1. Переход на мобильную фазу
- Приготовьте подвижную фазу, добавив 400 мл ацетонитрила примерно к 1,5 л очищенной деионизированной воды.
- Осторожно добавьте в этот раствор 2,4 мл ледяной уксусной кислоты.
- Раствор развести до общего объема 2,0 л в мерной колбе с очищенной деионизированной водой. Полученный раствор должен иметь pH от 2,8 до 3,2.
- Отрегулируйте pH до 4,2, добавив 40% гидроксида натрия по каплям с помощью откалиброванного цифрового pH-метра. Добавляйте очень медленно, как только pH достигнет 4,0. Для этого потребуется около 50 капель.
- Отфильтруйте подвижную фазу через мембранный фильтр Nylon 66 толщиной 0,47 мкм под вакуумом, чтобы дегазировать раствор и удалить твердые частицы, которые могут засорить хроматографическую колонку. Важно дегазировать подвижную фазу, чтобы избежать образования пузырьков, которые могут либо вызвать пустоту в неподвижной фазе на входе в колонку, либо проникнуть в ячейку детектора, вызывая нестабильность поглощения ультрафиолетового излучения.
2. Создание компонентных решений
Три компонента, которые необходимо производить: это кофеин (0,8 мг/мл), бензоат калия (1,4 мг/мл) и аспартам (L-аспартил-L-фенилаланин метиловый эфир) (6,0 мг/мл). Эти концентрации, будучи разбавленными таким же образом, устанавливают стандарты на уровнях, обнаруженных в образцах газировки.
- Добавьте 0,40 г кофеина в мерную колбу объемом 500 мл, затем разбавьте до отметки 500 мл деионизированной водой.
- Добавьте 0,70 г бензоата в мерную колбу объемом 500 мл, затем разбавьте до отметки 500 мл деионизированной водой.
- Добавьте 0,60 г аспартама в мерную колбу объемом 100 мл, затем разбавьте до отметки 100 мл деионизированной водой. Поместите этот раствор в холодильник, чтобы избежать разложения при хранении.
3. Создание 7 стандартных решений
Все три компонента имеют разные коэффициенты распределения, что влияет на то, как каждый из них взаимодействует с обеими фазами. Чем больше коэффициент распределения, тем больше времени компонент проводит в неподвижной фазе, что приводит к более длительному времени удержания при достижении детектора.
- Следуя таблице в таблице 1, нанесите нужное количество каждого компонента в мерную колбу объемом 50 мл.
- Развести каждый из стоковых растворов до отметки 50 мл на мерных колбах с подвижной фазой.
- Разлейте каждый стандартный раствор по промаркированным маленьким флаконам в штативе для образцов.
- Храните штативы с образцами в холодильнике вместе с оставшимися растворами в мерных колбах объемом 50 мл.
4. Проверка начальных настроек системы ВЭЖХ
- Убедитесь, что мусоропровод находится в контейнере для отходов и не перерабатывается обратно в мобильную фазу.
- Убедитесь, что скорость потока подвижной фазы установлена на уровне 0,5 мл/мин. Это достаточно высоко, чтобы все пики размылись в течение 5 минут, и достаточно медленно, чтобы обеспечить хорошее разрешение.
- Убедитесь, что минимальное и максимальное давление и расход установлены на правильные значения на передней панели системы подачи растворителя (насоса).
- Минимальная настройка давления: 250 фунтов на квадратный дюйм (это для отключения насоса в случае утечки).
- Настройка максимального давления: 4 000 фунтов на квадратный дюйм (это необходимо для защиты насоса от поломки в случае образования засорения).
- Нажмите «ноль» на передней панели датчика, чтобы установить заготовку (заготовка — это чисто мобильная фаза).
- Промойте шприц объемом 100 мкл деионизированной водой, затем несколькими объемами одного из анализируемых рабочих стандартов и наполните шприц этим раствором. Начните с 3 однокомпонентных образцов, которые позволяют определить пик каждого интересующего компонента.
5. Ручное внедрение образца и сбор данных
- С ручкой инжектора в положении нагрузки медленно введите 100 мкл раствора через порт перегородки.
- Убедитесь, что программа сбора данных настроена на сбор данных в течение 300 с, что дает достаточно времени для того, чтобы все 3 пика прошли через детектор.
- Когда вы будете готовы начать испытание, поверните ручку инжектора в положение инъекции (что переводит образец в мобильную фазу) и немедленно нажмите «Начать испытание» в программе сбора данных компьютера. Для стандартов 1-3 во время прогона на экране появляется только один из трех последовательных пиков (рис. 1).
