Данио рерио желудочков мозга инъекций

Данная процедура начинается с определения стадии развития эмбрионов zebrafish. Когда эмбрионы достигают интересующей стадии, их извлекают из хориона. Затем с помощью наконечника пипетки в чашке с покрытием из agarose создаются отверстия для монтажа эмбрионов, после чего эмбрионы осторожно помещаются в эти отверстия хвостами вниз.

После закрепления эмбрионов в желудочки мозга эмбриона через задний мозг аккуратно вводится флуоресцентный краситель. После инъекции в желудочки проводят получение изображений эмбрионов, а затем обрабатывают данные в программе Photoshop. Здравствуйте, я Дженнифер Гутман из лаборатории доктора Хэзел Сив в Институте биомедицинских исследований Уайтхеда при Массачусетском технологическом институте (MIT) в Кембридже, штат Массачусетс.

Сегодня мы продемонстрируем процедуру инъекции в желудочки головного мозга рыбки-зебра. В нашей лаборатории данный метод используется для изучения формирования желудочков мозга и морфогенеза нейроэпителия у живых особей zebrafish. Из-за прозрачности эмбрионов рыбки-зебры характеризация формы желудочков мозга может быть затруднена.

Данная методика представляет собой полезный и простой способ дифференцировать заполненное жидкостью пространство от окружающих тканей, а также охарактеризовать эмбрионы мутантов, которые могут иметь дефекты формирования желудочков головного мозга. Итак, приступим. Чтобы подготовиться к инъекции в желудочек головного мозга рыбки данио-рерио, мы начнем с изготовления инъекционных игл.

Для вытягивания капиллярных игл используется пуллер Sutter. Затем капиллярная игла заполняется флуоресцентным красителем, например, Texas red dextrin. После этого заполненная игла устанавливается в микроманипулятор аппарата для микроинъекций.

Отрежьте иглу под углом до достижения подходящего размера. Чтобы создать скошенный кончик, измерьте объем капли иглы и убедитесь, что он составляет от 1 до 2 нанолитров за одну инъекцию в масле. Для начала данного этапа процедуры эмбрионы, согласно Киммелю, должны быть инъецированы за 30 минут до достижения интересующей стадии развития.

Например, для изучения желудочков через 24 часа после оплодотворения проведите инъекцию эмбрионов через 23,5 часа после оплодотворения. Эмбрион на интересующей стадии помещают под стереомикроскоп, после чего с помощью пинцета осторожно удаляют хорион. Далее подготавливают чашку с агарозой для эмбрионов, используя пластиковую чашку, покрытую 1% агарозой; в агарозе с помощью наконечника пластического дозатора на 200 µL делают отверстия.

Осторожно извлеките пробки aros из отверстий с помощью пинцета. Перенесите эмбрион и среду для эмбрионов в чашку aros с отверстиями. Добавьте в среду trica, чтобы анестезировать эмбрион и предотвратить его движение.

В ходе эксперимента осторожно поместите эмбрион хвостом вниз в отверстие и сориентируйте его так, чтобы инъекционный аппарат находился с задней стороны эмбриона. Теперь, когда эмбрион правильно размещен и сориентирован в чашке Арозе, можно приступать к инъекции в желудочки головного мозга. Сначала настройте систему микроманипуляции таким образом, чтобы кончик иглы находился в том же поле зрения, что и эмбрион, при большом увеличении.

Осторожно введите иглу через тонкую пластинку крыши заднего мозга сразу позади шарнирной точки R0–R1, не задевая нижележащую ткань мозга, и введите достаточное количество красителя для полного заполнения желудочков. В зависимости от стадии развития эмбриона для заполнения пространства желудочков может потребоваться несколько инъекций. После проведения инъекции, когда эмбрион готов к визуализации, подготавливают новую чашку Ароса для эмбриона.

Используя чистую чашку с 1% покрытием из арос, проделайте в ней отверстия и удалите пробки. Перенесите эмбрион в чашку и добавьте трикаин, чтобы анестезировать эмбрион и предотвратить его движение. Поместите хвост эмбриона с инъекцией в желудочек в отверстие так, чтобы обеспечить позиционирование для получения дорсального изображения.

Теперь эмбрион готов к визуализации. Сделайте снимок в проходящем свете. Крайне важно не перемещать ни эмбрион, ни микроскоп.

Затем измените настройки микроскопа и сделайте снимок в флуоресцентном свете. Переместите эмбрион, чтобы сделать боковые снимки как в проходящем, так и в флуоресцентном свете. Сохраните все изображения в виде файлов для последующей обработки в Photoshop.

Для обработки изображений в Photoshop откройте снимки одного и того же эмбриона, полученные в одном и том же положении при проходящем и флуоресцентном освещении. Убедитесь, что все настройки идентичны. Для каждого изображения перетащите снимок с флуоресценцией на снимок с проходящим светом и точно совместите их, выбрав изображение с флуоресценцией. Выберите «Коррекция» (Image adjustments), затем «Заменить цвет» (Replace color) и измените черный фон на белый.

В окне замены цвета перемещайте ползунок «размытость» (fuzziness) вправо до тех пор, пока цвет на флуоресцентном изображении не станет однородным. В окне слоев выберите режим «умножение» (multiply). Чтобы просмотреть совмещенные изображения, изображение пространства желудочков должно точно совпадать с изображением, полученным при проходящем свете.

Сохраните этот файл и повторите процедуру для всех остальных изображений. При правильном выполнении инъекции в желудочек края зоны распределения красителя должны быть четкими, как показано здесь на изображениях эмбрионов дикого типа через 25 часов после оплодотворения: на панели A представлено изображение в светлом поле, на панели B — флуоресцентное изображение, а на панели C — совмещенное изображение.

Боковой вид совмещенного изображения показан на панели D. С другой стороны, если при инъекции в желудочек игла будет введена слишком глубоко, она проникнет в ткани мозга ниже пространства желудочка, что приведет к неправильному введению препарата. В результате краситель будет виден за пределами пространства желудочка и в желтке, как показано здесь. На панели E представлено изображение в светлом поле.

На панели F представлено флуоресцентное изображение, а на панели G — совмещенное изображение. Боковой вид совмещенного изображения показан на панели H. Стрелки указывают области, где краситель вышел за пределы пространства желудочков головного мозга. В данном видео мы продемонстрировали способ введения флуоресцентного красителя в развивающиеся желудочки мозга zebrafish.

Данный метод используется для визуализации пространства желудочков головного мозга на фоне окружающего нейроэпителия и крайне полезен для определения формы желудочкового пространства, а также формы окружающей ткани мозга. Эта техника позволяет лучше понять процесс формирования желудочков головного мозга и морфогенез мозга в динамике у живого эмбриона. Она является отличным инструментом для изучения дефектов развития желудочков мозга и первичной характеристики мутантов с нарушениями морфогенеза мозга.

На этом всё. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.