Адгезии тромбоцитов и статистические Под потоком использованием микрожидкостных Клетки потока

Система bio flux представляет собой автоматизированный прибор и микрофлюидное устройство для проведения анализов живых клеток в условиях контролируемого прозрачного потока. В этой системе используется микрофлюидная технология скважинной пластины для интеграции проточных ячеек микронного масштаба в стандартные скважинные планшеты SBS. BioFlex можно использовать для проведения исследований адгезии и агрегации тромбоцитов с высокой пропускной способностью и уменьшенным объемом крови.

Цельная кровь, меченная флуоресцентным красителем, добавляется в лунки, а затем течет по каналам. При контролируемом прозрачном потоке получаются данные микроскопии с высоким разрешением, которые количественно оценивают адгезию и агрегацию тромбоцитов в присутствии лекарственных соединений и других изменяющихся параметров. Здравствуйте, я Майк Шварц из лаборатории RD в Flexion Biosciences.

Сегодня мы покажем вам процедуру использования микрофлюидных проточных клеток в анализах адгезии тромбоцитов. Мы используем этот протокол в нашей лаборатории для различных анализов сосудистой биологии. Итак, приступим.

Говядина, перед проведением эксперимента с проточной ячейкой, микрофлюидные каналы биофлюсовой пластины должны быть подготовлены с белковой оболочкой, представляющей интерес, коллаген, который будет использоваться в этом эксперименте. Каждый из 24 экспериментальных каналов пластины биофлюса соединяется с входным колодцем и выходным колодцем для этой пластины. Входная лунка находится слева от питательной лунки канала, а выходная лунка находится справа, разбавьте коллаген одним запасом до концентрации 200 микрограмм на миллилитр.

В 0,02 молярной уксусной кислоты потребуется 20 микролитров на каждый используемый канал. Так как для этого эксперимента требуется 11 каналов, сделайте 200 микролитров коллагенового покрытия. Один канал остается без покрытия и смешивается путем аккуратной итерации с помощью наконечника микропипетки.

Добавьте по 20 микролитров покрытия в каждый соответствующий канал с помощью микропипетки, чтобы дозировать жидкость во внутренний пуансон лунки. Питание интересующего микрофлюидного канала, как показано здесь, с помощью желтого красителя включает один канал без коллагена в качестве отрицательного контроля адгезии и агрегации тромбоцитов. После того, как коллагеновое покрытие будет добавлено во все соответствующие каналы, прикрепите интерфейс к пластине.

Если вы используете интерфейс bio flux 1000, вы можете зажать обе защелки на сцене. Если вы используете интерфейс Bio flux 200 первым пальцем, затяните четыре винта. А затем, когда все будет установлено, используйте динамометр для полной затяжки.

Крутящий момент драйвера щелкнет, когда достигнет максимума. Используя ручной режим в программном обеспечении bio flux, нанесите перфузию на интересующие каналы на 2D квадратный сантиметр от выходного отверстия. Используйте маломощный объектив на микроскопе, чтобы найти входной колодец и наблюдать, как противоположный внутренний пуансон заполняется жидкостью.

Сначала вы должны увидеть крошечный кусочек жидкости, медленно заполняющий внутренний пуансон через несколько минут, а когда входной внутренний пуансон заполнится, остановите переполнение всех каналов, нажав кнопку стоп в программном обеспечении. Выдержите тарелку при комнатной температуре в течение одного часа. В течение этого инкубационного периода вы можете начать подготовку цельной крови в конце часовой инкубации.

После того, как кровь будет подготовлена, удалите границу раздела и добавьте один миллилитр PBS плюс ионы кальция и магния на выход. Ну и начните обильность из выходного отверстия с двух обедов на квадратный сантиметр и продолжайте обильность в течение 10 минут. Через 10 минут прекратите обильность После снятия интерфейса удалите излишки PBS из входного и выходного отверстий.

Никогда не удаляйте жидкость, которая заполняет внутренний пуансон. Чтобы перекрыть каналы, добавьте по одному миллилитру раствора для блокировки в каждую розетку. Хорошо использовать перфузию из выходного отверстия на два сантиметра квадрата и продолжать перфузию в течение 10 минут.

Прекратите обильное использование через 10 минут и снимите интерфейс. Теперь каналы готовы и могут использоваться в течение дня, пока пластина покрывается коллагеном. В течение одного часа инкубации свежая человеческая кровь голодающего человека должна быть подготовлена для визуализации и ввода в тарелку.