- По прошествии 300 секунд система сбора данных отправляет запрос на сохранение файла данных. Сохраните данные под подходящим именем файла (например, STD#1).
- Обратите внимание на время в секундах для пика каждого испытания, которое используется для идентификации этого компонента.
- Извлеките шприц из перегородки и повторите процесс для каждого из оставшихся рабочих стандартов, используя то же время на хроматограмму, которое было определено при первом запуске.
Рисунок 1. Хроматограмма 3 компонентов. Слева направо это кофеин, аспартам и бензоат.
6. Образцы диетических газированных напитков
Diet Coke, Diet Pepsi и Coke Zero - это "неизвестные." Они были оставлены в открытых контейнерах на ночь, чтобы избавиться от карбонизации, так как пузырьки не полезны для системы ВЭЖХ. Это в достаточной степени избавляет от любых газов в образцах.
- Наберите около 2 мл диетической соды в пластиковый шприц.
- Прикрепите наконечник фильтра к шприцу с помощью люэр-лока, повернув его на место.
- Протолкните жидкость в шприце через фильтр в небольшой стеклянный флакон. Это избавляет от нежелательных частиц, которые потенциально могут засорить разделительную колонну.
- Разбавьте каждый образец равным количеством воды DI, чтобы они были с чистотой 50%.
- Введите 100 мкл образца в контур отбора проб и проведите испытания с теми же параметрами, что и для стандартов.
7. Вычисления
- Исходя из концентраций составляющих растворов, рассчитайте концентрацию всех компонентов в стандартах, основываясь на разведениях, которые были сделаны для 7 образцов.
- Определите пиковые площади на хроматограммах для каждого стандартного и неизвестного образца треугольным методом, который равен высоте пика, умноженной на ширину на высоте 1/2 (рис. 2). После определения того, какой пик соответствует каждому компоненту на основе времени, необходимого для того, чтобы каждый компонент показал свой соответствующий пик, введите эти пиковые области в компьютерную таблицу.
- Создание калибровочных кривых зависимости площади пика от концентрации (мг/л) в стандартах для всех трех компонентов.
- Определите аппроксимацию по методу наименьших квадратов для каждой калибровочной кривой.
- Рассчитайте концентрацию каждого компонента в диетических газированных напитках на основе пиковых областей, показанных в испытаниях ВЭЖХ для образцов. Помните, что диетическая газировка была разбавлена в 2 раза перед введением в систему ВЭЖХ.
- Рассчитайте количество в мг/л каждого компонента диетических газированных напитков.
- Основываясь на полученных результатах, рассчитайте миллиграммы каждого компонента, содержащегося в банке газировки объемом 12 унций. Предположим, что 12 унций = 354,9 мл.
Рисунок 2. Простой пример высоты и ширины пика кривой, которые необходимо умножить (высота пика умножается на ширину на 1/2 высоты).
Источник: Д-р Пол Бауэр - Университет Пердью
Высокоэффективная жидкостная хроматография (ВЭЖХ) является важным аналитическим методом, обычно используемым для разделения и количественного определения компонентов жидких образцов. В этом методе раствор (первая фаза) прокачивается через колонну, содержащую упаковку мелких пористых частиц со второй фазой, связанной с поверхностью. Различная растворимость компонентов образца в двух фазах приводит к тому, что компоненты перемещаются по колонне с разными средними скоростями, тем самым создавая разделение этих компонентов. Перекачиваемый раствор называется подвижной фазой, в то время как фаза в колонне называется стационарной фазой.
Существует несколько режимов жидкостной хроматографии, в зависимости от типа используемой стационарной и/или подвижной фазы. В этом эксперименте используется обращенно-фазовая хроматография, где стационарная фаза неполярна, а подвижная фаза полярна. Стационарная фаза представляет собой углеводородные группы C18, связанные с частицами кремнезема размером 3 мкм, в то время как подвижная фаза представляет собой водный буфер с полярным органическим модификатором (ацетонитрилом), добавленным для изменения его элюирующей прочности. В этой форме диоксид кремния можно использовать для образцов, которые растворяются в воде, обеспечивая широкий спектр применения. В этом эксперименте были разделены смеси трех компонентов, часто встречающихся в диетических безалкогольных напитках (а именно кофеина, бензоата и аспартама). Используют семь приготовленных растворов, содержащих известные количества трех веществ, и затем записывают их хроматограммы.
