Метод ИФА

ИФА (иммуноферментный анализ) представляет собой широко используемый метод определения наличия или отсутствия специфического целевого белка.

В результате серии стадий промывки и связывания антитело, конъюгированное (связанное) с ферментом, распознает целевой белок на дне 96-луночного планшета. При добавлении субстрата в образец происходит ферментативная реакция, вызывающая изменение цвета, что позволяет идентифицировать и количественно определить целевой белок.

Прежде чем обсудить выполнение ИФА, давайте познакомимся с необходимым оборудованием и реагентами.

Для проведения реакции ИФА обычно используется 96-луночный плоскодонный планшет. Плоское дно лунок способствует равномерному распределению экспериментального образца, а также антител для захвата и детекции.

Метод ИФА позволяет обнаружить присутствие специфических целевых белков в экспериментальных водных растворах. Распространенными экспериментальными образцами являются моча, среды для культивирования клеток и сыворотка крови.

В ИФА антителом, которое напрямую связывается с целевым белком, является первичный антитело. Оно обладает высоким аффинитетом, то есть способностью прочно связываться с эпитопом — специфической областью целевого белка. Первичное антитело обычно немаркировано или неконъюгировано.

Как уже упоминалось, антитела в основном связываются со своими целевыми белками посредством высокоаффинного связывания со специфическим эпитопом. Однако экспериментальный образец может содержать фрагменты клеток, экспрессирующие сайты неспецифического связывания — участки, которые могут связываться с константным, неспецифичным для эпитопа регионом ваших детектирующих антител.

Поэтому в ИФА крайне важно добавить блокирующий буфер, чтобы закрыть любые сайты неспецифического связывания в экспериментальных образцах. В противном случае ферментативные реакции могут происходить в лунках, не содержащих целевого белка, что приведет к получению ложноположительных данных!

Вторичное антитело в ИФА — это антитело, используемое для распознавания первичного антитела. Это антитело обычно конъюгировано с ферментом. Иногда вторичные антитела имеют специфические названия. Например, если вторичное антитело было получено в организме осла для распознавания первичного антитела, полученного в козе, то такое вторичное антитело будет называться антителом осла против козьего антитела. При именовании вторичных антител первое имя указывает на организм, в котором было получено вторичное антитело, а второе имя представляет организм, в котором было получено первичное антитело.

Также потребуется субстрат, который связывается с активным центром фермента, присоединенного к вторичному антителу. Химическая реакция, происходящая в данном случае, вызывает изменение цвета изначально бесцветного субстрата. Этот так называемый колориметрический анализ позволяет идентифицировать и количественно определить присутствие целевого белка.

Ферментативная реакция будет продолжаться до тех пор, пока имеется доступный субстрат. Поэтому после короткого периода инкубации в лунки добавляют стоп-реагент, который вызывает очередное изменение цвета, указывающее на то, что реакция фактически остановлена.

Для количественного определения концентрации интересующего белка в каждой лунке используется микропланшетный ридер, который измеряет оптическую плотность, то есть количество окрашенного продукта в каждой лунке. Оптическая плотность пропорциональна количеству присутствующего целевого белка.

Теперь, когда все оборудование подготовлено, приступим к проведению ИФА!

Для выполнения стандартного или прямого ИФА сначала покройте лунки 96-луночного планшета целевым белком, разведенным в буфере для покрытия. В это же время нанесите положительный и отрицательный контроли.

После инкубации покрытого планшета в течение времени, достаточного для полной адсорбции или прикрепления белка к дну планшета, удалите излишки раствора для покрытия резким движением кисти.

Затем заблокируйте любое возможное неспецифическое связывание или фоновый сигнал, инкубируя каждую лунку в блокирующем буфере.

Теперь удалите блокирующий буфер и промойте лунки, проведя короткую инкубацию при комнатной температуре в фосфатно-солевом буфере (PBS) с 1% BSA.

Пока лунки промываются PBS, приготовьте разведения целевого белка с известной концентрацией для построения стандартной кривой. Абсорбция в лунках стандартной кривой, содержащих известные концентрации целевого белка, будет использоваться для расчета концентрации целевого белка в ваших экспериментальных образцах путем сравнения абсорбции в лунках с образцами и в лунках стандартной кривой.

