Крупномасштабная Нокдаун гена в С. Элеганс Использование дцРНК кормления библиотек для генерации Прочные с потерей функции фенотипов

Общая цель этой процедуры заключается в проведении крупномасштабных РНК-интерференционных экранов в C-элегантности с использованием бактериальной библиотеки DS-РНК для подавления экспрессии генов. Это достигается путем первого культивирования бактериальных клонов из библиотеки DS РНК. В условиях роста, предотвращающих потерю плазмид, начните с дублирования каждой первичной библиотечной пластины, а затем используйте 96-луночную дублирующуюся библиотечную пластину для создания временных стеблей бактерий на агаровых омни-планшетах.

Бактерии из этих омни-планшетов выращиваются в течение ночи в жидкой культуре и затем переносятся на поверхность тарелок для кормления червей. Каждый бактериальный клон из библиотеки несет уникальную D-S-R-N-A, кодирующую плазмиду, которая нацелена на один ген Celgan для нокдауна. Вторым шагом является размещение синхронизированных червячков на подающих пластинах.

Далее червей выращивают в течение нескольких дней во увлажненной камере при температуре 20 градусов по Цельсию. По мере того, как черви питаются бактериями, индуцированные РНК DS высвобождаются в кишечник животного, где они затем распространяются на окружающие ткани, вызывая системные эффекты нокдауна. Заключительным этапом является обследование откормленных животных на предмет фенотипических эффектов, вызванных геноспецифическим нокдауном.

Эти фенотипические анализы используются для идентификации генов, важных для изучаемого биологического процесса. Основное преимущество этой методики перед существующими методами, такими как микроинъекция двухцепочечных РНК в гонаду червя, заключается в ее высокой пропускной способности. Используя библиотеки кормления, мы можем изучить биологическую функцию почти всех генов морского эльгина всего за несколько недель.

Многие лаборатории боролись с этим подходом нокдауна, потому что большинство генов и элегантности C достаточно гапло. Таким образом, нокдаун РНК должен снижать экспрессию генов более чем на 50%, чтобы вызвать потерю фенотипов функции. Чтобы обеспечить надежный нокдаун генов, крайне важно, чтобы все бактерии, скармливаемые червям, экспрессировали двухцепочечную РНК-плазмиду.

Чтобы начать процедуру определения потери плазмид, удалите небольшой образец бактерий, как описано на каждом соответствующем этапе, и добавьте его в 450 микролитров стерильной воды. Используйте 100 микролитров этого разбавленного образца для создания дальнейших серийных разведений с использованием стерильной воды. Тщательно перемешивайте растворы между разведениями.

Распределите по 100 микролитров каждого разбавления на планшеты LB и LB AMP и инкубируйте в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день, определите планшет LB, который содержит от 100 до 500 колоний бактерий. Подсчитайте количество колоний на этой пластине и на соответствующей фунтовой амперной пластине, содержащих такое же разведение бактерий. Определите потерю плазмид с помощью этого уравнения.

Процент бактерий, не содержащих плазмиду, рассчитывается путем вычитания количества колоний на пластине LB amp из числа колоний на пластине LB, деления на количество колоний на пластине LB и умножения на 100 Потеря плазмиды предотвращается путем выращивания бактерий в высоких концентрациях карбонового селлина Для эффективного нокдауна. Проверьте потерю плазмид перед кормлением животных и продолжайте только в том случае, если потеря плазмид составляет менее 15%Начните эту процедуру, удалив дубликаты библиотечных пластин из морозильной камеры с отрицательным температурой 80 градусов Цельсия. Снимите пломбу из фольги, пока культуры еще заморожены.

Установите на место пластины пластиковую крышку и установите дубликаты библиотечных пластин на ровную поверхность для оттаивания при комнатной температуре не дольше 30 минут. Простерилизуйте буккальный репликатор 96 pin. Поместите его в ванну с этанолом, а затем сожгите этанол.

Замазываем кегли с помощью булочки и горелки. Дайте пламени погаснуть, а затем повторите. Контакты чистого репликатора следует промыть дистиллированной водой, а затем стерилизовать перед каждым использованием.

Поместите стерилизованный репликатор в лунки размороженной дубликатной пластины и с его помощью аккуратно перемешайте культуры. Небольшие объемы культуры будут прилипать к штифтам репликатора. Осторожно извлеките репликатор из лунок дубликата пластины и аккуратно прикрепите его булавками к поверхности омни-пластины.

Будьте осторожны, чтобы не проколоть поверхность агара. Оставьте репликатор на поверхности омни-пластины на три-четыре секунды, чтобы бактерии из контактов репликатора перенеслись на поверхность агара. Чтобы предотвратить потерю плазмид на твердых средах, ate содержит два миллиграмма на миллилитр.

Карбоновый селлин. Удалите репликатор и дайте небольшому объему бактериальной культуры впитаться в агар. После того как обе пластины будут продублированы.