1. Переход на мобильную фазу
- Приготовьте подвижную фазу, добавив 400 мл ацетонитрила примерно к 1,5 л очищенной деионизированной воды.
- Осторожно добавьте в этот раствор 2,4 мл ледяной уксусной кислоты.
- Раствор развести до общего объема 2,0 л в мерной колбе с очищенной деионизированной водой. Полученный раствор должен иметь pH от 2,8 до 3,2.
- Отрегулируйте pH до 4,2, добавив 40% гидроксида натрия по каплям с помощью откалиброванного цифрового pH-метра. Добавляйте очень медленно, как только pH достигнет 4,0. Для этого потребуется около 50 капель.
- Отфильтруйте подвижную фазу через мембранный фильтр Nylon 66 толщиной 0,47 мкм под вакуумом, чтобы дегазировать раствор и удалить твердые частицы, которые могут засорить хроматографическую колонку. Важно дегазировать подвижную фазу, чтобы избежать образования пузырьков, которые могут либо вызвать пустоту в неподвижной фазе на входе в колонку, либо проникнуть в ячейку детектора, вызывая нестабильность поглощения ультрафиолетового излучения.
2. Создание компонентных решений
Три компонента, которые необходимо производить: это кофеин (0,8 мг/мл), бензоат калия (1,4 мг/мл) и аспартам (L-аспартил-L-фенилаланин метиловый эфир) (6,0 мг/мл). Эти концентрации, будучи разбавленными таким же образом, устанавливают стандарты на уровнях, обнаруженных в образцах газировки.
- Добавьте 0,40 г кофеина в мерную колбу объемом 500 мл, затем разбавьте до отметки 500 мл деионизированной водой.
- Добавьте 0,70 г бензоата в мерную колбу объемом 500 мл, затем разбавьте до отметки 500 мл деионизированной водой.
- Добавьте 0,60 г аспартама в мерную колбу объемом 100 мл, затем разбавьте до отметки 100 мл деионизированной водой. Поместите этот раствор в холодильник, чтобы избежать разложения при хранении.
3. Создание 7 стандартных решений
Все три компонента имеют разные коэффициенты распределения, что влияет на то, как каждый из них взаимодействует с обеими фазами. Чем больше коэффициент распределения, тем больше времени компонент проводит в неподвижной фазе, что приводит к более длительному времени удержания при достижении детектора.
- Следуя таблице в таблице 1, нанесите нужное количество каждого компонента в мерную колбу объемом 50 мл.
- Развести каждый из стоковых растворов до отметки 50 мл на мерных колбах с подвижной фазой.
- Разлейте каждый стандартный раствор по промаркированным маленьким флаконам в штативе для образцов.
- Храните штативы с образцами в холодильнике вместе с оставшимися растворами в мерных колбах объемом 50 мл.
4. Проверка начальных настроек системы ВЭЖХ
- Убедитесь, что мусоропровод находится в контейнере для отходов и не перерабатывается обратно в мобильную фазу.
- Убедитесь, что скорость потока подвижной фазы установлена на уровне 0,5 мл/мин. Это достаточно высоко, чтобы все пики размылись в течение 5 минут, и достаточно медленно, чтобы обеспечить хорошее разрешение.
- Убедитесь, что минимальное и максимальное давление и расход установлены на правильные значения на передней панели системы подачи растворителя (насоса).
- Минимальная настройка давления: 250 фунтов на квадратный дюйм (это для отключения насоса в случае утечки).
- Настройка максимального давления: 4 000 фунтов на квадратный дюйм (это необходимо для защиты насоса от поломки в случае образования засорения).
- Нажмите «ноль» на передней панели датчика, чтобы установить заготовку (заготовка — это чисто мобильная фаза).
- Промойте шприц объемом 100 мкл деионизированной водой, затем несколькими объемами одного из анализируемых рабочих стандартов и наполните шприц этим раствором. Начните с 3 однокомпонентных образцов, которые позволяют определить пик каждого интересующего компонента.
5. Ручное внедрение образца и сбор данных
- С ручкой инжектора в положении нагрузки медленно введите 100 мкл раствора через порт перегородки.
- Убедитесь, что программа сбора данных настроена на сбор данных в течение 300 с, что дает достаточно времени для того, чтобы все 3 пика прошли через детектор.
- Когда вы будете готовы начать испытание, поверните ручку инжектора в положение инъекции (что переводит образец в мобильную фазу) и немедленно нажмите «Начать испытание» в программе сбора данных компьютера. Для стандартов 1-3 во время прогона на экране появляется только один из трех последовательных пиков (рис. 1).
