Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов с Четыре фактора транскрипции, доксициклин индуцибельной лентивирусов системы трансдукция

Здравствуйте, меня зовут Брэд Хэмилтон. Я работаю в отделе исследований и разработок компании STEM Gen. Сегодня мы продемонстрируем процедуру получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из эмбриональных фибробластов мыши.

Данную процедуру можно использовать как для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, так и для изучения процесса репрограммирования. Приступим к работе. Начните с посева эмбриональных фибробластов мыши (MEF-клеток) в чашку диаметром 15 см, покрытую желатином, с плотностью 4 × 10⁵ клеток на чашку.

Теперь добавьте 30 мл среды для роста meth и инкубируйте клетки в течение двух дней при 37 °C и 5% CO2 до достижения примерно 80% конфлюэнтности. По завершении инкубации аспирируйте среду и добавьте 30 мл среды для роста, дополненной концентрированным лентивирусом.

Осторожно покачайте чашку, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2 до завершения вирусной трансдукции. Перейдем к перепрограммированию, индуцированному доксициклином.

Для начала перепрограммирования через 20–24 часа после трансдукции обработайте трансдуцированные клетки трипсином и центрифугируйте их при 200 G в течение пяти минут. Затем осторожно аспирируйте среду с осадка клеток и ресуспендируйте клетки в ростовой среде. После суспендирования высейте трансдуцированные клетки в концентрации, соответствующей размеру используемой чашки для культивирования.

Для экспериментов по определению эффективности репрограммирования и изоляции колоний иПК мы используем 2,5 × 10⁵ клеток на чашку диаметром 10 см, а для иммунохимических экспериментов — 2 × 10⁴ клеток на лунку в 4-луночных планшетах. Для мониторинга эффективности трансдукции инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. На данном этапе клетки при необходимости можно заморозить в жидком азоте для последующего анализа.

На следующий день аспирируйте среду и замените ее свежей ростовой средой, дополненной доксициклином до конечной концентрации 2 µg/mL. В качестве отрицательного контроля используйте среду без доксициклина. В завершение инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2.

Мы запустили процесс репрограммирования. Как правило, колонии плюрипотентных стволовых клеток достигают размера, достаточного для изоляции, через 16–22 дня.

Прежде чем продемонстрировать эту процедуру, необходимо проверить эффективность трансдукции с помощью химических методов анализа. Иммунохимическое тестирование проводится на клетках, перенесенных в четырехлуночные планшеты через 48 часов после индукции доксициклином. Все объемы, указанные в данном протоколе, следует корректировать в зависимости от размера планшета для культивирования клеток; начните с осторожного промывания клеток.

После промывки в PBS, не содержащем ионов магния или кальция, зафиксируйте клетки, добавив 500 µL 4% параформальдегида в PBS, и выдержите в течение 15 минут. При комнатной температуре осторожно промойте клетки в PBS еще два раза. Затем пермеабилизуйте клетки, добавив 500 µL ледяного 0,2% Tween 20 в PBS, и инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.

После еще двух промывок клеток добавьте 200 µL блокирующего буфера на один час при комнатной температуре для блокирования неспецифического связывания антител. Затем добавьте 200 µL соответствующего первичного антитела.

Здесь мы используем маркеры плюрипотентности T 4K LF four, SOX two и cmic. Инкубируйте клетки в течение ночи при 4 °C. На следующий день, осторожно промыв клетки дважды раствором PBS, инкубируйте их с 200 µL вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре, защищая планшеты от света.

Здесь мы используем соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с флуорофорами, для визуализации с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа после инкубации. Промойте клетки еще дважды, затем добавьте DPI и снова инкубируйте в течение 10 минут для визуализации ядер. Наконец, после последнего промывания, добавьте антифейд-реагент для заключения препаратов перед визуализацией клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа для определения эффективности трансдукции.

Приступите к изоляции и экспансии плюрипотентных стволовых клеток. После инициации процесса репрограммирования ежедневно контролируйте состояние культур и заменяйте соответствующую среду каждые 48 часов. Для культивирования клеток в течение первых 12 дней мы используем среду с добавлением доксициклина, после чего доксициклин из среды удаляют.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или колонии ИПСК, отобранные вручную для экспансии, представляют собой доксициклин. За отдельными клетками следует наблюдать ежедневно на предмет морфологических изменений, свидетельствующих о процессе репрограммирования. Каждый эксперимент будет индивидуальным, однако обычно колонии достигают достаточного размера для изоляции в период от 16 до 22 дней после индукции DS, за день до начала процесса изоляции и трипсинизации репрограммированных колоний.

