Генерация индуцированные плюрипотентные стволовые клетки путем перепрограммирования мышиных эмбриональных фибробластов с Четыре фактора транскрипции, доксициклин индуцибельной лентивирусов системы трансдукция

Здравствуйте, меня зовут Брэд Гамильтон. Сегодня мы покажем вам процедуру создания индуцированных плюрипотентных стволовых клеток из эмбриональных фибробластов мыши.

Эта процедура может быть использована как для получения индуцированных плюрипотентных стволовых клеток, так и для изучения процесса перепрограммирования. Итак, приступим. Начните с посева эмбриональных фибробластов мыши, или метамфетаминовых клеток, на 15-сантиметровую чашку, покрытую желатином, с плотностью в четыре раза больше 10 пятых клеток на чашку.

Теперь добавьте 30 миллилитров среды для выращивания метамфетамина и инкубируйте клетки в течение двух дней при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа, пока они не станут примерно на 80% сливающимися. По окончании инкубации отсасывают среду и добавляют 30 миллилитров прироста. Среду дополняют концентрированным лентивирусом.

Осторожно покачивайте тарелку, чтобы обеспечить равномерное распределение среды. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислом газе с полной вирусной трансдукцией. Перейдем к перепрограммированию, индуцированному доксициклином.

Чтобы начать перепрограммирование через 20-24 часа после трансдукции, трипсин представляет собой трансдуцированные клетки и центрифугирует их при 200 G в течение пяти минут. Затем осторожно отсасывайте среду из клеточной гранулы и ресуспендируйте клетки в питательной среде. После суспензии семена трансдуцируются mes в концентрации, соответствующей размеру чашки для клеточной культуры, которую вы используете.

Здесь мы используем 2,5 умножить на 10 до пятой клетки на 10-сантиметровую чашку для экспериментов по перепрограммированию эффективности и выделению колоний IPS и два раза по 10 до четвертой клетки на лунку в четырех луночных планшетах для иммунохимических экспериментов. Чтобы контролировать эффективность трансдукции, инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На этом этапе клетки могут быть заморожены в жидком азоте для последующего анализа, если это необходимо.

На следующий день отсадите среду и замените ее свежей средой для роста, которая была дополнена доксициклином до конечной концентрации два микрограмма на миллилитр. Мы включаем отрицательный контроль, содержащий среду без доксициклина. Наконец, инкубируйте клетки при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа.

Мы инициировали процесс перепрограммирования. Вообще. Колонии плюрипотентных стволовых клеток будут достаточно велики для изоляции через 16-22 дня.

Прежде чем мы продемонстрируем эту процедуру, нам нужно сначала проверить эффективность трансдукции с помощью химии, чтобы определить эффективность трансдукции. Иммунохимическое тестирование проводят на клетках, реплаированных в четырех луночных планшетах, через 48 часов после индукции доксициклина. Все объемы, перечисленные в этом протоколе, должны быть отрегулированы в соответствии с размером клеточной культуральной пластины, начните с осторожной промывки клеток.

После того, как PBS не содержит ионы магния или кальция, зафиксируйте клетки 500 микролитрами 4%-ного параформного альдегида в PBS на 15 минут. При комнатной температуре еще раз аккуратно промойте клетки два раза PBS. Далее проникните в клетки, добавив 500 микролитров ледяного 0,2%. Твин 20 в PBS инкубируйте в течение 10 минут при комнатной температуре.

После промывки клеток еще два раза. Добавьте 200 микролитров блокирующего буфера на один час при комнатной температуре, чтобы блокировать связывание неспецифических антител. Теперь добавьте 200 микролитров нужного первичного антитела.

Здесь мы используем маркеры плюрипотентности T 4K LF 4, SOX 2 и cmic. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре четыре градуса Цельсия на следующий день. Аккуратно промыв клетки два раза PBS, инкубируйте их с 200 микролитрами вторичного антитела в течение одного часа при комнатной температуре, защищая пластины от света.

Здесь мы используем соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с флюорочетверами для визуализации, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа после инкубации. Промойте клетки еще два раза, а затем добавьте DPI и снова инкубируйте в течение 10 минут, чтобы визуализировать ядра. Наконец, после последнего промывки, добавьте antifa aqua mount перед визуализацией клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа, чтобы определить эффективность трансдукции.

Начать выделение и экспансию плюрипотентных стволовых клеток. После запуска процесса перепрограммирования контролируйте культуры каждый день и заменяйте соответствующую среду каждые 48 часов. Мы используем среду с добавлением доксициклина для культивирования клеток в течение первых 12 дней, а затем удаляем доксициклин из среды в среду.

Индуцированные плюрипотентные стволовые клетки или колонии IPS, отобранные вручную для экспансии, представляют собой доксициклин. Независимые клетки должны ежедневно контролироваться на предмет морфологических изменений, указывающих на процесс перепрограммирования. Каждый эксперимент будет отличаться, но колонии, как правило, достаточно велики для изоляции в период от 16 до 22 дней после индукции DS, за день до начала процесса изоляции и перепрограммирования колоний, перепрограммированных трипсином.