Кровь должна быть взята в цитрат натрия, антикоагулянт и использована в течение трех часов после сбора. Сначала добавьте в кровь четырехмиллимолярный запас кальция М в ДМСО в разведении от одного до 1000 объема на объем. Для получения четырех микромоляров кальций смешивают путем щадящей инверсии.

Затем раздайте один миллилитр крови с кальцием и меченой кровью в десять микропробирок объемом один целых пять миллилитров. Добавьте ГП, два, В, три антитела-ингибитора в каждую пробирку в желаемом разведении. Обязательно включите отрицательный контроль на отсутствие антител и положительный контроль на неродственные антитела, смешанный с помощью мягкой инверсии.

Инкубируйте пробирки при комнатной температуре в течение одного часа, перемешивая путем осторожной инверсии каждые 10 минут перед проведением эксперимента с проточной ячейкой. В модуле контроля биопотока для коллагена должен быть настроен автоматизированный протокол. Один. Составьте протокол, чтобы кровь прогонялась под углом десять девять сантиметров в квадрате в течение 10 минут от выходного отверстия.

Ну и с помощью рабочей станции BioFlex 1000 должны быть настроены параметры сбора данных, которые включают в себя захват желаемых положений сцены в фитц-диапазоне длины волны и настройку таймлапса. Типичный план получения изображений для этого протокола включает в себя одно поле зрения на канал, которое должно быть захвачено с помощью объектива 10 раз каждые 30 секунд в общей продолжительности 10 минут. Также возможны дополнительные поля обзора и альтернативные настройки TimeLapse.

После настройки автоматического протокола и параметров сбора данных вернитесь к планшету BioFlex и удалите жидкость с обеих сторон канала, за исключением внутренних отверстий. Заботясь о том, чтобы работать быстро, поместите по 500 микролитров крови каждого состояния в выходные лунки каждого канала. Обратите внимание, что выходные лунки используются для доставки крови, потому что это кратчайший путь к зоне обзора и обеспечивает более быструю реакцию крови на коллагеновую оболочку.

Кроме того, поместите контрольную кровь без антител в канал, который покрыт коллагеном и просто заблокирован. Поместите пластину на микроскоп рабочей станции BioFlex 1000 и зажмите интерфейс. Выполните калибровку списка этапов, найдя первую точку калибровки, которая определена как исходная точка.

Затем найдите и отметьте вторую точку калибровки. Примените эту калибровку к соответствующему списку этапов. Это гарантирует, что все места просмотра на табличке могут быть найдены автоматически.

Переместите предметный столик в один из каналов, содержащих набор крови, подгоняет параметры захвата изображения, такие как время экспозиции и усиление в программном обеспечении для монтажа BioFlex. Запустите соответствующий рабочий процесс, нажав на нужную кнопку. Это запустит протокол потока и получение изображения одновременно.

В конце эксперимента снимите пластину с рабочей станции BIOFLU 1000 и утилизируйте ее в соответствии с рекомендациями учреждения. Использование покрытых коллагеном микрофлюидных каналов системы bio flux. Агрессивное тромбообразование наблюдается с течением времени при необработанном контрольном образце крови.

В отличие от этого, при использовании канала без оболочки тромбообразование не наблюдается. В одном из недавно проведенных экспериментов средний размер агрегатов в контрольных условиях составил 2000 микрометров в квадрате. ГП два, В, три А является мощным медиатором взаимодействия тромбоцитов и стабилизации агрегации, когда активируется путем адгезии к коллагену, как показано здесь, после инкубации с антителами против GB, два, В, три А в течение одного часа до чистого воздействия, наблюдается уменьшение размера тромбов, а также снижение частоты образования тромбов.

Дозозависимый ответ обычно можно наблюдать при десяти девяти сантиметрах в квадрате, а значение IC 50 для этого конкретного ингибитора составляло 17 наномоляров. Максимальное ингибирование у этого донора по сравнению с контролем без антител составляло 11% при 10 сантиметрах в квадрате. Пластина с 48 лунками также доступна для проведения экспериментов с цельной кровью с точностью до 200 D на квадратный сантиметр или 5000 обратных секунд.

Мы только что показали вам, как использовать микрофлюидные каналы для проведения физиологически значимых экспериментов по сосудистой биологии. При выполнении этого протокола важно помнить о разбавлении коллагена в правильном буфере. Всегда используйте правильную технику пипетирования, чтобы избежать попадания пузырьков воздуха, и всегда соблюдайте правила биобезопасности вашей лаборатории.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.