Прижизненные микроскопия микроциркуляции мозга мыши, используя Закрытая черепно Window

Общая цель данной процедуры заключается в изучении микроциркуляции в головном мозге мыши с помощью интравитальной микроскопии, которая позволяет отслеживать динамические изменения гемодинамических и воспалительных маркеров в микроциркуляции коры головного мозга в течение длительного периода времени. Данный метод был разработан в Институте биоинженерии Ла-Хойя, где он применялся для различных типов исследований. Например, для мониторинга гемодинамических изменений при инфекции Plasmodium burgi onca и в период развития церебральной малярии.

Это достигается путем первоначальной имплантации хронического краниального окна за две недели до проведения исследований методом интравитальной микроскопии. Вторым этапом процедуры является регистрация общей морфологии краниального окна с помощью цифрового изображения высокого разрешения при малом увеличении. Третьим этапом процедуры является получение изображений при интравитальной микроскопии с использованием обычного и флуоресцентного освещения, а также выбор конкретных участков исследования для проведения онлайн-измерений диаметра сосудов и скорости эритроцитов.

Заключительным этапом процедуры является проведение intravital-анализа адгезии лейкоцитов и тромбоцитов в сосудах пиле с использованием специфических антител, меченных флуорофорами. В конечном итоге с помощью intravital-микроскопии мозга можно получить результаты, демонстрирующие in vivo микроциркуляторные изменения в церебральных моделях физиологических, патофизиологических или болезненных состояний, чтобы установить связанные с ними гемодинамические изменения. Основным преимуществом данного метода является возможность наблюдения за мозгом в его физиологической среде без воздействия внешних агентов или искусственных сред; intravital-микроскопия, по сравнению с магнитно-резонансной томографией и ангиографией, обладает более высоким пространственным и временным разрешением, что позволяет проводить исследования на микроскопическом уровне.

Данный метод позволяет ответить на ключевые вопросы физиологии и патофизиологии микроциркуляции головного мозга, такие как гемодинамические и воспалительные изменения при острых и хронических заболеваниях. За две-три недели до проведения intravital microscopy восьми-десятинедельным мышам выполняется краниоტომिया по ранее описанному методу, за исключением того, что титановый стержень в голову животного не устанавливается. Хроническое краниальное окно представляет собой стабильную модель, позволяющую исследовать микроциркуляцию в течение нескольких месяцев после имплантации в день проведения эксперимента.

Сначала измерьте температуру тела животного, затем поместите его в стереотаксическую раму и введите предварительно подготовленные флуоресцентно меченые эритроциты через хвостовую вену мыши. Это позволит отслеживать эритроциты, что будет продемонстрировано далее. Затем слегка анестезируйте мышь изофлураном.

4% для индукции, от 1 до 2% для поддержания наркоза. Затем поместите животное в стернотаксическую раму в положении на животе на нагревательную подушку. Осторожно зафиксируйте голову с помощью ушных фиксаторов и отрегулируйте уровень с помощью правого и левого рычагов.

Осторожно очистите покровное стекло краниального окна с помощью ватной палочки, смоченной в минеральном масле. Затем, используя стереомикроскоп с подключенной цифровой камерой, сделайте несколько панорамных снимков сосудов под окном. После переноса панорамных фотографий на компьютер выберите наилучший снимок для последующей печати, идентификации и датировки.

Это фото будет использоваться в качестве карты для измерения диаметра сосудов и скорости эритроцитов, что будет продемонстрировано далее при подготовке к intravital-микроскопии. Перенесите мышь на специально модифицированный предметный столик intravital-микроскопа. Нанесите каплю воды на краниальное окно, используя углубление, сформированное стоматологическим акрилом.

Используется объектив с увеличением 20x для иммерсии в воду и числовой апертурой 0,5. Изображения регистрируются с помощью двух камер: цифровой высокоскоростной камеры для работы при слабом освещении, подключенной к компьютеру и монитору, и аналоговой камеры для работы при слабом освещении, подключенной к видеомагнитофону, генератору временных меток и цветному монитору. Перед выбором сосудов для измерения проверьте их, чтобы оценить качество препарата; если кровь течет во всех сосудах, выберите сосуды для измерения. В выборку должны входить вены и артерии разных диаметров, расположенные в различных частях области, открытой окном.