Подготавливают 24-луночную пластину путем засева гамма-облученным питательным слоем метов с плотностью пять умно-10 на четвертую ячейку на лунку. Инкубируйте клетки в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. На следующий день вручную отобрать каждую колонию IPS и попытаться анизировать ее для диссоциации клеточных агрегатов, перегнать клетки IPS в среду эмбриональных стволовых клеток мыши в отдельных лунках предыдущей 24-луночной пластины, инкубировать клетки при 37 градусах Цельсия и 5% углекислого газа.

Смена носителя каждые 24 часа. Ежедневно контролируйте колонии IPS на предмет роста и флуоресценции GFP. Мы инкубировали наши культуры в течение шести дней перед упаковкой в четырехлуночные планшеты для анализа плюрипотентности.

Определите, какие лунки из 24 колесных пластин равномерно экспрессируют GFP, которые имеют хорошую экспрессию GFP, могут быть триппами, интенизированными и проходящими от одного до восьми в четыре луночные пластины, которым предшествовали гамма-облученные питательные слои ME. Эти пластины затем можно использовать для анализа ICC на плюрипотентность, чтобы начать анализ плюрипотентности. Дважды аккуратно промойте клетки PBS, не содержащим ионов магния или кальция.

Добавьте 0,5 миллилитра на лунку ледяного 0,2% от 20 до PBS и инкубируйте клетки в течение 10 минут. После еще трех промывок в блоке PBS, неспецифическое связывание с 200 микролитрами блокирующего буфера на один час при комнатной температуре. Теперь добавьте 200 микролитров нужного первичного антитела.

Здесь мы использовали SSEA one nanog и OCT 4 для инкубации клеток в течение ночи при четырех градусах Цельсия. После двух аккуратных промываний клеток инкубируйте их с 200 микролитрами вторичного антитела в течение одного часа при комнатной температуре, держа их вдали от света. Здесь мы используем соответствующие вторичные антитела, конъюгированные с силой флюороса для визуализации, с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа после еще двух промывок, добавляем DPI и инкубируем клетки в течение 10 минут.

Теперь, после окончательной промывки, добавьте antifa aqua mount перед визуализацией клеток с помощью инвертированного флуоресцентного микроскопа. Колонии IPS также могут быть проанализированы на активность щелочной фосфатазы с помощью коммерчески доступных наборов. Набор индуцируемых мышиных лентивирусов TF от стволовых гентов может быть использован для перепрограммирования mes в IPS-клетки после трансдукции экспрессии MES транскрипционных факторов.

T 4, SOX 2, KLF 4 и seic могут быть обнаружены в клетках, обработанных доксициклином, но незначительная экспрессия или ее отсутствие могут быть обнаружены в необработанных клетках. Морфологические изменения будут прогрессировать с течением времени, создавая более крупные и более ES клеточные колонии с определенными границами колонии и трехмерным ростом. Когда docs удаляется, наблюдается заметное изменение клеточной морфологии для некоторых колоний, похожих на ES-клетки.

Тем не менее, многие колонии сохранили свою морфологию IPS. Эти колонии IPS при выборе и прохождении отображаются. Типичная экспрессия маркеров плюрипотентности щелочной фосфатазы, nano T four и SSEA one.

Тип метамфетаминовых клеток, использованных в этом эксперименте, экспрессировал GFP из эндогенного локуса нага. Таким образом, при перепрограммировании в состояние плюрипотентности выражение GFP может быть использовано в качестве предварительного индикатора для успешного перепрограммирования. Мы только что показали вам, как индуцировать перепрограммирование эмбриональных фибробластов мыши, чтобы индуцировать плюрипотентные стволовые клетки, используя противовирусную систему, индуцируемую доксициклином, с четырьмя транскрипционными факторами.

При выполнении этой процедуры важно помнить, что при планировании экспериментов по перепрограммированию следует учитывать несколько переменных для оптимизации эффективности перепрограммирования. Во-первых, можно модифицировать соотношение активного вируса и клеток-мишеней на стадии первичной инфекции для увеличения или уменьшения эффективности трансдукции, тем самым влияя на количество интегрированных вирусов в популяции клеток-мишеней. Во-вторых, корректировка продолжительности времени, в течение которого клетки подвергаются воздействию документов, может повлиять на количество генерируемых колоний IPS.

В-третьих, пролиферативная способность клеток-мишеней может влиять на перепрограммирование, поскольку клетки, которые активно растут и делятся, более поддаются перепрограммированию. Наконец, при модификации протокола для различных номеров клеток или чашек для культуры тканей разного размера рекомендуется, чтобы количество клеток-мишеней было скорректировано пропорционально площади поверхности чашки для культивирования. Вот и все.

Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.