Анализ цитоскелета и организации фокальной адгезии: иммунофлуоресцентный метод изучения клеточной адгезии и распространения на субстратах

- Морфология субстрата сильно влияет на поведение раковых клеток и метастатические реакции. Динамическая сеть актинового цитоскелета обеспечивает структурную поддержку клеток и опосредует клеточное движение. Большие мембраноассоциированные белковые комплексы, называемые фокальными адгезиями, соединяют цитоскелет с внеклеточным матриксом, способствуя распространению клеток.

Чтобы начать окрашивание, возьмите культуру раковых клеток и обработайте ее параформальдегидом для фиксации и проникновения клеток. Теперь инкубируйте клетки с реагентом-усилителем сигнала, содержащим белки, чтобы подготовить клетки к снижению фонового окрашивания. Добавьте первичные антитела против винкулина, которые связываются с винкулином, одним из белков в составе комплекса фокальной адгезии.

Затем инкубируйте образец с флуоресцентным вторичным антителом, конъюгированным с красителем, нацеленным на первичное антитело. Наконец, обработайте клетки флуоресцентными мечеными фаллоидиновыми конъюгатами, которые избирательно связываются с актиновыми филаментами цитоскелета. Наблюдайте за клетками под конфокальным лазерным сканирующим микроскопом, чтобы изучить их флуоресцентные сигналы.

Клетки с хорошо распределенной морфологией демонстрируют четко выраженные актиновые волокна и отчетливые и удлиненные винкулинсодержащие фокальные спайки. И наоборот, плохо распределенные клетки не обладают определенными актиновыми филаментами, но демонстрируют точечные винкулин-содержащие фокальные спайки. В следующем протоколе мы продемонстрируем иммунофлуоресцентный анализ для изучения цитоскелета и организации фокальной адгезии в клетках первичного рака толстой кишки.

- Возьмите субстраты, подлежащие иммуноокрашиванию, на ламинарный колпак и удалите питательные среды. Затем промойте субстраты фосфатно-соевым буфером или PBS и зафиксируйте клетки 4% параформальдегидом в PBS на 20 минут при комнатной температуре. Промойте основания PBS в течение пяти минут в общей сложности три раза. Затем инкубируйте субстраты с 500 микролитрами усилителя сигнала в течение 30 минут перед промыванием PBS.

Затем инкубируют клетки с моноклональными антителами к винкулину в разведении от 1 до 250 в PBS в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем промойте основания PBS в течение пяти минут в общей сложности три раза. Инкубируйте образцы с вторичным антителом Alexa Fluor 488 козьего антимышиного IgG в разведении от 1 до 200 в PBS при комнатной температуре в течение 30 минут. Затем снова промойте основание PBS в течение пяти минут в общей сложности три раза.

Чтобы визуализировать структуру F-актина, инкубируйте клетки с конъюгатами тетраметилродамин-фаллоидин в концентрации 50 микролитров на миллилитр в течение 45 минут при комнатной температуре. Затем снова промойте субстраты, как и раньше. Наконец, приступайте к визуализации образцов с помощью конфокального сканирующего лазерного микроскопа.