- По прошествии 300 секунд система сбора данных отправляет запрос на сохранение файла данных. Сохраните данные под подходящим именем файла (например, STD#1).
- Обратите внимание на время в секундах для пика каждого испытания, которое используется для идентификации этого компонента.
- Извлеките шприц из перегородки и повторите процесс для каждого из оставшихся рабочих стандартов, используя то же время на хроматограмму, которое было определено при первом запуске.
Рисунок 1. Хроматограмма 3 компонентов. Слева направо это кофеин, аспартам и бензоат.
6. Образцы диетических газированных напитков
Diet Coke, Diet Pepsi и Coke Zero - это "неизвестные." Они были оставлены в открытых контейнерах на ночь, чтобы избавиться от карбонизации, так как пузырьки не полезны для системы ВЭЖХ. Это в достаточной степени избавляет от любых газов в образцах.
- Наберите около 2 мл диетической соды в пластиковый шприц.
- Прикрепите наконечник фильтра к шприцу с помощью люэр-лока, повернув его на место.
- Протолкните жидкость в шприце через фильтр в небольшой стеклянный флакон. Это избавляет от нежелательных частиц, которые потенциально могут засорить разделительную колонну.
- Разбавьте каждый образец равным количеством воды DI, чтобы они были с чистотой 50%.
- Введите 100 мкл образца в контур отбора проб и проведите испытания с теми же параметрами, что и для стандартов.
7. Вычисления
- Исходя из концентраций составляющих растворов, рассчитайте концентрацию всех компонентов в стандартах, основываясь на разведениях, которые были сделаны для 7 образцов.
- Определите пиковые площади на хроматограммах для каждого стандартного и неизвестного образца треугольным методом, который равен высоте пика, умноженной на ширину на высоте 1/2 (рис. 2). После определения того, какой пик соответствует каждому компоненту на основе времени, необходимого для того, чтобы каждый компонент показал свой соответствующий пик, введите эти пиковые области в компьютерную таблицу.
- Создание калибровочных кривых зависимости площади пика от концентрации (мг/л) в стандартах для всех трех компонентов.
- Определите аппроксимацию по методу наименьших квадратов для каждой калибровочной кривой.
- Рассчитайте концентрацию каждого компонента в диетических газированных напитках на основе пиковых областей, показанных в испытаниях ВЭЖХ для образцов. Помните, что диетическая газировка была разбавлена в 2 раза перед введением в систему ВЭЖХ.
- Рассчитайте количество в мг/л каждого компонента диетических газированных напитков.
- Основываясь на полученных результатах, рассчитайте миллиграммы каждого компонента, содержащегося в банке газировки объемом 12 унций. Предположим, что 12 унций = 354,9 мл.
Рисунок 2. Простой пример высоты и ширины пика кривой, которые необходимо умножить (высота пика умножается на ширину на 1/2 высоты).
Высокоэффективная жидкостная хроматография, или ВЭЖХ, является очень универсальным методом, который разделяет компоненты жидкой смеси на основе их различных взаимодействий со стационарной фазой.
ВЭЖХ – это адаптация колоночной хроматографии. При колоночной хроматографии колонка заполняется микрогранулами, называемыми стационарной фазой. Шарики неподвижной фазы функционализированы химическими группами, которые индуцируют взаимодействие между шариком и компонентами смеси, находящимися в жидкой, или подвижной фазе. По мере того, как смесь протекает через колонну, компоненты по-разному взаимодействуют со стационарной фазой.
В ВЭЖХ колоночная хроматография выполняется при более высокой скорости потока и, следовательно, более высоком давлении, чем классическая колоночная хроматография. Это позволяет использовать шарики неподвижной фазы меньшего размера с большим отношением площади поверхности к объему, что значительно увеличивает взаимодействие неподвижной фазы и компонентов в подвижной фазе.
В этом видео мы познакомим с основами работы ВЭЖХ, продемонстрировав разделение компонентов различных диетических газированных напитков.
В лабораторных условиях используются два типа ВЭЖХ: аналитические и препаративные. В аналитической ВЭЖХ прибор используется для идентификации компонентов небольшого объема, а анализируемый образец затем отбраковывается как отходы. В препаративной ВЭЖХ инструмент используется для очистки смеси, и нужное количество каждого компонента собирается во фракции.
