Адгезия частот для пробирной В Ситу Кинетика Анализ кросс-соединительного молекулярных взаимодействий в клетка-клетка интерфейс

Общая цель следующего эксперимента состоит в том, чтобы измерить кинетику взаимодействия рецепторных лигандов, когда обе молекулы закреплены на поверхности взаимодействующих клеток. Это достигается за счет первичной функционализации эритроцитов, которые являются датчиками адгезии с лигандами и получением рецепторных клеток. На втором этапе собирается камера для микропипеток и проводятся испытания на адгезию для регистрации событий адгезии.

Затем строится график вероятности адгезии в зависимости от временной кривой контакта с ячейками, которая подгоняется к модели. Для оценки параметров кинетики получены результаты, которые показывают двумерное эффективное сродство связывания и скорость выключения, оцененную по данным. Так откуда же мы взяли идею этого анализа?

Люди изучают взаимодействие рецепторных ног. В основном мы измеряем силы разрыва, и мы делаем то же самое, но однажды мы подумали, что можем просто измерить двоичный результат ноль для отсутствия адгезии и единицу для адгезии и вывести измерение кинетики из этих измерений нуля единицы, чтобы показать микрочастотный анализ. Доктор Вероника Зана Зина, научный сотрудник моей лаборатории, покажет вам эксперимент.

Эритроциты, выделенные из цельной крови, биотинилируют для анализа частоты адгезии. Чтобы начать эту процедуру, центрифугируйте пробирку, содержащую изолированные эритроциты, аликвотируйте 10 микролитров гранулы эритроцитов в каждый из нескольких флаконов и добавьте соответствующее количество PBS в каждый флакон для приготовления нескольких концентраций эритроцитарного биотина. Далее добавьте в каждый флакон по 10 микролитров 0,1 молярного отверстия восьми буферов.

Затем добавьте рассчитанное количество раствора биотина в каждый флакон и сразу же сделайте вихрь. В течение нескольких секунд поместите каждый флакон с эритроцитами в коническую пробирку объемом 50 миллилитров и инкубируйте на ротаторе в течение 30 минут при комнатной температуре через 30 минут, добавьте буфер EAS 45 в каждый флакон и центрифугируйте в течение двух минут при 2000 оборотах в минуту. Повторите стирку с буфером EAS 45 дважды, всего три стирки.

Наконец, добавьте 100 микролитров буфера EAS 45 в каждый флакон и храните при температуре четыре градуса Цельсия для функционализации лигандов на поверхности эритроцитов, на предыдущем этапе эритроциты инкубируют с насыщенной концентрацией стрептококка TTR в течение 30 минут при четырех градусах Цельсия и промывают три раза буфером EAS 45 в течение двух минут со скоростью 2000 оборотов в минуту. После этого либо инкубируют эритроциты непосредственно с биотинилированным лигандом, либо инкубируют эритроциты с соответствующими биотинилированными захватывающими антителами с последующей инкубацией с лигандами. В протоколе, показанном в этом видео, используется биотинилированное захватывающее антитело.

Микропипетки изготавливаются с использованием капиллярных трубок из силикатного стекла с температурой плавления. Сначала используйте микродозатор для вытягивания капиллярных трубок. Затем с помощью микроманипулятора с микрокузницей отрежьте кончик микропипетки до отверстия нужного размера.

Необходимый диаметр обычно колеблется от одного до пяти микрон в зависимости от размера клеток, которые будут использоваться в исследовании. Для подготовки камеры ячейки используйте два срезанных до нужного размера стекла крышки микроскопа, очистите пыль от защитных стекол с помощью воздушной тряпки, добавьте в камеру ячейки среду и загерметизируйте камеру минеральным маслом с обеих сторон, чтобы избежать испарения среды. Это изменит осмолярность во время эксперимента.

Система микропипеток, используемая в данном анализе, состоит из трех подсистем: подсистемы визуализации для наблюдения, записи и анализа движений аспирированной клетки микропипетки, подсистемы микроманипуляций для отбора клеток из клеточной камеры и подсистемы давления для аспирации клеток в микропипетки. Центральным элементом подсистемы визуализации является инвертированный микроскоп со 100-кратным погружением в масло. Объективные изображения обнаруживаются камерой зарядного устройства и отправляются на видеомагнитофон.

Видеотаймер подключен к системе для отслеживания времени. Наполнив микропипетку деионизированной водой, поместите ее в держатель на механическом приводе, установленном на микроскопе. Микропипетка может быть точно расположена с помощью трехосевого гидравлического микроманипулятора.

Один из держателей микропипеток смонтирован на пьезоэлектрическом трансляторе, запрограммированном компьютером. Это позволяет точно перемещать пипетку в цикле испытаний на адгезию. Подсистема регулирования давления используется для управления всасыванием.

Во время эксперимента гидравлическая линия соединяет держатель микропипеток с резервуаром для жидкости. Точный механический позиционер позволяет точно управлять высотой резервуара. После того, как камера собрана, устанавливаются микропипетки, клетки вводятся в камеру для начала анализа, аспирируются взаимодействующие клетки с помощью соответствующих пипеток и с помощью электрического транслятора PSO вводят и выводят эритроциты из контакта с нейтрофилом с контролируемой площадью контакта и временем.