Подготовьте 24-луночный планшет, высеяв в него гамма-облученный фидерный слой МЭФ с плотностью 5 × 10⁴ клеток на лунку. Инкубируйте клетки в течение ночи при 37 °C и 5% CO2. На следующий день вручную выберите каждую колонию ИПСК и подвергните ее трипсинизации для диссоциации клеточных агрегатов. Перенесите клетки ИПСК в среду для мышиных эмбриональных стволовых клеток в отдельные лунки подготовленного 24-луночного планшета и инкубируйте клетки при 37 °C и 5% CO2.

Смену среды среды следует проводить каждые 24 часа. Ежедневно контролируйте рост колоний ИПС и флуоресценцию GFP. Мы инкубировали наши культуры в течение шести дней перед переносом в 4-луночные планшеты для анализа плюрипотентности.

Определите, в каких лунках 24-луночного круглого планшета наблюдается равномерная экспрессия GFP. Лунки с хорошей экспрессией GFP можно трипсинизировать и пересеять в соотношении от 1:8 в 4-луночные планшеты, предварительно подготовленные слоями облученных гамма-излучением фидерных клеток мыши. Эти планшеты затем могут быть использованы для иммуноцитохимического (ИЦХ) анализа на плюрипотентность для начала анализа плюрипотентности. Осторожно промойте клетки дважды с помощью PBS, не содержащего ионов магния или кальция.

Добавьте в каждую лунку по 0,5 миллилитра ледяного 0,2% раствора между 20 в PBS и инкубируйте клетки в течение 10 минут. После трех дополнительных промывок в PBS заблокируйте неспецифическое связывание, добавив 200 микролитров блокирующего буфера, и выдержите в течение одного часа при комнатной температуре. Затем добавьте 200 микролитров соответствующей первичной антитела.

Здесь мы использовали SSEA-1, Nanog и OCT4; инкубировали клетки в течение ночи при 4 °C. После осторожного двукратного промывания клеток инкубировали их с 200 µL вторичных антител в течение одного часа при комнатной температуре в защищенном от света месте. Здесь мы используем соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с Fluorophore, для визуализации с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа; после еще двух промывок добавляли DPI и инкубировали клетки в течение 10 минут.

Теперь после заключительной промывки добавьте среду для заключения образцов Antifade aqua mount перед визуализацией клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа. Колонии IPS также можно анализировать на активность щелочной фосфатазы, используя имеющиеся в продаже наборы. Набор индуцибельного мышиного TF лентивируса StemGent Docs может быть использован для репрограммирования MES в IPS-клетки после трансдукции MES для экспрессии факторов транскрипции.

T four, SOX two, KLF four и seic могут обнаруживаться в клетках, обработанных доксициклином, тогда как в необработанных клетках их экспрессия практически отсутствует или не обнаруживается. Со временем морфологические изменения будут прогрессировать, что приведет к образованию более крупных колоний, напоминающих ЭСК, с четкими краями и трехмерным ростом. При удалении доксициклина в некоторых колониях, напоминающих ЭСК, наблюдается заметный возврат к исходной морфологии клеток.

Тем не менее, многие колонии сохранили морфологию IPS. При выделении и пассировании эти колонии IPS демонстрируют типичную экспрессию маркеров плюрипотентности: щелочной фосфатазы, nano T four и SSEA one.

Тип клеток мезенхимы, использованный в данном эксперименте, экспрессировал GFP из эндогенного локуса nag. Таким образом, при перепрограммировании в состояние плюрипотентности экспрессия GFP может служить предварительным индикатором успешного процесса. Мы только что продемонстрировали вам способ перепрограммирования эмбриональных фибробластов мыши в индуцированные плюрипотентные стволовые клетки с помощью доксициклин-индуцибельной антивирусной системы, экспрессирующей четыре фактора транскрипции.

При выполнении данной процедуры важно помнить, что при планировании экспериментов по репрограммированию следует учитывать несколько переменных для оптимизации эффективности процесса. Во-первых, на этапе первичного заражения можно изменить соотношение активного вируса к клеткам-мишеням, чтобы повысить или понизить эффективность трансдукции, тем самым влияя на количество интегрированных вирусов в популяции клеток-мишеней. Во-вторых, корректировка времени воздействия на клетки может повлиять на количество образовавшихся колоний iPS.

В-третьих, на перепрограммирование может влиять пролиферативная способность целевых клеток, поскольку клетки, которые активно растут и делятся, более восприимчивы к этому процессу. Наконец, при модификации протокола для другого количества клеток или чашек для культивирования тканей другого размера рекомендуется пропорционально площади поверхности чашки корректировать количество целевых клеток. На этом всё.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.