Контрольно-измерительные приборы ВЭЖХ состоят из ряда простых компонентов. Во-первых, подвижная фаза, содержащаяся в резервуарах с растворителем, прокачивается через систему одним или несколькими насосами с постоянным расходом. Образец впрыскивается в подвижный фазовый поток с помощью инжектора образца. Образец, разбавленный подвижной фазой, затем подается в колонну ВЭЖХ, где отделяются компоненты образца. Затем компоненты анализируются детектором и либо сохраняются в виде фракций для последующего использования, либо переносятся в бутылку для отходов.
Колонна ВЭЖХ является ключевым компонентом системы. Он состоит из металлического или пластикового цилиндра, наполненного микрогранулами неподвижной фазы или хроматографической смолой. Смесь образцов протекает через слой упакованных частиц с постоянной скоростью потока, и каждый компонент взаимодействует со стационарной фазой при прохождении мимо.
Соединения по-разному взаимодействуют со стационарной фазой, и поэтому проходят вниз по длине колонки к детектору с разной скоростью. Время, необходимое для выхода компонента из колонны или элюирования, называется временем удержания. Результатом является график зависимости времени удержания от интенсивности, или хроматограмма. Время хранения используется для идентификации компонента. Размер пика, в частности, площадь под пиком, используется для количественной оценки количества соединения в исходном растворе.
Выбор стационарной фазы зависит от свойств компонентов в смеси образцов. Наиболее часто используемой стационарной фазой являются гранулы диоксида кремния, так как они представляют собой инертный неполярный материал, который образует микроразмерные гранулы и обеспечивает достаточную плотность упаковки. Наиболее распространенным типом ВЭЖХ является обратимо-фазовая хроматография, в которой используется гидрофобная стационарная фаза, обычно гранулы диоксида кремния с цепями C18, связанными с поверхностью гранул. Компоненты элюируются в порядке убывания полярности.
Подвижная фаза, используемая в обращенно-фазовой хроматографии, обычно представляет собой смесь воды и органического растворителя, такого как ацетонитрил. В зависимости от образца, подвижной фазой может оставаться постоянное соотношение воды и органического растворителя, известное как изократический режим. Тем не менее, это может привести к широким пикам в случае высокого содержания воды или перекрывающимся пикам в случае высокого содержания органических веществ.
Подвижное фазовое соотношение также может изменяться линейно или ступенчато во время разделения для создания подвижного фазового градиента. Градиентное элюирование может предотвратить уширение пика менее полярных компонентов, тем самым улучшая разделение и сокращая время элюирования.
Теперь, когда основы ВЭЖХ изложены, метод ВЭЖХ будет продемонстрирован в лаборатории. В этом эксперименте ВЭЖХ будет использоваться для разделения и количественного определения трех распространенных компонентов диетической газировки.
Во-первых, чтобы приготовить подвижную фазу, добавьте 400 мл ацетонитрила к 1,5 л очищенной деионизированной воды. Затем осторожно добавьте 2,4 мл ледяной уксусной кислоты. Развести раствор до общего объема 2 л. Полученный раствор должен иметь pH от 2,8 до 3,2.
Отрегулируйте pH до 4,2, добавив 40% NaOH по каплям в раствор для перемешивания с помощью откалиброванного pH-метра.
Отфильтруйте подвижную фазу через мембранный фильтр 0,47 м под вакуумом, чтобы дегазировать раствор и удалить твердые частицы, которые могут засорить колонку. Важно проводить дегазацию раствора, так как пузырьки могут вызывать образование пустот в неподвижной фазе или проникать в ячейку детектора и вызывать нестабильность измерений.
Приготовьте трехкомпонентные растворы кофеина, бензоата и аспартама, которые являются тремя типичными компонентами диетических газированных напитков. Эти компонентные решения затем используются для подготовки стандартных решений, которые будут использоваться для определения неизвестных. Приготовьте 500 мл растворов кофеина и бензоата.
Приготовьте 100 мл раствора компонента аспартама. Храните раствор в холодильнике, когда он не используется, чтобы избежать разложения.
Далее приготовьте 7 стандартных растворов, каждый из которых содержит разную концентрацию кофеина, бензоата и аспартама. Дозируйте нужное количество каждого компонента в мерную колбу и разбавьте до отметки 50 мл подвижной фазой.
Первые 3 решения содержат по одному компоненту для обеспечения идентификации пиков. Остальные 4 раствора содержат диапазон концентраций всех 3 компонентов, чтобы соотнести высоту пика с концентрацией.
Налейте каждый стандартный раствор в промаркированный флакон в штативе для образцов. Храните штатив с образцами и оставшимися растворами в холодильнике.
