Определение генетических профилей выражения в С. Элеганс Использование Microarray и ПЦР в реальном времени

Общая цель этой процедуры заключается в исследовании профилей экспрессии генов, лежащих в основе многочисленных фенотипов или метаболических путей. Это достигается путем выделения мРНК из двух контрастных штаммов нематоды. Вторым этапом процедуры является синтез CD NA, содержащий либо S SI 3, либо последовательности захвата SFI, и их гибридизация с микрочипом.

Третьим этапом процедуры является гибридизация микрочипа с антизахватными последовательностями, содержащими S SI три и SCIFI fluoro four. Заключительным этапом процедуры является сканирование микрочипа и анализ данных с помощью биоинформационных инструментов, таких как программное обеспечение magic tool. В конечном счете, гены-кандидаты, опосредующие исследуемый биологический феномен, идентифицируются и могут быть проверены и количественно оценены с помощью альтернативных методов, таких как ПЦР в реальном времени.

Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, испытывают трудности, потому что пятнистые нуклеотиды не видны пользователю, поэтому трудно наложить однородную гибридизационную смесь на 23 000 плюс. Уникально напечатанные нуклеотиды Начните со сбора РНК у здоровых синхронизированных нематод. Сначала они промываются и ресуспендируются в 15-миллилитровых пробирках, а гранулированные гранулы червя ресуспендируются в семи миллилитрах 0,1 молярного хлорида натрия и семи миллилитрах ледяного льда, 60% веса сахарозы на объем.

После 15-минутной инкубации на льду червей снова гранулируют. Теперь свободные от бактерий черви будут подплывать, собираться, промывать в РНК, свободной воде и гранулироваться. Опять же, чистая, неплотно спрессованная гранула переносится в микроцентрифужную трубку, вращающуюся на максимальной скорости в течение 30 секунд.

Аспирировали и хранили в 10 объемах РНК позже при температуре четыре градуса Цельсия до тех пор, пока они не были готовы к продолжению. Чтобы получить образцы общей РНК, подготовленные гранулы центрифугируют на максимальной скорости, отбраковывают супернат и добавляют в гранулу щепотку молекулярной смолы. Затем заморозьте смесь с помощью жидкого азота с помощью пестика.

Измельчите замороженную суспензию червя в мелкий порошок и добавьте жидкий азот по мере необходимости, чтобы порошок оставался холодным после измельчения. Положите экстракт на лед на пять минут. Через пять минут смешайте экстракт с 700 микролитрами R-L-T-B-M-E и 472 микролитрами 100% этанола.

В настоящее время РНК может быть выделена с помощью коммерчески доступного набора до конечного объема 60 микролитров выделенной РНК на биологический образец. Прежде чем продолжить, удалите потенциальное загрязнение геномной ДНК с помощью ДНК один, а затем используйте коммерчески доступный набор для очистки РНК. Дополните набор, намекнув на объем 60 микролитров.

Наконец, определяют концентрацию РНК и оценивают целостность РНК путем обработки с помощью загрузки образца глиоксаля, анализа красителя и геля перед гибридизацией микрочипов Используя традиционные методы, очищенную РНК реверсируют, транскрибируют в комплементарную ДНК, которую выделяют из деградированной матрицы с помощью коммерчески доступного набора и наносят объем 60 микролитров. Начните гибридизацию микрочипов, блокируя морскую элегантность. Микрочипированные слайды с ДНК спермы лосося с ультразвуком Через час опрокиньте заблокированные слайды в двойную дистиллированную воду и вращайте.

Высушите предметные стекла в конических пробирках объемом 50 миллилитров, подбитых салфеткой ким. Теперь приготовьте буфер для гибридизации на основе двух х форм амида. Сначала прогрейте его до 55 градусов Цельсия в течение 10 минут, чтобы полностью растворить его кристаллы.

Затем центрифугируйте его в течение одной минуты при 10 000 г. Затем смешайте 25 микролитров CD NA с 25 микролитрами буфера для гибридизации и осторожно перемешайте смесь. Теперь выполните быстрое вращение смеси и инкубируйте ее при температуре 80 градусов Цельсия в течение 10 минут.

После инкубации осторожно нанесите весь образец CDNA на предметное стекло микрочипа, не касаясь предметного стекла. Равномерно распределить образец по предметному стеклу микрочипа. Осторожно опустите защитное стекло на предметное стекло с помощью иглы шприца до того, как оно будет полностью опущено, потяните вверх и снова опустите иглой, позволяя защитному стекло аккуратно встать на место.