Инкубируйте перевернутые омни-планшеты в течение 15-18 часов при температуре 37 градусов Цельсия на следующее утро. Эти омни-планшеты можно использовать либо для инокуляции 96 лунок жидких культур, либо хранить до семи дней при четырех градусах Цельсия. Бактерии для кормления червей готовят в виде жидких культур с использованием бактерий из омни-планшетов с помощью повторяющегося пипеттера и комбинированного наконечника объемом 50 миллилитров, дозируют по одному миллилитру бактериальной питательной среды на каждые два миллилитра.

В глубокой лунке 96-луночного планшета простерилизуйте репликатор и поместите его на поверхность омни-планшета, содержащего колонии бактерий, убедившись, что штифты находятся в контакте с каждой из 96 колоний бактерий. Осторожно переместите репликатор с поверхности омни-пластины в пластину для глубоких лунок, следя за тем, чтобы штифты не царапали стенки глубоких лунок до тех пор, пока они не будут погружены в питательную среду. Чтобы вытеснить бактерии в питательную среду.

Медленно перемещайте репликатор квадратным движением вдоль внутренней стенки пластины глубокого лунного колодца. Будьте осторожны, чтобы не разбрызгать и не загрязнить колодцы. Для каждой 96-луночной скважины глубокого культивирования должны быть включены два регулятора.

Бактерии, экспрессирующие DS РНК в качестве положительного контроля для ожидаемого нокдауна, фенотипа, и бактерии, содержащие пустой вектор DS РНК в качестве отрицательного контроля. Используя стерильную инокуляционную петлю, удалите одну изолированную колонию из положительной контрольной пластины и инокулируйте пустую лунку в глубокую лунку, называемую пластиной. Запишите положение лунки, в которую была сделана прививка.

Повторите для отрицательного контроля. Встряхните глубоколуночные планшеты в горизонтальном положении со скоростью 650 об/мин на микрошейкере при температуре 37 градусов Цельсия на ночь. После ночной инкубации культур бактерии из 96 глубоких луночных планшетов будут перенесены в 12.

Пересадка пластин подачи скважины может производиться по четыре скважины за один раз. Поместите наконечники для пипетки в каждый третий канал 12-канального многоканального дозатора. Извлеките 150 микролитров бактериальной культуры из глубинной луночной пластины и выбросьте на поверхность четырех лунок из 12-луночной подающей пластины.

Важно не прокалывать поверхность агара во время переноса, так как черви будут роть норы и не питаться бактериями, экспрессирующими DS RNA. После переноса каждого набора из четырех лунок замените четыре наконечника пипетки четырьмя новыми стерильными наконечниками для пипеток и засейте следующие четыре лунки подающей пластины, храните засеянные пластины в вертикальном положении в темноте при комнатной температуре в течение ночи, чтобы бактерии могли впитаться в агар. Перед переносом L одну арестованную личинку C. elgan на питательные пластины DS RNA для фильтрации питания.

Необходимо определить концентрацию заранее подготовленных L одной арестованных личинок. Смешайте колбу Эрленмейера, содержащую задержанных L одну личинки, для распределения животных. Затем извлеките аликвоту объемом 10 микролитров и положите по капле на незакрепленную шестисантиметровую пластину NGM.

В четыре-пять опускается вниз по центру тарелки. Убедитесь, что из пипетки удалены все среды. С помощью конца наконечника пипетки распределите точки суспензии червяка, чтобы образовалась одна непрерывная линия жидкости, охватывающая весь диаметр пластины.

С помощью препарирующего микроскопа подсчитывают всех животных, начиная с одного конца линии жидкости и продолжая до другого конца, прежде чем жидкость впитается в пластину и животные рассеются. Это может потребовать постоянной перефокусировки области препарирования, чтобы быть уверенным в том, что ни одно животное не будет пропущено. Повторите эту процедуру подсчета для трех отдельных аликвот по 10 микролитров, чтобы определить среднее количество червей на микролитр суспензии червей и запишите это число непосредственно на колбе Эрленмейера.

Чтобы начать кормление экраном, с помощью суспензии L одной арестованной личинки и стерильной воды приготовят раствор, содержащий 2000 червей на миллилитр. На каждую 12-луночную кормушку потребуется 120 микролитров этой суспензии червей, тщательно перемешанных для обеспечения равномерного распределения животных и перевода животных в стерильный резервуар для пипетирования. С помощью многоканальной пипетки, расположенной с наконечниками в каждом третьем положении, переведите 10 микролитров раствора червя непосредственно на бактериальную лужайку подающих пластин.

Будьте осторожны, чтобы не проколоть поверхность агара, так как черви будут проникать внутрь агара и не питаться бактериями, экспрессирующими D-S-R-N-A. После переноса раствора червя на каждые два ряда подающих пластин перемешайте раствор червя в резервуаре, осторожно выплескивая его по мере оседания червей, быстро осмотрите несколько лунок на ранней стадии под зоной вскрытия, чтобы убедиться, что в каждую скважину попадает от 20 до 30 червей. Как только на всех кормушках появятся черви, храните пластины вертикально во влажной коробке в инкубаторе при температуре 20 градусов Цельсия на следующий день после того, как суспензия червей впитается в пластину, переверните пластины и вернитесь в хьюмидор при температуре 20 градусов Цельсия.