Теперь пришло время добавить детектирующие или первичные антитела!

Затем планшет инкубируют, обычно при комнатной температуре, чтобы достаточное количество антител связалось с целевым белком для последующего детектирования и количественного определения белка.

После этой инкубации избыток антител удаляют, и лунки коротко промывают PBS.

Затем в планшет добавляют вторичные антитела, и планшет снова инкубируют — обычно на вращающейся платформе — для связывания вторичных антител. Этапы промывки повторяют, как и прежде.

Далее добавьте в планшет субстрат, чтобы определить, в каких лунках содержится ваш целевой белок. Накройте планшет, чтобы защитить реакцию от света, и после короткой инкубации остановите реакцию стоп-раствором.

Наконец, поместите планшет в микропланшетный ридер для измерения абсорбции или количества окрашенного раствора в каждой лунке. Вам нужно будет выбрать лунки, которые прибор должен проанализировать. После завершения считывания планшета на экране отобразятся значения абсорбции для каждой лунки.

Важно отметить, что каждый набор для ИФА имеет предел обнаружения. Это означает, что точно определить можно только концентрации белка в определенных пределах (выше и ниже конкретных значений). Очень низкие концентрации белка обычно слишком близки к фоновым уровням неспецифического окрашивания, в то время как очень высокие концентрации могут указывать на то, что избыток белка или антител не был должным образом вымыт из данной лунки с образцом.

Зачем может понадобиться проведение ИФА? Давайте рассмотрим несколько распространенных вариантов применения.

Вероятно, наиболее часто выполняемым типом ИФА является сэндвич-ИФА.

При сэндвич-ИФА планшет на 96 лунок сначала покрывают первичными антителами, которые распознают целевой белок.

В данном эксперименте среды клеточных культур, полученные из линий клеток человека, продуцирующих антитела, были нанесены автоматизированной системой на 96-луночные планшеты, предварительно покрытые первичными антителами, распознающими человеческие антитела.

После отмывки избытка образца раствором PBS добавляют вторичные антитела, конъюгированные с ферментом, а затем — колориметрический субстрат.

Затем измеряют оптическую плотность так же, как при типичном ИФА. Например, в данном эксперименте данные ИФА будут использованы для определения того, какие клеточные линии продуцируют человеческие антитела с наивысшим аффинитетом, то есть с лучшей способностью точно связываться со своим целевым антигеном.

Доступный в продаже тест на беременность представляет собой один из видов сэндвич-ИФА.

Когда моча потенциально беременной женщины добавляется в тест, конъюгированные с ферментом первичные антитела, прикрепленные к тесту, связывают гормон беременности hCG, если он присутствует. Если женщина беременна, при распознавании первичных антител вторичными антителами, связанными с субстратом в зоне теста, произойдет ферментативная реакция с субстратом, и появится цветная линия.

Другим типом ИФА является конкурентный ИФА, который может быть использован для обнаружения присутствия антител.

Если интересующие антитела присутствуют в образце, они свяжутся с целевым белком, прикрепленным к дну лунки. Позже, при добавлении в лунку конъюгированных с ферментом детектирующих антител, эти антитела обнаружат мало белков для связывания или не обнаружат их вовсе; они будут «вытеснены» интересующими антителами из экспериментального образца.

Таким образом, при конкурентном ИФА окрашенные лунки указывают на образцы, которые фактически не содержат интересующих антител! Образцы плазмы пациентов обычно анализируют методом конкурентного ИФА, чтобы определить, присутствуют ли в образце антитела к определенным патогенам, таким как вирус ВИЧ.

Вы только что посмотрели вводное видео JoVE по проведению ИФА. В этом ролике мы рассмотрели: что представляет собой ИФА и как этот метод работает; какое оборудование и реагенты понадобятся для проведения анализа; а также некоторые варианты применения данного метода. Спасибо за просмотр, и помните, что нельзя допускать чрезмерного проявления вашего субстрата!