Во-первых, установите мобильную фазу и контейнеры для отходов. Убедитесь, что мусоропроводы подаются в контейнер для отходов и не возвращаются в мобильную фазу. Убедитесь, что входная мобильная фазовая линия подается в контейнер с подвижной фазой.
Убедитесь, что скорость потока подвижной фазы установлена на уровне 0,5 мл/мин. Такая скорость потока позволяет всем компонентам размываться в течение 5 минут, но она достаточно медленная, чтобы обеспечить разрешение отдельных пиков.
Затем проверьте минимальное и максимальное давление в системе подачи растворителя. Эти настройки отключают насос в случае утечки или засорения соответственно.
Нажмите «ноль» на передней панели датчиков, чтобы установить заглушку. Промыть 100-? Л шприца с деионизированной водой, затем с несколькими объемами 1 из 7 рабочих норм. Затем наполните шприц этим раствором. Начните с 3 однокомпонентных выборок, чтобы определить пик каждого компонента.
Далее введите раствор вручную, поставив ручку инжектора в положение загрузки. Медленно вводите 100 ? Л раствора через порт перегородки.
Убедитесь, что программа сбора данных настроена на сбор данных в течение 300 с, что дает достаточно времени для того, чтобы все 3 пика прошли через детектор. Когда вы будете готовы начать испытание, поверните ручку инжектора в положение для инъекции, чтобы ввести образец в подвижную фазу. Сразу же нажмите «Начать пробную версию» в программе сбора данных. Когда сканирование будет завершено, повторите процесс для каждого из 7 стандартных решений. Для каждого из первых 3 стандартов появляется только один из 3 пиков. Обратите внимание на местоположение пика, которое используется для идентификации компонента.
Выберите 3 образца диетической газировки и оставьте их в открытых контейнерах на ночь, чтобы удалить карбонизацию.
После ночной дегазации наберите примерно по 3 мл каждой диетической газировки в пластиковый шприц. Далее прикрепите наконечник фильтра к шприцу и протолкните соду через фильтр в стеклянный флакон, чтобы удалить любые твердые частицы.
Разбавьте 2 мл каждого образца 2 мл подвижной фазы, чтобы снизить концентрацию соды вдвое.
Розыгрыш 100 ? L одного из образцов соды в шприц и ввести его в контур образца. Запустите пробную версию с параметрами, идентичными стандартным решениям. Повторите для каждого образца газировки.
Во-первых, соотнесите пиковые площади стандартных образцов с известными концентрациями. Для этого необходимо определить пиковые площади на хроматографах для каждого стандартного образца с помощью треугольного метода. Вычислите время пиковой высоты с шириной в половине высоты и используйте это значение в качестве пиковой площади.
Используя пиковую площадь и известные концентрации, создайте калибровочную кривую для каждого компонента и определите метод наименьших квадратов, подходящий для каждой калибровочной кривой.
Рассчитайте концентрацию каждого компонента в рационе газированных напитков с пиковых участков. Помните, что все газированные напитки были разбавлены в 2 раза перед введением в ВЭЖХ. Основываясь на этих результатах, рассчитайте мг каждого компонента в банке газировки объемом 12 унций.
Неудивительно, что все 3 протестированные газированные напитки содержали примерно одинаковое количество консерванта бензоата. Тем не менее, продукты Coca-Cola содержали больше кофеина. Рассчитанные значения для всех компонентов хорошо коррелировали с отчетными значениями производителей.
ВЭЖХ – это универсальный прибор, который используется в широком спектре анализов.
ВЭЖХ часто используется для очистки пептидных молекул. В этом примере были получены трансмембранные пептидные комплексы, а затем стабилизированы путем окислительного сшивания белков дисульфидными связями.
Затем белки растворяли в муравьиной кислоте и очищали с помощью ВЭЖХ в обращенной фазе. Затем образец элюировали с помощью линейного градиента из двух растворителей, и чистота была подтверждена с помощью масс-спектрометрии.
ВЭЖХ также может быть использована для идентификации органических соединений, синтезированных в лаборатории. В эксперименте Миллера-Юри изучался абиотический синтез органических соединений на первичной земле. Первичные газы, такие как метан и аммиак, были введены в колбу с водой, имитируя ранние океаны. Затем применялся электрический разряд, имитирующий удары молнии на первозданной земле.
Затем воду анализировали с помощью ВЭЖХ в сочетании с масс-спектрометрией и сравнивали с известными стандартами аминокислот. В этом эксперименте было синтезировано и идентифицировано 23 аминокислоты.
