Кристаллизации белков для рентгеновской кристаллографии

Общая цель этой процедуры заключается в получении кристаллов белка для экспериментов по рентгеновской дифракции. Продемонстрированы три различных метода фильтрации кристаллов с помощью диффузионной кристаллизации, включая висячую каплю и сидячую каплю, а также описаны методы микропериодической кристаллизации для диффузионной кристаллизации пара. Скважины заполняются осадком.

Затем образец очищенного белка в высокой концентрации смешивают с осаждающим агентом. Затем смешанную каплю запечатывают в лунке, содержащей раствор осадителя. Микропериодическая кристаллизация начинается с заполнения скважины парафином.

Затем белок загружается в лунки, а затем в раствор осадителя. Последний шаг всех методов состоит в том, чтобы позволить системе прийти в равновесие и следить за появлением и ростом кристаллов в каплях. В конечном счете, с помощью этого метода можно получить кристаллы, а картину дифракции белка определить с помощью источника рентгеновского излучения с подходящим детектором.

Здравствуйте, я Сэл из лаборатории профессора Йога Мотиса на кафедре молекулярной биофизики и биохимии Йельского университета. Сегодня мы покажем вам процедуру кристаллизации очищенного белка. Мы используем эту процедуру в нашей лаборатории для изучения структурных основ вирусной инфекции.

Итак, давайте начнем и вырастим несколько кристаллов. Чтобы определить метод кристаллизации для выбранной макромолекулы, можно провести начальный скрининг с использованием коммерчески доступных кристаллизационных растворов, выбранных для использования метода неполного факториала с разреженной матрицей в условиях испытаний. Эти условия выбираются на основе известных и обычно успешных условий кристаллизации макромолекул.

После того, как условия кристаллизации известны, можно собрать узкое сито, изменяющее концентрацию осадителя в pH вокруг первоначального удара. Обычно условия кристаллизации, используемые для этих сит, состоят из воздействия осаждающего агента и буфера для установки pH, все исходные растворы должны быть отфильтрованы через фильтр 0,22 микрона для этой демонстрации. Ранее выявленные условия кристаллизации лизосомы курицы используют с хлоридом натрия в качестве осадителя начинают процедуру путем приготовления одного миллилитра растворов различных концентраций хлорида натрия в 0,1 молярного ацетата натрия различных значений рН.

Далее образец белка хранят при температуре минус 80 градусов по Цельсию и держат его на льду. Типичные концентрации белка находятся в диапазоне от пяти до 50 мг на миллилитр при более высоких концентрациях, что обычно дает лучшие результаты. Здесь используется 50 миллиграмм на миллилитр раствора лизосомы куриного яйца в 0,02 моляра ацетата натрия pH 4,9.

Вращайте образец в течение 15 минут при температуре 18 000 G и четырех градусах Цельсия, чтобы удалить все частично агрегированные белки или осадок со стадии оттаивания. Эти агрегаты могут препятствовать росту кристаллов и способствовать дальнейшей агрегации. Последующее центрифугирование.

Определите концентрацию белка по его поглощению на расстоянии 280 нанометров с помощью фотометра УФ-спектра. Концентрацию белка можно рассчитать по показаниям абсорбции и коэффициенту экстинкции белка. Как только образец белка будет готов, заполните 24-луночный подвешенный сидячий кристаллизационный лоток 500 микролитрами раствора осадителя в соответствии с картой лотка.

Создайте кольцо для силиконовой смазки по краю каждой лунки, не закрывая кольцо идеально, чтобы воздух мог выходить из колодца. Потолок. Очистите крышку стекла с помощью распылителя конденсированного воздуха или профессиональной салфетки, чтобы избежать попадания пыли, что облегчит интерпретацию капель кристаллизации и устранит загрязнения. Следующим шагом является пипетка в равных объемах образца белка и резервуарного раствора на предметное стекло.

Тем не менее, различные объемы белка и осадка могут быть опробованы в рамках процесса оптимизации с использованием большего количества белка, чем приводит к получению чистой концентрации белка в уравновешенной капле, что может быть желательным для образцов белка dute или для замедления зарождения кристаллов или роста. Для этой демонстрации два микролитра по 50 мг на миллилитр лизоцима в 0,02 молярного ацетата натрия. В центр предметного стекла крышки загружается pH четыре, за которым следуют два микролитра кристаллизационного раствора.

