Осмотическое избежании в Caenorhabditis Элеганс: Synaptic функции двух генов, ортологов прав NRXN1 И NLGN1, В качестве кандидатов на аутизм

Здравствуйте, меня зовут Мануэль Руис Рубио на факультете генетики Университета Кордовы в Испании. Мы используем элегантность в качестве экспериментального инструмента В изучении аутизма, используя преимущества охарактеризованной мира нервной системы трех элегантностей. Мы изучаем мутантный мутант нематоды, эффективный в генах, участвующих в нейронных синапсах и связанных с аутизмом.

Рейн-Риганс — это молекулы мембранной адгезии, присутствующие в синаптике. Голова С элегантности содержит амфи, орган чувств нематоды с опосредованными реакциями на различные раздражители, включая осмотическую силу. Amfi состоит из 12 сенсорных нейронов bipo со схожими по росту и одним терминальным действием INAP.

Два из этих нейронов Name A SH, правый и левый, особенно важны для осмотической сенсорной функции. Обнаружение водорастворимого баланса с высокой осмотической силой. Привет, вино Нан Ривер с небесным методом для измерения осмотического избегания в синапсических дефектах мутантов Анса.

Чтобы оценить последствия избегания нейро и нейро высокой осмотической силы, мы сообщили о различном ответе C против мутантов с дефектами в нейронейронных генах с использованием метода, основанного на четырехмолярном растворе фруктозы. Позвоните в день просьбы, приготовьте четырехмолярный бульонный раствор фруктозы с 1% конголезского красного и полностью растворите при комнатной температуре. Кольцевое кольцо диаметром один сантиметр на пластине NGM является сублинией по центру твердой среды.

Использование 15 микролитров красного четырехкоренного раствора фруктозы. Дайте фруктозе впитаться в акр около пяти минут, эксперимент следует проводить вслепую. Пластина, на которой каждый штамм должен быть S eight, должна быть помечена вторым экспериментатором.

СА выполняется с использованием этих отметок, которые они не запрашивают. Когда эксперимент заканчивается примерно за 24 часа до проведения продажи, необходимо отобрать L четыре личинки каждого генотипа и перенести их в планшет AFL NGM, содержащий бактерии кишечной палочки и поддерживающий его при температуре 20 градусов Цельсия на следующий день. Эксперимент следует начинать с молодых людей.

Поместите отдельных червей каждого штамма в круг отдыха и следите за каждым животным до момента его реакции на тиковый барьер. Для получения окончательного результата следует провести 10 животных каждого штамма и минимум три эксперимента-реплики. Те, кто избегает красного кольца шесть раз подряд, классифицируются как обычные.

Те, кто покидает ринг менее чем за шесть попыток, считаются дефектными по чувствительности к осмосу, контрольный штамм должен быть использован в каждом SA Bristol и два животных используются в качестве положительного контроля, потому что они должны избегать кольцевого барьера. Контрольные штаммы реагируют в обратном направлении, когда они обнаруживают осмотический барьер, состоящий из четырех моляров фруктозы. Нейродефицитные мутанты-бомбы имеют поведение, аналогичное этим в отношении одного типа силы.

Однако мутанты с дефицитом NEUR не смогли обнаружить этот осмотический барьер. Двойная мутантная сила автомобиля в различных ативных аллелях neur и nout восстановила фенотип дикого типа, реагирующий на осмотическую силу для получения из пуховых червей с помощью РНК-интерференции, питающих колонии изолятов e. coli HD 11 пяти штаммов, которые были преобразованы с помощью вектора L 44 40, содержащего фрагмент, соответствующий гену-мишени. Бактерии изолируются на LBA или пластине с углекислым газом на следующий день.

Выберите колонию бактерий и введите жидкую среду LV. Продолжайте выращивать около семи часов при встряхивании при 37 градусах. Посмотрите, как эта культура капает на пластину NGM с углеродным потолком и IPTG и вай в течение ночи при комнатной температуре, позволяя бактериям расти и начиная индукцию экспрессии фрагмента целевого гена.

Необходимо использовать положительный и неотрицательный контроль для РНК-интерференции. Эксперименты по кормлению. Отрицательный контроль равен.

I HT 11 пять штаммов, преобразованных с помощью вектора TL 44 40. Положительный контроль ELI HT 11 из пяти клеток трансформируется с помощью вектора L 44 40, содержащего последовательность 22 генов. Локдауном этого гена являются трясущиеся фенотипы, легко различимые под стерильным микроскопом.

День первый. L четырехступенчатые из NGM PLA с бактериями переносятся на пластину с бактериями и Кувейтом при температуре 20 градусов Цельсия в течение 12 часов. Это период голодания.

На следующий день быстрого молодого человека пересадили на тарелку, инокулированную бактериями, экспрессирующими специфический ген-мишень РНК-интерференции. Оставьте около 48 часов при температуре 20 градусов Цельсия для получения потомства F1. Затем соберите несколько взрослых бомб F1 на другую пластину, инокулированную теми же бактериями в течение следующих двух дней.

Отбирать и изолировать молодых взрослых из F два потомства Скоринг по фенотипам Bristol N два дикого типа штамм жира с бактериями происходящей эмпатии. Вектор L 44 40 шел в обратном направлении, когда все было в порядке. Осмотический барьер.

Бристоль И истинно белый тип штамма, питаемый бактериями, экспрессирующими фрагмент гена neur из элегантности, не смог обнаружить пальцы ног для молярных растворов. Тем не менее, неполноценный мутант, неспособный обнаружить осмотический барьер, восстановил эту способность при кормлении бактериями, экспрессирующими фрагмент гена nane From sea elegance. В этом видео мы показываем простой метод, который позволяет изучить влияние генов на реакцию осмотического избегания в морской элегантности.

Кольцо из фруктозы в формальном колготе с конголезским красным используется для анализа реакции бомбы на осмотическую силу. Неврологические дефекты у дефицитных мутантов дефектны в этом ответе, однако у NU-мутантов нет нарушений для обнаружения томо-стресса, проявляющего ответ, аналогичный штамму дикого типа. Это видео показывает, что двойные мутантные штаммы, несущие различные нокаутные аллели в генах ing и высвобождения, восстановили фенотип дикого типа, реагирующий на осмотическую силу.

Эти наблюдения были подтверждены с помощью РНК-интерференции, подхода блокировки питания. Таким образом, штамм дикого типа был нарушен в распознавании осмотического барьера, когда его кормили бактериями, экспрессирующими в соответствии с последовательностью гена ING. С другой стороны, дефектные мутанты, которые не могут обнаружить еще четыре раствора фруктозы, восстановили это поведение, когда их кормили бактериями, экспрессирующими в соответствии с последовательностью гена NNU.

Результаты, показанные в этом эксперименте, указывают на то, что n зрение и neur могут быть вовлечены в синаптическую связь сенсорных нейронов нематоды, а также что они взаимодействуют друг с другом таким образом, что это влияет на синаптическую функцию. Ладно, до свидания и удачи в ваших экспериментах.