Вы только что посмотрели введение JoVE в ВЭЖХ. Теперь вы должны понять основы работы с прибором и анализа полученных данных.
Спасибо за просмотр!
Во время эксперимента с ВЭЖХ насос высокого давления забирает подвижную фазу из резервуара через инжектор. Затем он проходит через колонну с обратной фазой C18 для разделения компонентов. Наконец, подвижная фаза перемещается в детекторную ячейку, где поглощающая способность измеряется на длине волны 220 нм, и заканчивается в бутылке для отходов. Время, необходимое компоненту для прохождения пути от порта инжектора к детектору, называется временем удержания.
В этом эксперименте используется жидкостный хроматограф, в котором разделение выполняется на колонке обратной фазы. Размеры колонны составляют 3 мм (внутренний диаметр) x 100 мм, а набивка из диоксида кремния (размер частиц 3 мкм) функционализирована октадецилсиланом C18 (ODS). 6-линейный роторный инжекционный клапан Rheodyne используется для первоначального хранения образца в небольшом контуре и вводит образец в подвижную фазу при вращении клапана.
Обнаружение осуществляется методом абсорбционной спектроскопии на длине волны 220 нм. Этот эксперимент можно проводить при длине волны 254 нм, если детектор не является переменным. Данные с детектора имеют аналоговое напряжение на выходе, которое измеряется с помощью цифрового мультиметра (DMM) и считывается компьютером, загруженным программой сбора данных. Полученная хроматограмма имеет пик для каждого компонента в образце. Для этого эксперимента все три компонента разбавляются в течение 5 минут.
В этом эксперименте используется одна подвижная фаза и насос, которые называются изократической подвижной фазой. Для образцов, которые трудно разделить, можно использовать градиентную подвижную фазу. Это когда начальная подвижная фаза является преимущественно водной, и со временем к общей подвижной фазе постепенно добавляется вторая органическая подвижная фаза. Этот метод повышает полярность этой фазы с течением времени, что снижает время удержания компонентов и работает аналогично градиенту температуры на газовом хроматографе. Бывают случаи, когда колонка нагревается (обычно до 40 °C), что устраняет любые ошибки времени удержания, связанные с изменением температуры окружающей среды.
В ВЭЖХ с обратной фазой неподвижная фазовая упаковка колонны обычно представляет собой упаковку C4, C8 или C18. Колонки C4 предназначены в основном для белков с большой молекулярной массой, тогда как колонки C18 предназначены для пептидов и основных образцов с более низкой молекулярной массой.
Обнаружение с помощью абсорбционной спектроскопии в подавляющем большинстве случаев является предпочтительным методом обнаружения, так как все спектры поглощения компонентов легко доступны. В некоторых системах в качестве метода обнаружения используются электрохимические измерения, такие как электропроводность или амперометрия.
Для этого эксперимента подвижная фаза состоит в основном из 20% ацетонитрила и на 80% из очищенной деионизированной (DI) воды. Небольшое количество уксусной кислоты добавляется для снижения рН подвижной фазы, что сохраняет силанол в неподвижной фазе упаковки в недиссоциированном состоянии. Это снижает пик адсорбции от хвостов, что приводит к более узким пикам. Затем pH корректируется с помощью 40% гидроксида натрия, чтобы повысить pH и уменьшить время удержания компонентов.
Каждая группа использует набор из 7 флаконов, содержащих различные концентрации стандартных растворов (Таблица 1). Первые 3 используются для идентификации каждого пика, а последние 4 — для создания калибровочной таблицы для каждого компонента. Стандарты 1–3 также используются для калибровочной карты.
| число | Кофеин (мл) | Бензоат (мл) | Аспартам (мл) |
| 1 | 4 | 0 | 0 |
| 2 | 0 | 4 | 0 |
| 3 | 0 | 0 | 4 |
| 4 | 1 | 1 | 1 |
| 5 | 2 | 2 | 2 |
| 6 | 3 | 3 | 3 |
| 7 | 5 | 5 | 5 |
Таблица 1. Объемы стандартных материалов, использованных для подготовки 7 предоставленных рабочих стандартов (общий объем каждого эталона составляет 50 мл).
Хроматограммы ВЭЖХ способны количественно определить каждый из 3 компонентов для всех образцов на основе калибровочных кривых стандартов (Рисунок 3).
Из этой серии экспериментов было установлено, что банка этих диетических газированных напитков объемом 12 унций содержит следующие количества каждого компонента:
Диетическая кола: 50,5 мг кофеина; 217,6 мг аспартама; 83,6 мг бензоата.