При пипетировании белка и пластового раствора на предметное стекло будьте предельно осторожны, чтобы избежать образования пузырьков, которые часто происходят при выдувании воздуха из пипетки. Аккуратно перемешивайте каплю, чтобы предотвратить преждевременное выпадение белка из-за локально высоких концентраций осадка в каплях. Осторожно переверните крышку и положите ее на смазочное кольцо сверху, хорошо выполняйте это направленно, чтобы воздух мог выйти из колодца.

В противном случае воздух может поднять заслонку крышки, нарушив уплотнение скважины. Переходите к следующей лунке, пока лоток не будет готов. После того, как лоток будет установлен, визуально осмотрите его, удалив частицы пыли и другие загрязнения, которые могут снизить ложноположительную идентификацию белковых кристаллов.

Используйте таблицу показателей для документирования эксперимента. Затем установите в лоток желаемую температуру инкубации, как правило, между четырьмя градусами Цельсия и комнатной температурой. Наиболее удачной температурой считается 20 градусов по Цельсию.

Осторожно обращайтесь с лотком и избегайте тряски, вибрации или изменения температуры во время транспортировки или инкубации, которые могут помешать росту кристаллов или негативно повлиять на качество кристаллов. Проверяйте лоток на кристаллы на следующий день, а затем каждые несколько дней, всегда обращаясь с лотками осторожно. Задокументируйте все результаты и морфологию капель в лоток Специальный лист для подсчета очков.

Кристаллы обычно появляются через два-пять дней, хотя иногда кристаллы появляются почти сразу или в течение нескольких месяцев. После того, как определены условия кристаллизации и известна скорость роста кристаллов, лучше всего оставить лотки нетронутыми до тех пор, пока кристаллы не появятся и не вырастут по крайней мере до половины своего окончательного размера. Если оставить тарелки в покое, можно уменьшить количество событий зарождения кристаллов, что приведет к уменьшению количества более крупных кристаллов для кристаллизации сидячей капли. Следуйте той же процедуре, что и для висячей капли, за исключением того, что мы будем использовать 24 хорошо сидячих лотка, в которых не требуются защитные стекла.

Вместо этого лунка содержит полку, на которой белок и осадитель смешиваются пипеткой, два микролитра 50 миллиграммов на миллилитр раствора лизоцима в центре полки, что позволяет избежать образования пузырьков воздуха. Далее добавьте в образец два микролитра раствора осадителя после установки лотка. Заклейте лунки оптической лентой с сидячей каплей.

Никаких защитных горок не требуется. Продолжайте инкубацию и подсечку кристаллов, как описано для висячей капли. Для выполнения микропакетной процедуры.

Приготовьте кристаллизационный раствор и белок, как описано для процедуры с висячими каплями. Приобретите новый микролоток для дозирования и распылите воздух, чтобы избежать попадания пыли и других крупных частиц в микролоток для дозирования. Добавляйте парафиновое масло в каждую скважину на глубину до трех миллиметров.

Затем удалите излишки масла. Затем загрузите один микролитр белкового раствора в предварительно заполненную лунку, убедившись, что капля опускается на дно лунки. Затем загрузите в лунку один микролитр раствора осадка.

Убедитесь, что капля опускается на дно колодца и сливается с белковой каплей. Переходите к следующей лунке, пока лоток не будет готов, и продолжайте инкубацию и анализ кристаллов, как описано здесь. Типичные результаты кристаллизации белка.

Показаны эксперименты. Аморфное осаждение происходит, когда белок и/или осадитель находятся в высокой концентрации. И наоборот, ненасыщенные капли обычно остаются прозрачными.

Разделение фаз может произойти, если белок или детергент отделяется до другой фазы при смешивании с определенными осадителями в высокой концентрации. При оптимальных условиях кристаллы белка должны образовывать Arabidopsis csn. Семь кристаллов белка, которые были получены в полиэтиленгликоле 8000 и ацетате магния, имеют форму палочек.

Также показаны кристаллы лизосомного белка, которые были получены в одном моляре, хлорид натрия и ацетат натрия. pH 4,9. Этот видеоролик с интервальной съемкой демонстрирует, что кристаллы лизосомы вырастают в большие призмы в течение нескольких часов после установки при использовании метода висячих капель.

Мы только что показали вам, как организовать эксперимент с белком, когда вы проводите эту процедуру. Важно работать в среде, которая постоянно контролирует температуру и влажность, поскольку высокая влажность помогает свести к минимуму испарение капель, постарайтесь использовать технику, которая сводит к минимуму воздействие капель на открытый воздух. По этой причине важно работать в хорошо организованной рабочей среде.

Вот и все. Спасибо за просмотр и удачи в ваших экспериментах.