях, которые были сделаны для 7 образцов.
2. Определите пиковые площади на хроматограммах для каждого стандартного и неизвестного образца треугольным методом, который равен высоте пика, умноженной на ширину на высоте 1/2 (рис. 2). После определения того, какой пик соответствует каждому компоненту на основе времени, необходимого для того, чтобы каждый компонент показал свой соответствующий пик, введите эти пиковые области в компьютерную таблицу.
3. Создание калибровочных кривых зависимости площади пика от концентрации (мг/л) в стандартах для всех трех компонентов.
4. Определите аппроксимацию по методу наименьших квадратов для каждой калибровочной кривой.
5. Рассчитайте концентрацию каждого компонента в диетических газированных напитках на основе пиковых областей, показанных в испытаниях ВЭЖХ для образцов. Помните, что диетическая газировка была разбавлена в 2 раза перед введением в систему ВЭЖХ.
6. Рассчитайте количество в мг/л каждого компонента диетических газированных напитков.
7. Основываясь на полученных результатах, рассчитайте миллиграммы каждого компонента, содержащегося в банке газировки объемом 12 унций. Предположим, что 12 унций = 354,9 мл.

Рисунок 2. Простой пример высоты и ширины пика кривой, которые необходимо умножить (высота пика умножается на ширину на 1/2 высоты).