Прижизненные микроскопия микроциркуляции мозга мыши, используя Закрытая черепно Window

Общей целью этой процедуры является изучение микроциркуляции в мозге мыши с помощью прижизненной микроскопии, которая позволяет отслеживать динамические изменения гемодинамических и воспалительных маркеров в микроциркуляции ворса в течение длительных периодов времени. Этот метод был разработан в Институте биоинженерии Ла-Хойя, где он использовался для многих видов исследований. Например, наблюдение за гемодинамическими изменениями во время течения инфекции Plasmodium burgi onca и в момент проявления церебральной малярии.

Это достигается путем первичной имплантации хронического краниального окна за две недели до проведения прижизненных микроскопических исследований. Вторым этапом процедуры является запись общей морфологии краниального окна с использованием цифрового изображения с высоким разрешением и малым увеличением. Третьим этапом процедуры является получение прижизненных микроскопических изображений с использованием обычного и флуоресцентного освещения, а также выбор конкретных исследовательских участков для онлайн-измерений диаметра сосуда и скорости эритроцитов.

Заключительным этапом процедуры является проведение прижизненного анализа адгезии лейкоцитов и тромбоцитов в сосудах ворса с помощью флуоресцентно меченных специфических антител. В конечном счете, могут быть получены результаты, которые показывают in vivo микроциркуляционные изменения в церебральных зеркальных моделях физиологических патофизиологических или патологических состояний с помощью прижизненной микроскопии мозга для установления гемодинамических изменений, связанных с этими состояниями. Основное преимущество этой методики заключается в том, что мы наблюдаем за мозгом в его физиологической среде, не подвергая его воздействию внешних агентов или искусственной среды: прижизненная микроскопия по сравнению с магнитно-резонансной и ангиографической помощью имеет пространственное и временное разрешение и позволяет нам смотреть от микроскопического к микроскопическому уровню.

Этот метод может помочь ответить на ключевые вопросы физиологии и патофизиологии микроциркуляции головного мозга, такие как гемодинамические и воспалительные изменения при остром и хроническом заболевании за две-три недели до прижизненной микроскопии. Ранее было продемонстрировано, что трепанация черепа проводится у мышей в возрасте от 8 до 10 недель, за исключением того, что титановый стержень не помещается в голову животного. Хроническое краниальное окно является стабильным препаратом, позволяющим исследовать микроциркуляцию ворса даже спустя месяцы после имплантации в день эксперимента.

Во-первых, проверьте температуру тела животного перед тем, как поместить животное в стереотаксическую рамку, в которую через хвостовую вену мыши вводятся заранее подготовленные флуоресцентно меченые эритроциты. Это позволит отслеживать эритроциты, что будет продемонстрировано позже. Затем слегка обезболите мышь изофтором.

4% для индукции, от одного до 2% для технического обслуживания. Далее поместите животное в положение лежа в стереотаксическую рамку на грелку. Аккуратно закрепите голову с помощью ушных упоров и отрегулируйте уровень с помощью правого и левого рычагов.

Аккуратно очистите чехол на черепном окне ватным тампоном, смоченным в минеральном масле. Затем с помощью стереомикроскопа, подключенного к цифровой камере, сделайте несколько панорамных снимков сосудов под окном. После переноса панорамных фотографий на компьютер выберите наиболее подходящий для печати, идентификации и датирования.

Эта фотография будет использована в качестве карты для измерения диаметра сосудов и скорости эритроцитов, которые будут продемонстрированы далее перед началом внутрижизненной микроскопии. Перенесите мышь на специальный прижизненный столик микроскопа. Капните каплю воды на черепное окно, воспользовавшись лункой, образованной зубным акрилом.

Используется 20-кратный объектив для погружения в воду с числовой апертурой 0,5. Изображения записываются с помощью двух камер, цифровой высокоскоростной камеры при слабом освещении, подключенной к компьютеру и монитору, и аналоговой камеры при слабом освещении, подключенной к видеомагнитофонной ленте, временной метки и цветного монитора перед выбором сосудов для измерения, проверкой сосудов для оценки качества препарата, а также с тем, протекает ли кровь во всех сосудах. Затем выберите сосуды для измерения. Они должны включать в себя места и артерии разного диаметра и охватывать разные места в пределах области, открытой окном.

