Адгезия частот для пробирной В Ситу Кинетика Анализ кросс-соединительного молекулярных взаимодействий в клетка-клетка интерфейс

Общая цель следующего эксперимента заключается в измерении кинетики взаимодействия рецептора и лиганда, когда обе молекулы закреплены на поверхностях взаимодействующих клеток. Это достигается путем предварительной функционализации эритроцитов, выступающих в роли сенсоров адгезии, лигандами и подготовки клеток, несущих рецепторы. На втором этапе собирается камера микропипетки и проводятся тесты на адгезию для регистрации событий прикрепления.

Затем строится кривая зависимости вероятности адгезии от времени контакта клеток, которая аппроксимируется с помощью модели. Для оценки кинетических параметров на основе полученных данных рассчитываются двумерная эффективная аффинность связывания и константа скорости диссоциации. Итак, откуда возникла идея этого анализа?

Специалисты изучают взаимодействие рецептора и лиганда. В основном измеряют силы разрыва, и мы занимаемся тем же самым, но однажды мы задумались: можем ли мы просто измерять бинарный результат — ноль при отсутствии адгезии и единица при наличии адгезии — и на основе этих измерений (0 и 1) вывести кинетические показатели, используя метод анализа частоты микропипетирования. Доктор Вероника Зана Зина, научный сотрудник моей лаборатории, продемонстрирует вам этот эксперимент.

Эритроциты, выделенные из цельной крови, биотинилируют для анализа частоты адгезии. Для начала этой процедуры центрифугируйте пробирку с выделенными эритроцитами, перенесите по 10 µL осадка эритроцитов в несколько флаконов и добавьте в каждый флакон соответствующее количество PBS для подготовки нескольких концентраций биотинилирования эритроцитов. Затем добавьте по 10 µL 0.1 M буфера bore eight в каждый флакон.

Затем добавьте расчетное количество раствора биотина в каждый флакон и немедленно перемешайте на вортексе. Поместите каждый флакон с эритроцитами в коническую пробирку объемом 50 мл и инкубируйте на ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре. Через 30 минут добавьте в каждый флакон буфер EAS 45 и центрифугируйте в течение двух минут при 2000 об/мин. Повторите промывку буфером EAS 45 дважды, чтобы в общей сложности было проведено три промывки.

Наконец, добавьте по 100 µL буфера EAS 45 в каждый флакон и храните при 4 °C для функционализации лигандов на поверхности эритроцитов. После того как эритроциты были биотинилированы на предыдущем этапе, их инкубируют с насыщенной концентрацией стрептавидина TTR в течение 30 минут при 4 °C и промывают трижды буфером EAS 45 в течение двух минут при 2000 об/мин. После этого инкубируют эритроциты либо непосредственно с биотинилированным лигандом, либо сначала с соответствующим биотинилированным захватывающим антителом, а затем с лигандами. В протоколе, показанном в данном видео, используется биотинилированное захватывающее антитело.

Микропипетки изготавливают из боросиликатных стеклянных капиллярных трубок с низким температурным пределом плавления. Сначала с помощью микропипетского вытягивателя вытяните капиллярные трубки. Затем, используя микроманипулятор с микрофоржем, обрежьте кончик микропипетки до достижения желаемого размера отверстия.

Требуемый диаметр обычно составляет от одного до пяти микрон в зависимости от размера клеток, используемых в исследовании. Чтобы подготовить клеточную камеру, возьмите два покровных стекла для микроскопа, вырезанных до нужного размера, удалите пыль с покровных стекол с помощью сжатого воздуха, добавьте среду для клеточной камеры и герметизируйте камеру с обеих сторон минеральным маслом, чтобы предотвратить испарение среды. В противном случае в ходе эксперимента изменится осмолярность.

Система микропипетирования, используемая в данном анализе, состоит из трех подсистем: подсистемы визуализации для наблюдения, записи и анализа перемещений клетки, аспирированной микропипеткой; подсистемы микроманипуляции для выбора клеток из камеры и подсистемы давления для аспирации клеток в микропипетки. Центральным элементом подсистемы визуализации является инвертированный микроскоп с масляным иммерсионным объективом с 100-кратным увеличением. Изображения с объектива регистрируются камерой на основе ПЗС-матрицы и передаются на видеомагнитофон.

Для контроля времени к системе подключен видеотаймер. После наполнения микропипетки деионизированной водой поместите ее в держатель на механическом приводе, установленном на микроскопе. Точное позиционирование микропипетки осуществляется с помощью трехкоординатного гидравлического микроманипулятора.

Один из держателей микропипеток установлен на программируемом компьютером пьезоэлектрическом преобразователе. Это позволяет перемещать пипетку с высокой точностью в цикле теста на адгезию. Подсистема регулирования давления используется для управления всасыванием.

В ходе эксперимента гидравлическая линия соединяет держатель микропипетки с резервуаром для жидкости. Прецизионный механический позиционер позволяет точно регулировать высоту резервуара. После сборки камеры устанавливают микропипетки, вводят клетки в камеру для начала анализа, аспирируют взаимодействующие клетки соответствующими пипетками и используют электрический транслятор PSO для перемещения эритроцита к нейтрофилу и обратно с контролируемой площадью и временем контакта.

Событие адгезии фиксируется, когда эритроцит удлиняется при разделении клеток; отсутствие адгезии соответствует отсутствию удлинения эритроцита. Записывайте наблюдаемые события адгезии, ставя единицу при наличии адгезии или ноль при ее отсутствии в столбце таблицы Excel.