Coca-Cola Zero: 43,1 мг кофеина; 124,9 мг аспартама; 85,3 мг бензоата.
Диета Pepsi: 34,1 мг кофеина; 184,7 мг аспартама; 79,5 мг бензоата.
Неудивительно, что во всех 3 было примерно одинаковое количество бензоата, так как это всего лишь консервант. В продуктах Coca-Cola было немного больше кофеина, а в Coca-Cola Zero было гораздо меньше аспартама, чем в двух других газированных напитках, так как он также содержит лимонную кислоту для ароматизации.
Следующие цифры являются фактическим количеством кофеина и аспартама в банке объемом 12 унций из 3 диетических газированных напитков (содержание кофеина было получено с веб-сайтов Coca-Cola и Pepsi. Содержание аспартама было получено как из LiveStrong.com, так и из DiabetesSelfManagement.com.):
Диетическая кола: 46 мг кофеина; 187,5 мг аспартама
Coca-Cola Zero: 34 мг кофеина; 87,0 мг аспартама
Диета Pepsi: 35 мг кофеина; 177,0 мг аспартама
Примеры расчетов (Таблица 2):
Концентрация кофеина в STD#1: Компонентный раствор кофеина содержал 0,400 г кофеина, разведенного до 500 мл = 0,500 л → 0,800 г/л = 0,800 мг/мл.
STD#1 содержал 1 мл этого раствора, разбавленного до 50,0 мл
0,800 мг/мл * (1,0 мл / 50,0 мл) = 0,016 мг/мл = 16,0 мг/л.
STD#2 содержал 2 мл этого раствора, разбавленного до 50,0 мл
0,800 мг/мл * (2,0 мл / 50,0 мл) = 0,032 мг/мл = 32,0 мг/л.
Результаты трех калибровочных графиков (Рисунок 4) дали следующие уравнения:
Площадь пика кофеина = 0,1583*[Кофеин мг/л] - 0,574
Площадь пика аспартама = 0,02696*[Аспартам мг/л] - 0,405
Площадь бензоатного пика = 0,1363*[Бензоат мг/л] - 1,192
Диетическая кола: Площадь пика кофеина = 10,68 = 0,1583*[Кофеин мг/л] - 0,574
[Кофеин мг/л] = (10,68 + 0,574)/ (0,1583) = 71,1 мг/л в вводимом образце.
Поскольку образец был разбавлен в 2 раза, диетическая кола содержала 141,2 мг/л кофеина.
Количество на банку на 12 унций = (141,2 мг/л) (0,3549 мл/банка на 12 унций) = 50,5 мг кофеина/банку.
Рисунок 3. Хроматограммы ВЭЖХ 5 стандартов и 3 образца.
Рисунок 4. Калибровочные кривые для каждого из 3 компонентов.
Таблица 2. Таблицы данных для испытаний ВЭЖХ, использованные для построения калибровочных кривых.
ВЭЖХ является широко используемым методом разделения и обнаружения во многих областях применения. Он идеально подходит для нелетучих соединений, так как газовая хроматография (ГХ) требует, чтобы образцы находились в газовой фазе. К нелетучим соединениям относятся сахара, витамины, лекарства и метаболиты. Кроме того, он является неразрушающим, что позволяет собрать каждый компонент для дальнейшего анализа (например, масс-спектрометрии). Подвижные фазы практически не ограничены, что позволяет изменять полярность pH для достижения лучшего разрешения. Использование градиентных подвижных фаз позволяет добиться этих изменений во время реальных испытаний.
Существует обеспокоенность по поводу возможных проблем со здоровьем, которые могут быть связаны с искусственным подсластителем аспартамом. В текущей маркировке продукта не указано количество этих компонентов в составе диетических напитков. Этот метод позволяет количественно определить эти количества, наряду с кофеином и бензоатом.
Другие области применения включают определение количества пестицидов в воде; определение количества ацетаминофена или ибупрофена в обезболивающих таблетках; определение того, присутствуют ли в кровотоке спортсменов препараты, повышающие работоспособность; или просто определение наличия наркотиков в криминалистической лаборатории. Несмотря на то, что концентрации этих образцов и часто идентичность компонентов могут быть легко определены, единственным ограничением является то, что несколько образцов могут иметь почти идентичное время удержания, что приводит к совместному элюированию.
Videos from this collection:
Copyright © 2026 MyJoVE Corporation. All rights reserved