Адианное событие наблюдается, когда эритроциты удлиняются при разделении клеток, отсутствие адгезии соответствует отсутствию удлинения эритроцитов. Запишите наблюдаемые события адгезии, добавив единицу для адгезии или ноль для отсутствия адгезии. В столбце таблицы Excel.

Запишите зависимость частоты адгезии от временной кривой контакта, используя не менее трех различных пар ячеек для каждого времени контакта. Для получения среднего значения и SEM в качестве контрольной записи записывают неспецифическую кривую связывания с использованием эритроцитов, покрытых соответствующим лигандом, и/или блокируют лиганды или рецепторы с помощью их специфической функциональной блокады. Моноклональные антитела, удельная частота адгезии в каждой временной точке контакта может быть рассчитана путем удаления неспецифической частоты адгезии.

Данные о зависимости удельной частоты адгезии от времени контакта подгоняются с помощью вероятностной модели, которая описывает прямой и первый порядок второго порядка. Обратное одношаговое взаимодействие между одним видом рецепторов и одним видом лигандов в этом уравнении, KA является двумерным сродством. KA - это скорость выключения 2D.

MR и ML – это плотность рецептора и лиганда, а AC – площадь контакта. Аппроксимация кривой имеет два параметра: ac, k, a и K off, поскольку AC и KA объединены в одну кучу и называются в совокупности как эффективное 2D-сродство с коэффициентом выключения является эффективным 2D на скорости AC K на равном AC KA умножить на K off. Здесь показан пример определения интегрина альфа L бета два.

Плотность сайта на нейтрофилах. Нейтрофилы сначала инкубировали по одному микрограмму на миллилитр E-селектина IG, а затем насыщали концентрациями PE-конъюгированного античеловеческого CD 11, моноклонального антитела или соответствующего мышиного IgG в качестве контроля. Через 30 минут инкубационные образцы промывали и считывали на проточном цитометре со стандартным количеством.

Яркие калибровочные валики из полиэтилена. На панели А показаны гистограммы флуоресценции калибровочных шариков вместе с гистограммами E-селектина, обработанных или необработанных клеток. Специфическое окрашивание моноклональными антителами CD 11 A показано на сплошных кривых, а окрашивание соответствующих антител по контролю за соответствием изотипа показано пунктирными кривыми.

На панели B показан процесс количественной оценки плотности. Log 10 был рассчитан для средней интенсивности флуоресценции каждой из четырех бусин. Пиковое значение калибровки с панели А и для конкретной партии молекул полиэтилена на бусину.

Была построена линейная регрессия молекул log 10 PE на бусину против флуоресценции log 10 для повторного выбора интроцированных клеток. Log 10 fi равен 3,99, обозначенным синим сплошным кругом, и 2,23, обозначенным синим открытым кругом, для специфического моноклонального антитела и контрольного антитела соответственно. Когда было решено линейное уравнение для X, общее количество альфа L бета 2 или нейтрофилов было рассчитано как 9 587.

Поверхностная плотность была рассчитана как 43 сайта на микрон в квадрате с использованием 8,4 микрон в качестве диаметра нейтрофилов. На следующем графике показана частота бегущей адгезии fi для конкретного связывания в одну секунду и 10 секунд. Время контакта измерялось по повторяющимся циклам испытаний адгезии между эритроцитами, покрытыми ICAM one, и человеческими нейтрофилами, экспрессирующими интегрин альфа L бета два.

В отличие от этого, здесь показана частота адгезии fi для неспецифического связывания через одну секунду и десять секунд контакта, измеренная по повторяющимся циклам испытаний adion между эритроцитами человека, покрытыми IgG, и человеческими нейтрофилами, экспрессирующими интегрин альфа L бета два. Этот последний график иллюстрирует кинетику связывания I A one с нейтрофильным интегрином альфа L бета, две вероятности адгезии, измеренные для трех пар клеток в каждый момент контакта, были усреднены и построены в зависимости от времени контакта для контроля неспецифического связывания. Использовались два разных условия.

Одна эритроцитура, покрытая антителом захвата TFC и инкубированная с человеческим IgG вместо ICAM, один IG и два нейтрофила связываются с эритроцитами, не покрытыми антителом захвата. Для получения специфической кривой вероятности адгезии использовали неспецифическое связывание, записанное в виде контрольной кривой IgG человека. Использование ранее показанного уравнения для коррекции неспецифического связывания.

Скорректированная кривая вероятности удельной адгезии была подогнана с помощью подгонки модели. Удельная кривая вероятности адгезии показала эффективное сродство к связыванию. CKA равен 1,4 умножить на 10 с точностью до минус четырех микрон в четвертой степени, а koff равен 0,3 с минус одной.

После просмотра этого видео у вас должно быть хорошее понимание того, как измерить кинетику взаимодействия рецепторных лигандов, когда обе молекулы закрепляются на поверхностях клеток взаимодействия I. Пробуя эту процедуру, важно помнить о первых тренировках, диапазоне плотностей сторон лиганда, чтобы адгезия частоты была в среднем диапазоне и помнить, что работа с кровью и некоторыми областями для специфического лечения, например, натрия и ДМ так может быть чрезвычайно опасной. Поэтому при выполнении этой процедуры необходимо соблюдать такие меры предосторожности, как внимательное считывание мышечного паспорта реагента и ношение перчаток.