Анализ плюрипотентных стволовых клеток с помощью Cryosections из эмбриоидные тела
December 8th, 2010
Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.
Часть первая, Введение. Здравствуйте, меня зовут Рафаэль. Я работаю постдоком в лаборатории профессора Стивенса Ханса в Федеральном университете Рио-де-Жанейро в Бразилии.
Здравствуйте, меня зовут Исмаил. Я научный сотрудник, также профессор. В этом видео мы покажем, как подготовить четкие участки тел Android.
Итак, приступим. Часть вторая, материалы и оборудование. Для этой процедуры нам понадобится закладная среда для замороженных образцов.
4%Параформный раствор альдегида для фиксации клеток, растворы сахарозы для криозащиты. Игла со слегка загнутым кончиком, стереомикроскоп для лучшей визуализации EBS и шейкер. Часть третья.
Здесь тела человеческих эмбрионов культивируются в неадгезивных культуральных планшетах. С помощью пипетки мы группируем все тела эмбрионов как можно ближе друг к другу, чтобы перенести их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. EBS тщательно собирают и переносят в пробирку.
Важно собрать все ЭБ, так как материала не так много. После декантации ЭБ питательные среды тщательно отбрасываются. Вы должны видеть гранулу на дне трубки. Теперь можно приступать к процедуре фиксации.
EBS будет фиксироваться в 4%-ном растворе параформного альдегида в PBS или фосфатно-солевом буфере. Важно повторно суспендировать гранулу раствором PFA. Затем ЭБС фиксируются в фиксирующем растворе на 30 минут.
После фиксации раствор PFA осторожно удаляется. Соблюдая меры предосторожности, чтобы Resus не приостановил EBS и не заменил его 10%-ным раствором сахарозы в PBS для инициирования криозащиты EBS, материал выдерживают в этом растворе в течение 30 минут. Далее мы осторожно удаляем 10%-ный раствор сахарозы и ресуспендируем EBS в 20%-ном растворе сахарозы.
И снова EBS хранятся в этом растворе в течение 30 минут. Наконец, 20% раствор сахарозы удаляют и заменяют 30% раствором сахарозы в PBS, где он хранится еще 30 минут. Теперь можно приступать к ориентации и блокировке ЭБС.
В нашей лаборатории мы используем пустые оболочки капсул в качестве форм. Для блокировки ВБС важно покрыть внутренние стенки наконечника раствором сахарозы перед сбором ОЭ. Теперь мы можем аккуратно собрать EBS и подождать, пока они сцегнутся на дно кончика.
Далее ЭБС размещаются в центре блока. Это должно быть конечное положение EBS внутри блока. С помощью стереомикроскопа и тонкого наконечника мы собираем и выпускаем как можно больше раствора сахарозы.
Всегда следите за тем, чтобы не собрать EBS. С помощью иглы со слегка загнутым кончиком все ЭБС располагаются в центре блока. Наконец, оставшийся раствор сахарозы собирают с помощью кусочков фильтровальной бумаги.
Конкретное расположение EBS в блоке очень важно для получения ломтиков хорошего качества. Вот пример плохого позиционирования EB внутри оболочки. После позиционирования EBS и удаления раствора сахарозы оболочка заполняется OCT, начиная с краев, при этом всегда следят за тем, чтобы Resus не подвешивал EBS.
Оставшиеся пузырьки удаляются с помощью пипетки, а оболочки взбалтываются в течение 15 минут. После агитации. ОКТ-блок замораживается в сухом льду.
На этом этапе вы можете либо хранить блок, завернутый в алюминиевую фольгу, при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа, либо перейти к криостату Часть четвертая, Резка. Для изготовления криосекций вам понадобится одноразовое или постоянное лезвие, стеклосборники OCT и предварительно обработанные поли L лизином стекла. Блок OCT вынимают из морозильной камеры и держат внутри криостата до тех пор, пока он не достигнет минус 20 градусов по Цельсию.
Затем блок размещается на подставке и выравнивается параллельно краю лезвия. Образцы EB намного меньше, чем большинство других образцов тканей, поэтому очень важно быть уверенным, что вся поверхность блока одновременно соприкасается с лезвием, тем самым сводя к минимуму потери материала. После позиционирования блок разрезается на ломтики размером 10 микрометров, которые собираются непосредственно на предметные стекла.
Предметные стекла можно хранить либо при температуре минус 70 градусов по Цельсию, либо использовать в тот же день. Материал может быть окрашен для иммуногистохимии или иммунофлюоресценции. Заключение. Описанный здесь способ обеспечивает достаточно недорогой и простой в применении протокол получения тонких криостатных срезов тел эмбрионов, развившихся как из человеческих линий H 9, так и из стволовых клеток US P one мыши.
Полученные криосрезы могут быть использованы в широком спектре процедур для анализа экспрессии белка или морфологии EB.
View the full transcript and gain access to thousands of scientific videos
Обзор
В этой статье демонстрируется процесс получения высококачественных криосекторов тел эмбриоидных тел (EB) из плюрипотентных стволовых клеток, выращенных в суспензии. Эти криосекторы необходимы для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза при сохранении организации EB.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Эмбриогенез
- Клеточная дифференцировка
Фон
- Плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Эмбриоидные тела - это агрегаты, имитирующие раннее эмбриональное развитие.
- Изучение EB помогает понять механизмы эмбриогенеза.
- Высококачественные криосекторы важны для детального анализа.
Цель исследования
- Предоставить метод подготовки криосекторов EB.
- Способствовать изучению клеточных и молекулярных процессов в процессе дифференцировки.
- Сохранить структурную организацию EB в анализе.
Использованные методы
- Подготовка плюрипотентных стволовых клеток в суспензионной культуре.
- Индукция дифференцировки в эмбриоидные тела.
- Техники криосекторирования для получения высококачественных образцов.
- Анализ клеточных и молекулярных характеристик EB.
Основные результаты
- Успешная подготовка криосекторов из EB.
- Сохранение организации EB в криосекторах.
- Повышенная способность изучать эмбриогенез на клеточном уровне.
- Демонстрируемый метод может быть применен в различных исследовательских контекстах.
Выводы
- Метод позволяет проводить детальный анализ EB.
- Высококачественные криосекторы ценны для эмбриональных исследований.
- Этот подход может продвинуть понимание дифференцировки стволовых клеток.