Запишите кривую зависимости частоты адгезии от времени контакта, используя не менее трех различных пар клеток для каждого временного интервала. Для получения среднего значения и стандартной ошибки среднего (SEM) в качестве контроля запишите кривую неспецифического связывания, используя эритроциты, покрытые соответствующими лигандами, и/или блокируя лиганды или рецепторы с помощью их специфических функциональных блокаторов. Специфическая частота адгезии для каждой временной точки при использовании моноклональных антител может быть рассчитана путем вычитания частоты неспецифической адгезии.

Данные о частоте специфической адгезии в зависимости от времени контакта аппроксимированы вероятностной моделью, которая описывает одностадийное взаимодействие между одним видом рецепторов и одним видом лигандов с прямой реакцией второго порядка и обратной реакцией первого порядка. В этом уравнении KA представляет собой 2D-аффинность. KA — это 2D-константа скорости диссоциации.

MR и ML — это соответствующие плотности рецепторов и лигандов, а AC — площадь контакта. Аппроксимация кривой имеет два параметра, ac, k, a, и K off, так как AC и KA объединены и совместно называются эффективной 2D-аффинностью; произведение этого значения на константу диссоциации (off rate) представляет собой эффективную 2D-константу ассоциации (on rate): AC K on равно AC KA умножить на K off. Здесь представлен пример определения интегрина alpha L beta two.

Плотность сайта на нейтрофилах. Нейтрофилы сначала инкубировали с E-селектином IG в концентрации 1 µg/mL, после чего добавляли насыщающие концентрации анти-человеческого CD 11, конъюгированного с PE, моноклональное антитело или соответствующий мышиный IgG1 в качестве контроля. После 30 минут инкубации образцы промывали и анализировали на проточном цитофлуориметре со стандартными настройками.

Калибровочные частицы с ярким PE. На панели A представлены гистограммы флуоресценции калибровочных частиц вместе с гистограммами клеток, обработанных и необработанных E selectin IG. Окрашивание специфическими моноклональными антителами к CD 11 A показано сплошными кривыми, а окрашивание соответствующим изотипическим контрольными антителами — пунктирными кривыми.

На панели B показан процесс количественного определения плотности. Рассчитывалось значение Log 10 для средней интенсивности флуоресценции каждой из четырех микросфер. Использовались значение калибровочного пика с панели A и количество молекул PE на одну микросферу для конкретной партии.

Для клеток, прошедших реселекцию, был построен график линейной регрессии логарифма по основанию 10 количества молекул PE на одну бусину в зависимости от логарифма по основанию 10 интенсивности флуоресценции. Значение log 10 fi составило 3,99 (отмечено синим закрашенным кругом) для специфических моноклональных антител и 2,23 (отмечено синим незакрашенным кругом) для контрольных антител. После решения линейного уравнения относительно X общее количество αLβ2 или нейтрофилов было рассчитано и составило 9 587.

Поверхностная плотность была рассчитана и составила 43 сайта на мкм², исходя из диаметра нейтрофила 8,4 мкм. На следующем графике показана динамика частоты адгезии fi для специфического связывания через одну и 10 секунд. Время контакта измерялось в ходе повторяющихся циклов тестов на адгезию между эритроцитами, покрытыми ICAM-1, и нейтрофилами человека, экспрессирующими интеграин альфа L бета два.

Для сравнения здесь представлена частота адгезии fi для неспецифического связывания при времени контакта одна и десять секунд, измеренная в ходе повторных циклов тестов на адгезию между эритроцитами человека, покрытыми IgG, и нейтрофилами человека, экспрессирующими интегрин альфа L бета два. Этот заключительный график иллюстрирует кинетику связывания I A one с интегрином альфа L бета два нейтрофилов; вероятности адгезии, измеренные для трех пар клеток при каждом времени контакта, были усреднены и отложены в зависимости от времени контакта для контроля неспецифического связывания. Использовались два различных условия.

Один: эритроциты, покрытые захватывающими антителами к TFC и инкубированные с человеческим IgG вместо ICAM-1 Ig, и два: нейтрофилы, связывающиеся с эритроцитами, не покрытыми захватывающими антителами. Неспецифическое связывание, зафиксированное в качестве контрольной кривой человеческого IgG, использовалось для получения кривой вероятности специфической адгезии. Применялось ранее представленное уравнение для коррекции неспецифического связывания.

Скорректированная кривая вероятности специфической адгезии была аппроксимирована с помощью подбора модели. Кривая вероятности специфической адгезии позволила определить эффективную аффинность связывания. Значения составили kon = 1.4 × 10⁻⁴ µm⁴ и koff = 0.3 s⁻¹.

После просмотра этого видео вы должны получить четкое представление о том, как измерять кинетику взаимодействия рецептора с лигандом, когда обе молекулы закреплены на поверхностях взаимодействующих клеток. При выполнении данной процедуры важно помнить, что плотность лигандов должна быть подобрана таким образом, чтобы частота адгезии находилась в среднем диапазоне; также помните, что работа с кровью и некоторыми реагентами для специфической обработки, например, азидом натрия и DMSO, может быть крайне опасна. Поэтому необходимо соблюдать меры предосторожности, такие как внимательное изучение паспортов безопасности (MSDS) реагентов и использование перчаток при выполнении данной процедуры.