В нашем эксперименте мы выбираем 12 сосудов для измерения, осматривая различные поля в пределах краниального окна. Для выбора сосудов отметьте точное расположение каждой точки измерения на ранее сделанной фотографии сосудистой сети PY; диаметр сосуда в каждой точке измеряется с помощью устройства сдвига изображения. После выбора точки изображение сосуда выравнивается по вертикали, и затем изображение сдвигается до достижения противоположного края.

Крайние точки совмещены, и показания зафиксированы. Для отслеживания эритроцитов каждое пятно записывается с помощью цифровой камеры в течение как минимум 30 секунд, при этом видеоизображения записываются со скоростью 150 кадров в секунду. Такая частота установлена для получения от одного до шести изображений клетки на одном видеокадре с целью определения скоростей до 6 мм/с.

После завершения сбора данных извлеките мышь из стереотаксической рамы и поместите ее обратно в клетку для восстановления после наркоза, используя соответствующее программное обеспечение. Полученные видеоизображения оцифровываются, и для каждого изображения клетки определяются координаты XY. Положения клеток определяются вручную, а не с помощью анализа изображений.

Учитывая, что опытный наблюдатель может достаточно точно определить положение центра клетки, которое в целом соответствует области максимальной наблюдаемой флуоресценции. Для большинства ориентаций клеток определение положения и скорости проводится для 15 клеток в каждом сосуде. После получения данных о диаметре сосуда и скорости RBC вычисляется среднее значение для определения средней скорости RBC.

Расчет кровотока в каждом сосуде может быть выполнен с помощью формулы Q = (D/2)² × PI × V, где Q — кровоток, V — скорость эритроцитов, а D — диаметр сосуда, для оценки перфузии и анализа адгезии лейкоцитов в капиллярных сосудах. Интравитальная микроскопия проводится на животном, которому ввели смесь альбумина, меченного FSE, и антител к панлейкоцитарному маркеру CD 45, меченных Texas Red. Альбумин с флуоресцентной меткой позволяет улучшить визуализацию сосудистой сети, включая проникающие сосуды, и особенно полезен при таких патологических состояниях, как церебральная малярия, для выявления неперфузируемых или недостаточно перфузируемых сосудов.

Использование флуоресцентно-меченных антител к CD 45 позволяет легко идентифицировать и количественно оценить роллинг и адгезию лейкоцитов к сосудам. Количественная оценка адгезии лейкоцитов проводится путем подсчета их количества на участке сосуда длиной 100 микрон. Роллинг оценивается путем подсчета количества лейкоцитов, движущихся со скоростью, которая значительно ниже скорости кровотока, на том же участке длиной 100 микрон в течение 30 секунд. Показано.

Ниже представлен пример измерения скорости эритроцитов в микрососудах методом трекинга клеток по высокоскоростной флуоресценции. Видеозаписи на изображениях от A до F представляют собой последовательность кадров микроциркуляции. Каждое изображение отображает положение одного движущегося эритроцита, зафиксированного высокоскоростной камерой кадр за кадром.

Этот график из репрезентативного эксперимента показывает изменения кровотока в ворсинках с течением времени. У мышей, инфицированных plasmodium, burgi и onca, наблюдаются изменения, в то время как у контрольных неинфицированных мышей кровоток в ворсинках остается относительно стабильным. У мышей, инфицированных PBA, наблюдается выраженное снижение кровотока в момент развития церебральной малярии.

На шестой день окрашивание антителами к CD 45, меченными флуоресцентным красителем Texas red, выявляет большое количество лейкоцитов, прикрепившихся к сосудам легких мыши, инфицированной plasmodium burgi onca. Данная процедура имеет широкий спектр применения, помимо задачи, представленной сегодня. Любой метод оптического анализа, который может быть использован in vivo, может быть адаптирован к этой модели; в ней можно изучать такие параметры, как уровень кислорода в тканях, pH, активные формы кислорода и взаимодействие эндотелия с лейкоцитами.