В нашем эксперименте мы выбираем 12 сосудов для измерения, поскольку вы просматриваете различные поля в пределах краниального окна. Чтобы выбрать сосуды, укажите точное местоположение каждого измеряемого пятна на фотографии сосудистой сети PY, которая была сделана ранее для каждого пятна, диаметр сосуда измеряется с помощью устройства для сдвига изображения. После того, как место выбрано, изображение судна выравнивается в вертикальном положении, а изображение срезается до противоположного положения.

Крайние значения выравниваются, а показания документируются. Для отслеживания эритроцитов каждое пятно записывается цифровой камерой в течение не менее 30 секунд, а видеоизображения записываются со скоростью 150 кадров в секунду. Эта скорость задается для получения от одного до шести изображений ячейки на одном видеокадре для определения скоростей до шести миллиметров в секунду.

После того, как сбор данных будет завершен, извлеките мышь из стереотаксической рамки и верните ее в клетку, чтобы восстановиться после анестезии с помощью соответствующего программного обеспечения. Полученные видеоизображения оцифровываются и XY. Получены координатные данные для каждого изображения ячейки. Положение ячеек определяется вручную, а не с помощью анализа изображений.

При этом глаз тренированного наблюдателя дает хорошую оценку расположения центра клетки, которое в общем случае соответствует расположению максимальной наблюдаемой флуоресценции. Для большинства ориентаций клеток определение положения и скорости производится для 15 клеток в каждом сосуде. Среднее значение для получения средней скорости эритроцитов после того, как диаметр сосуда и скорость эритроцитов стали доступны.

Расчет кровотока в каждом сосуде может быть выполнен с помощью формулы Q равной D на два квадрата PI, умноженной на V, где Q равна кровотоку V равна скорости эритроцитов, а D равна диаметру сосуда для оценки обильности и анализа адгезии лейкоцитов в сосудах ворса. Прижизненную микроскопию проводят на животном, которому вводят смесь меченного FSE альбумина и антител против панлейкоцитарного маркера CD 45, меченного Texas Red. Флуоресцентный меченый альбумин позволяет улучшить визуализацию сосудистой сети, включая проникающие сосуды, и особенно полезен при таких болезненных состояниях, как церебральная малярия, для проверки неперфузированных или недостаточно перфузированных сосудов.

Флуоресцентно меченые антитела против CD 45 облегчают идентификацию и количественное определение скручивания лейкоцитов и адгезии к сосудам ворса. Количественная оценка адгезии лейкоцитов производится путем подсчета количества лейкоцитов в сосуде длиной 100 мкм. Перекатывание количественно определяется путем подсчета количества лейкоцитов, движущихся со скоростью, значительно меньшей скорости крови при той же длине 100 микрон в течение 30 секунд. Показывать.

Ниже приведен пример измерения скорости микрососудистых эритроцитов путем отслеживания клеток с помощью высокоскоростной флуоресценции. Видеозаписи, снимки от А до F представляют собой последовательные изображения микроциркуляции. Каждый снимок представляет собой положение одной проточной эритроцитной клетки, которая кадр за кадром снимается высокоскоростной камерой.

Этот график из репрезентативного эксперимента показывает изменения в кровотоке ворса с течением времени. У мышей, инфицированных плазмодием, бурги, онкой и у неинфицированных контрольных мышей, в то время как у контрольных мышей поток крови в куче относительно стабилен с течением времени. У инфицированных ПБА мышей наблюдается снижение рыночного кровотока во время развития церебральной малярии.

На шестой день окрашивания анти-CD 45 техасские красные флуоресцентные антитела обнаруживают большое количество лейкоцитов, прилипших к сосудам ворса мыши, инфицированной Plasmodium burgi onca. Эта процедура имеет широкий спектр применения, помимо одной сегодняшней работы. Любой оптический метод, который может быть использован in vivo, может быть адаптирован к этой модели, и в этой модели могут быть изучены такие параметры, как ткань, уровень кислорода в ткани, активные формы кислорода pH и взаимодействие эндотелия с лейкоцитами.