Данио рерио желудочков мозга инъекций

Эта процедура начинается с постановки эмбрионов рыбок данио. Когда эмбрионы достигли стадии интереса, извлеките их из кориона. Затем в покрытой аросом чашке с наконечником для пипетки создаются отверстия для крепления эмбрионов, и эмбрионы аккуратно помещаются в отверстия хвостами вниз.

После того, как эмбрионы установлены, флуоресцентная матрица осторожно вводится в желудочковое пространство эмбриона через задний мозг. После инъекции желудочка эмбрионы визуализируются и данные обрабатываются с помощью фотошопа. Здравствуйте, я Дженнифер Гутман из лаборатории доктора Хейзел Сив в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда в Массачусетском технологическом институте в Кембридже, штат Массачусетс.

Сегодня мы покажем вам процедуру инъекции мозгового желудочка рыбок данио-рерио. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения формирования желудочков головного мозга и морфогенеза нейроэпителия у живых рыбок данио. Из-за природы прозрачных эмбрионов рыбок данио, характеристика формы желудочков мозга может быть затруднена.

Этот метод является полезным и простым способом дифференцировать заполненное жидкостью пространство от окружающих тканей и охарактеризовать мутантные эмбрионы, которые могут иметь дефекты формирования желудочков мозга. Итак, приступим. Чтобы подготовиться к инъекции желудочка мозга рыбки данио-рерио, мы начинаем с изготовления инъекционных игл.

Поляра иглы инструмента Саттера используется для вытягивания капиллярных игл. Затем капиллярная игла заполняется флуоресцентным красителем, таким как техасский красный декстрин. Далее наполненная игла монтируется в микроманипулятор в аппарат для микроинъекций.

Обрежьте иглу по соответствующему размеру под углом. Чтобы создать скошенный кончик, измерьте размер капли иглы и убедитесь, что он составляет от одного до двух нанолитров на инъекцию в масле. Чтобы начать этот этап процедуры, эмбрионы, по мнению Киммеля, во все эмбрионы должны быть введены на 30 минут раньше, чем интересующая стадия.

Например, для изучения желудочков через 24 часа после оплодотворения вводят эмбрионы через 23 с половиной часа после оплодотворения. Эмбрион на интересующей стадии помещают под стереомикроскоп, а корион аккуратно извлекают из эмбриона с помощью щипцов. Затем изготавливается чашка арос для эмбрионов с использованием пластиковой чашки, покрытой 1% отверстиями для отверстий в аросе с пластиковым наконечником объемом от одного до 200 микролитров пипетки.

Осторожно извлеките пробки из отверстий с помощью щипцов. Переложите зародыш и среду для зародышей в чашку с отверстиями. Добавляйте трику в среду, чтобы обезболить эмбрион и предотвратить движение.

Во время эксперимента аккуратно поместите хвост эмбриона вниз в отверстие и сориентируйте его так, чтобы инъекционный аппарат находился на задней стороне эмбриона. Теперь, когда эмбрион размещен и правильно ориентирован в возникшей чашке, мы готовы к инъекции желудочка мозга. Во-первых, организуйте настройку микроманипуляций так, чтобы кончик иглы находился в том же поле зрения, что и эмбрион на высокой мощности.

Осторожно введите иглу через тонкую верхнюю пластину заднего мозга прямо позади R нуля R на одну шарнирную точку, не задев ткани мозга ниже, введите ровно столько красителя, сколько нужно, чтобы полностью заполнить желудочки. Может потребоваться несколько инъекций, чтобы заполнить пространство желудочка в зависимости от стадии эмбриона. Когда эмбрион был введен и готов к визуализации, готовится новая чашка для эмбриона.

Используя чистую посуду, покрытую 1%-ным покрытием, проделайте отверстия в посуде и удалите пробки. Переложите эмбрион в чашку и добавьте трику, чтобы обезболить эмбрион и предотвратить движение. Поместите хвост желудочка введенного эмбриона в отверстие в положении для дорсального изображения.

Теперь эмбрион готов к визуализации. Сделайте снимок с использованием проходящего света. Очень важно не перемещать эмбрион или микроскоп.

Далее измените настройки на микроскопе и сделайте снимок с флуоресцентным светом. Измените положение эмбриона для получения боковых изображений как в проходящем, так и в флуоресцентном свете. Сохраните все изображения как файлы для обработки изображений в Photoshop.

Чтобы обработать изображения в Photoshop, откройте изображения в проходящем и флуоресцентном свете одного и того же эмбриона, сделанные в одном и том же положении. Убедитесь, что все настройки одинаковы Для каждого изображения перетащите флуоресцентное изображение на изображение проходящего света и выровняйте их точно по выбранному флуоресцентному изображению. Выберите корректировки изображения, а затем замените цвет и измените черный фон на белый.

В окне замены цвета отрегулируйте коэффициент нечеткости вправо до тех пор, пока флуоресцентное изображение не будет выглядеть однородным по цвету. В окне слоев выберите «Умножить». Для просмотра наложенных изображений изображение пространства желудочка должно совпадать с изображением проходящего света. Совершенно верно.

Сохраните этот файл и повторите для любых других изображений. Если инъекция желудочка выполнена правильно, изображения должны иметь острые края недиффузного красителя, как показано на этих изображениях за 25 часов. После оплодотворения при типе эмбрионов на панели A отображается изображение в светлом поле, на панели B показано флуоресцентное изображение, а на панели C отображается наложенное изображение.

Боковой вид наложенного изображения показан на панели D. С другой стороны, если во время инъекции в желудочек игла будет введена слишком далеко, она войдет в ткани мозга ниже пространства желудочка и приведет к неправильной инъекции. В результате краситель виден за пределами желудочка и в желтке, как показано здесь. На панели E показано изображение светлого поля.

На панели F отображается флуоресцентное изображение, а на панели G — наложенное изображение. Вид сбоку наложенного изображения показан на панели H. Стрелки указывают области, где краситель вышел за пределы пространства желудочков мозга. В этом видео мы продемонстрировали, как вводить флуоресцентный краситель в желудочки мозга развивающихся рыбок данио

Этот метод используется для визуализации пространства желудочков мозга в отличие от окружающего нейроэпителия и чрезвычайно полезен для определения формы пространства желудочка, а также формы окружающих тканей мозга. Эта методика позволяет нам лучше понять процесс формирования желудочков мозга и морфогенез мозга с течением времени у живого эмбриона. Это отличный инструмент для изучения дефектов формирования желудочков мозга, а также для первичной характеристики мутантов морфогенеза мозга.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.