Подготовка Мышь гипофиза Иммуноген для индукции экспериментального аутоиммунного гипофизит

Аутоиммунный гипофизит характеризуется увеличением доли гипофиза и дефицитом одного или нескольких гормонов гипофиза. Возбудители аутоантигенов остаются неизвестными. Здесь демонстрируется протокол подготовки белков гипофиза мышей для использования при изучении этого заболевания.

Сначала у усыпленных мышей выделяют гипофиз. Затем гипофиз гомогенизируется для механического разрушения клеток и высвобождения цитозольных белков. Гомогенное вещество осветляют с помощью низкоскоростного центрифугирования и оценивают по количеству с помощью колорометрического анализа, анализа BCA и качества с помощью электрофореза в полиакриламидном геле.

Наконец, гомогенат водного белка смешивают с маслянистым адъювантом. Затем эту смесь вводят мышам для создания мышиной модели, напоминающей аутоиммунный гипофизит. Как показано в сопутствующем видео, были описаны четыре метода индуцирования гипофизита у экспериментальных животных.

Методика, представленная в этой статье, то есть инъекция адъюванта гипофизарных белков против гриппа, является самой старой из тех, которые датируются 1960-ми годами. Другими подходами были инъекция растворимых гликопротеинов из вируса краснухи в 1992 году, стереотаксическая инъекция аденовируса непосредственно в гипофиз в 2002 году и трансплантация гипофиза от одного штамма крыс под почечную капсулу другого штамма крыс в 2010 году. Основное преимущество адъювантного подхода Флоренции заключается в том, что в настоящее время он менее инвазивный, более последовательный и, прежде всего, более точный в вызывании заболевания, которое очень похоже на человеческий.

Несмотря на то, что зарубежные адъювантные методы были зарегистрированы с 1960-х годов, они плохо справлялись с индукцией гипофизита. Когда я начинал свою работу над докторской диссертацией, мне удавалось получить только умеренную степень тяжести гипофиза с помощью опубликованного зарубежного протокола адъювантов. Ситуация значительно улучшается, когда у меня появляется идея увеличить в десять раз количество белков питу, содержащихся в ЭМ-эмоции.

Хотя эти методы могут дать представление о патогенезе аутоиммунного гипофизита, они также могут быть использованы для изучения других аутоиммунных заболеваний, для которых аутоантигены еще предстоит идентифицировать. Как правило, люди, плохо знакомые с этим методом, будут испытывать трудности в основном с последним шагом, подготовкой маржи, потому что это требует ручных навыков, времени и самоотверженности. Поэтому визуальная демонстрация имеет решающее значение для понимания того, как должна быть приготовлена правильная эмульсия.

Применение этого метода выходит за рамки области аутоиммунитета. Знание того, как подготовить ин-антиген к иммунизации, также может быть использовано для производства моноклональных антител или для тестирования новых вакцин. Демонстрировать эту технику будут герои из зоопарка Ура и Мэйланд аль Гато из моей лаборатории.

Гипофиз мыши представляет собой железу цилиндрической формы, которая находится у основания черепа в углублении клиновидной кости, называемом терекой. Железа граничит с боков тройничными нервами, а спереди – с хиазмой зрительного нерва. Он состоит из более крупной передней доли и меньших, промежуточных и задних долей.

Чтобы изолировать гипофиз, с помощью ножниц обезглавьте усыпленную мышь, затем сделайте параллельные надрезы от задней части черепа к передней. Поднимите мозг и поверните его назад, чтобы обнажить гипофиз, который выглядит как цилиндр в контексте равнобедренного треугольника. Имея гипофиз в качестве основания, тройничные нервы в качестве боков и зрительный хиазма в качестве вершины.

Обведите железу кончиками закрытых щипцов, чтобы разорвать окружающие менинги. Затем с помощью тонких щипцов возьмите гипофиз из клетки Турки и поместите его в пластиковую трубку на сухой лед. На один препарат собирают 300 гипофизарных желез мыши.

Этот сбор занимает примерно девять человеко-часов. После завершения сбора храните гипофиз при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Поместите 15-миллилитровую трубку Falcon в ледяную ванну.

Добавьте в пробирку 250 микролитров гомогенизационного буфера. На каждые 100 гипофиза, собранных непосредственно перед гомогенизацией, добавьте в буфер гипофиз мыши. Затем поместите наконечник гомогенизатора Poly tron, генератора диаметром пять миллиметров, на дно трубки Falcon, содержащей гипофиз мыши, и буфер гомогенизируется с максимальной скоростью в течение 30 секунд.

Осторожно двигайте трубку вверх и вниз, удерживая ее на льду. Затем отдохните гомогенат на льду в течение одной минуты. Повторите этапы гомогенизации и охлаждения еще два раза.