Животных на этих пластинах можно наблюдать через три дня для фенотипов P zero, а затем снова через шесть дней для фенотипов F1. Описанный здесь протокол был использован для тестирования четырех генов нокдауна яйца L 30 и 17, PAT 10, а на четырех яйцах L 30 и на четырех экспрессируются в нервной системе. Pat 10 экспрессируется в мышцах стенки тела, а dumpy 17 экспрессируется в клетках эпидермиса.

Мутанты Erie one Lin 15 B использовались в скрининге из-за их повышенной чувствительности к РНК-интерференции в качестве отрицательного контроля. Червей кормили бактериями, содержащими пустую плазмиду PL 44 40, которая не экспрессировала DS РНК, как ожидалось. У животных, которых кормили бактериями, содержащимися в пустой плазмиде, не наблюдалось никаких морфологических или поведенческих дефектов.

На этой фотографии изображены свободно движущиеся животные, о чем свидетельствует их нормальное положение тела. Черная стрелка указывает на положение молодого взрослого животного. Белая стрелка указывает на положение группы отложенных яиц.

Нормальное поведение червей показано в этом видеоклипе: яйцо L 30 кодирует морскую элегантность, ортолог субъединицы G-белка G альфа Q. Когда L на одной стадии Erie, одну Lin 15 B личинкам кормили бактериями, экспрессирующими яйцо L 30 DS РНК. Личинки выросли и стали взрослыми особями, которые демонстрировали явные дефекты в передвижении и поведении при откладывании яиц. Через три дня 100% животных, получавших DS РНК против яйца L 30, были парализованы и не могли откладывать яйца.

На этой фотографии видно, что все животные приняли жесткий вид, типичный для парализованных животных. Также следует отметить полное отсутствие отложенных яиц на тарелке. Dumpy 17 кодирует белок коллагена, необходимый для формирования кутикулы в море.

Элган и Дампи 17 нулевых мутантов ниже и толще животных дикого типа. В этом эксперименте не наблюдалось никаких морфологических дефектов у животных с нулевым уровнем P, получавших 17 D-S-R-N-A. Тем не менее, 98% животных F1, как показано на этом рисунке, показали слабый фенотип.

Обратите внимание, что взрослые животные в поле, одно из которых отмечено стрелкой, ниже и толще, чем взрослое животное, отмеченное черной стрелкой. На панели А отсутствие низкорослых и толстых животных с нулевым содержанием P указывает на то, что на ранних личиночных стадиях требуется слабая функция гена 17 для правильной морфологии тела. Pat 10 кодирует мышечный белок СА в стенке тела, содержащий четыре мотива ФВ кисти, которые связывают кальций.

В этом исследовании было замечено, что 100% животных Эри, которых кормили РНК Pat 10 DS, были парализованы в течение трех дней и не откладывали яиц, что приводило к летальному фенотипу. Обратите внимание, что, несмотря на то, что животные парализованы, они все еще могут двигать мышцами головы для кормления, о чем свидетельствует очистка от бактерий возле головы, отмеченных стрелкой на четырех кодах, гомеодоменный белок, экспрессируемый в моторных нейронах вентрального спинного мозга и необходимый для правильного синаптического ввода. Choice on four был выбран в качестве тестового гена в этом исследовании, потому что он оказался устойчивым к предыдущим стратегиям кормления DS RNA.

Результаты этого исследования показали, что 62% животных, которых кормили четырьмя бактериями, экспрессирующими DS РНК из библиотечного препарата, показали дефекты в поведении при передвижении по сравнению с животными дикого типа, которые свободно отступают в синусоидальном движении при толчке по голове, четыре нуль-мутанта UNC не отступают, а вместо этого сжимаются, вызывая дорсальный сгибатель. который часто становится настолько экстремальным, что голова и хвост животного соприкасаются, помещая тело в свернутое положение. В этой таблице показан процент животных, которые демонстрируют нуль-подобные фенотипы при введении РНК DS против каждого из четырех протестированных генов. Эти результаты демонстрируют важность удержания плазмид для успеха DS РНК.

Интерференционные экраны: во всех тканях может наблюдаться надежная и высокопроникающая потеря фенотипов функции. Когда все бактерии, которыми кормят червей, экспрессируют DS РНК После освоения вся библиотека кормления может быть проверена одним человеком примерно за два месяца. Чтобы повысить производительность, мы тестируем каждый бактериальный клон только один раз на экране кормления.

Любые гены, идентифицированные при первом прохождении через библиотеку, затем повторно проверяются. В трех экземплярах мы настаиваем на том, что желаемый фенотип наблюдается во всех повторных тестах, чтобы ген был возведен в квадрат как положительный результат. Затем плазмида очищается от бактерий и секвенируется для проверки идентичности закодированного гена.

После того, как ген идентифицирован, мы заказываем L-мутант, если он доступен, и тестируем его на желаемый фенотип, прежде чем выполнять какую-либо дополнительную характеристику гена.