Такая методика сводит к минимуму образование пузырьков воздуха. Теперь поместите предметное стекло горизонтально в коническую трубку объемом 50 миллилитров ниже предметного стекла с 50 микролитрами дважды дистиллированной воды и дайте ему инкубироваться в течение ночи при температуре 37 градусов Цельсия на следующий день. Вторая гибридизация проводится на короткое время после промывки предметного стекла.

Многократно в SSC второй буфер, содержащий светочувствительные реагенты захвата и реагент Antifa, наносится по той же методике с последующей короткой инкубацией, еще одной промывкой и сушкой. Затем слайд можно отсканировать. Изображения могут быть проанализированы с помощью бесплатного программного обеспечения с волшебным инструментом с открытым исходным кодом.

Кратко на вкладке проекта создайте и сохраните новый проект на вкладке профиля выражения сборки, выберите загрузить пару образов и выберите красный файл изображения как красный, а зеленый файл изображения как зеленый. Затем выберите вкладку профиля выражения сборки. Выберите Load gene list, чтобы загрузить файл списка генов C elegance, полученный с веб-сайта GCAT, для адресации и сетки изображения микрочипа.

Выберите вкладку профиля выражения сборки и выберите опцию «Создать сетку редактирования». Теперь отредактируйте сетку. Настройте диалоговое окно, используя 48 для количества сеток, 22 строки и 22 столбца для каждой сетки и выбрав нумерацию мест слева направо и сверху вниз.

Увеличьте процентное изменение контраста и увеличивайте масштаб сетки, пока отдельные пятна не станут легко различимыми. Создайте сетки, выбрав верхнюю левую точку на левой панели, а затем кликнув по центру верхней левой точки, за которой следуют верхняя правая точка и нижний ряд на первой сетке. Повторите эту процедуру создания сетки для каждой из 48 сеток, двигаясь слева направо и сверху вниз.

Затем сохраните, выбрав вкладку «Файл», и сохраните текущую сетку как после сохранения. Выберите вкладку «Готово», чтобы удалить все несвязанные пятна из анализа. Откройте вкладку Профиль выражения сборки и в разделе Сетка адресации выберите Точечное пометка.

Теперь отметьте все пятна полос или флуоресценцию фона и сохраните, выбрав «Сохранить текущие флаги». Как и на вкладке файлов, помеченные файлы должны быть сегментированы. Наконец, проанализируйте гены, индуцированные или подавленные определенным фактором, выбрав «Исследовать» на вкладке «Экспрессия».

В диалоговом окне исследования задайте критерии соответствия тонких генов. Количество двукратных увеличений или уменьшений экспрессии. Интенсивность известна как x, а значение X является критерием изменения выражения.

X — входное значение max больше X для индуцированных генов и минимальное значение меньше x для репрессированных генов. В этом эксперименте проводится контроль замены красителя: два независимых выделения общей РНК от личинок третьей и четвертой стадий гибридизуются либо зеленым мутантным и красным диким типом, либо красным мутантным и зеленым диким типом для подтверждения изменений экспрессии генов производят три независимых выделения тотальных РНК с использованием одной и той же процедуры синтезируют CDNA с помощью коммерчески доступного набора. и для каждого образца CD NA провести ПЦР в реальном времени и утроить, используя три гена-домохозяйки в качестве контроля. Для демонстрации следующие результаты исследуют экспрессию генов, индуцированную в VSM one.

Мутанты AK 1468 – штамм нематоды, характеризующийся усиленной синаптической способностью Перед проведением микрочипового анализа качество выделенной РНК проверяют с помощью гель-электрофореза. Наличие двух интактных рибосомных субъединиц до и после одного лечения dase указывает на наличие хорошего образца РНК в микрочипе: CDNA дикого типа помечена красным цветом, а VSM one mutant CD NA помечена зеленым цветом. В этой одной из 48 сеток, проанализированных для каждого микрочипа, каждый маленький квадрат представляет один напечатанный олигонуклеотид в каждом массиве, каждый уникальный олигонуклеотид представлен.

После того, как микрочиповый анализ транскриптов, выделенных из личинок четвертой стадии, показывает, что гены, кодирующие основные белки сперматозоидов или MSP, индуцируются в мутантах VSM one, микрочиповый анализ личинок третьей стадии также выявляет изменения экспрессии в том же семействе генов у мутанта. Тестирование. Прогнозы с помощью микрочипа с помощью ПЦР-анализа в реальном времени показывают, что один из членов семейства генов M ms P, MS P 32, индуцируется в мутантах VSM one. Данные представляют собой среднее значение трех повторений ПЦР в реальном времени из одной и той же коллекции РНК.

После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как обращаться с биоинформационными инструментами для полногеномного анализа, особенно учитывая, что научному сообществу доступно множество биоинформационных программ с открытым исходным кодом.