Эта щадящая гомогенизация должна разрушить клетки и высвободить белки без разрушения ядер центрифуги. Гомогенат на низкой скорости, около 1000 G в течение 10 минут при четырех градусах Цельсия, осаждение, ядра, неразрушенные ткани и нерастворимые материалы, такие как соединительная ткань и денатурированные белковые комплексы. Соблюдайте осторожность, чтобы не потревожить гранулы.

Перенесите SNA, которая теперь называется постъядерным государством или PNS, в новое хранилище трубок Falcon. ПНС на льду втягивают гранулу с использованием того же объема гомогенизационного буфера, что и до гомогенизации и центрифуги, как и раньше. После объединения двух образцов PNS разложите раствор по многочисленным микроцентрифужным пробиркам.

Храните микроцентрифужные пробирки при температуре минус 80 градусов Цельсия до тех пор, пока они не понадобятся. Этот белковый препарат стабилен при температуре минус 80 градусов по Цельсию, но постепенно теряет свою потенцию. Таким образом, рекомендуется использовать его в течение полугода с момента приготовления.

Оставьте одну небольшую аликвоту ПНС для определения выхода и концентрации белка с помощью анализа биевых кислот. Затем определяют качество белка с помощью гель-электрофореза из 300 гипофизарных желез мыши, общий вес которых в среднем составляет примерно 570 миллиграммов. Ожидайте выхода 60 миллиграммов белков гипофиза или один миллиграмм белка на каждые 10 миллиграммов ткани.

Концентрация белка обычно составляет около 40 миллиграммов на миллилитр. Приведенный здесь пример предназначен для иммунизации 10 мышей. Планируйте вводить каждой мыши 100 микролитров эмульсии, содержащей один миллиграмм белка гипофиза, что позволяет двум дополнительным мышам для потерь материала во время приготовления, здесь готовится 12 миллиграммов белковой эмульсии.

Начните с быстрого размораживания замороженных белковых аликвот, разогрев их в руках. Отрегулируйте концентрацию белка до 20 миллиграммов на миллилитр с помощью PBS. Далее наберите 600 микролитров экстракта белка гипофиза, что соответствует 12 миллиграммам, в 2,5 миллилитр шприца Gas Tite Hamilton, полный адъювант FRONS или КФА, содержащий пять миллиграммов на миллилитр тепла, убили микобактерию туберкулеза, вручную встряхнув ее.

Затем наберите 600 микролитров КФА в другой 2,5-миллилитровый шприц Гамильтона. Прикрепите и закрепите микроэмульгирующую иглу 22 калибра к шприцу, заполненному CFA. Медленно нажмите на поршень так, чтобы игла была заполнена CFA.

Затем присоедините и закрепите другой конец иглы к другому шприцу, наполненному экстрактом белка гипофиза. Избегайте попадания пузырьков воздуха внутрь шприцев. Медленно продвигайте поршень шприца CFA, чтобы протолкнуть масляный компонент в водный экстракт гипофиза так, чтобы смешалось лишь небольшое количество.

Затем вставьте поршень шприца с экстрактом гипофиза в шприц CFA. Повторяйте это действие, постепенно увеличивая количество перемешиваемого материала, пока все содержимое не будет перемешано. Этот беловатый и равномерно распределенный материал представляет собой водную и масляную эмульсию.

После того, как эмульсия будет сформирована, повторите полный цикл вперед и назад не менее 500 раз после заключительного цикла, шприцы будут содержать водную и масляную эмульсию один к одному, где концентрация белка гипофиза теперь составляет 10 миллиграммов на миллилитр. Эмульсия готова к использованию для проверки качества эмульсии при капле ее на стакан воды. Если эмульсия приготовлена правильно, капля будет оставаться компактной и плотной на поверхности.

Если эмульсия будет некачественной, она будет растекаться и раскалываться на более мелкие капли. Эмульсию вводят в тот же день после ее приготовления мышам SJL для индуцирования экспериментального аутоиммунного гипофизита. Этот протокол подробно описан в прилагаемом джо вертикали.

После того, как подпиточная железа собрана и техники освоены, можно выполнять инструкцию по белку за один час, не забывая о работе на быстром и на льду. Во время этого этапа, во время подготовки происходит погружение, на которое требуется примерно один час. Не забывайте работать медленно и терпеливо на начальной фазе смешивания после его разработки.

Этот метод проложил путь исследователям в области аутоиммунитета к изучению механизмов, с помощью которых аутореактивные лимфоциты распознают и проникают в орган-мишень. После просмотра этого видео у вас должно сложиться хорошее представление о том, как приготовить белковый экстракт из гипофиза мыши и как смешивать его с экстрактами Крона, чтобы приготовить эмульсию, готовую к использованию в качестве иммуногена. Не забывайте, что работа со шприцами и полными шприцами от гриппа, в которых содержится инактивированный и сухой микробактериальный туберкулез, может быть опасной, если вы случайно проколете себя.

Поэтому всегда используйте G-свечение и правильно утилизируйте иглы во время выполнения этой процедуры.