Анализ плюрипотентных стволовых клеток с помощью Cryosections из эмбриоидные тела
8 декабря 2010 г.
Плюрипотентных стволовых клеток, растущих в виде суспензии дифференцироваться в эмбриоидных тел (ЭТ). Здесь показано, как получить высокое качество EB cryosections полезны для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза, сохраняя при этом свою организацию как агрегаты.
Часть первая, Введение. Здравствуйте, меня зовут Рафаэль. Я работаю постдоком в лаборатории профессора Стивенса Ханса в Федеральном университете Рио-де-Жанейро в Бразилии.
Здравствуйте, меня зовут Исмаил. Я научный сотрудник, также профессор. В этом видео мы покажем, как подготовить четкие участки тел Android.
Итак, приступим. Часть вторая, материалы и оборудование. Для этой процедуры нам понадобится закладная среда для замороженных образцов.
4%Параформный раствор альдегида для фиксации клеток, растворы сахарозы для криозащиты. Игла со слегка загнутым кончиком, стереомикроскоп для лучшей визуализации EBS и шейкер. Часть третья.
Здесь тела человеческих эмбрионов культивируются в неадгезивных культуральных планшетах. С помощью пипетки мы группируем все тела эмбрионов как можно ближе друг к другу, чтобы перенести их в коническую пробирку объемом 15 миллилитров. EBS тщательно собирают и переносят в пробирку.
Важно собрать все ЭБ, так как материала не так много. После декантации ЭБ питательные среды тщательно отбрасываются. Вы должны видеть гранулу на дне трубки. Теперь можно приступать к процедуре фиксации.
EBS будет фиксироваться в 4%-ном растворе параформного альдегида в PBS или фосфатно-солевом буфере. Важно повторно суспендировать гранулу раствором PFA. Затем ЭБС фиксируются в фиксирующем растворе на 30 минут.
После фиксации раствор PFA осторожно удаляется. Соблюдая меры предосторожности, чтобы Resus не приостановил EBS и не заменил его 10%-ным раствором сахарозы в PBS для инициирования криозащиты EBS, материал выдерживают в этом растворе в течение 30 минут. Далее мы осторожно удаляем 10%-ный раствор сахарозы и ресуспендируем EBS в 20%-ном растворе сахарозы.
И снова EBS хранятся в этом растворе в течение 30 минут. Наконец, 20% раствор сахарозы удаляют и заменяют 30% раствором сахарозы в PBS, где он хранится еще 30 минут. Теперь можно приступать к ориентации и блокировке ЭБС.
В нашей лаборатории мы используем пустые оболочки капсул в качестве форм. Для блокировки ВБС важно покрыть внутренние стенки наконечника раствором сахарозы перед сбором ОЭ. Теперь мы можем аккуратно собрать EBS и подождать, пока они сцегнутся на дно кончика.
Далее ЭБС размещаются в центре блока. Это должно быть конечное положение EBS внутри блока. С помощью стереомикроскопа и тонкого наконечника мы собираем и выпускаем как можно больше раствора сахарозы.
Всегда следите за тем, чтобы не собрать EBS. С помощью иглы со слегка загнутым кончиком все ЭБС располагаются в центре блока. Наконец, оставшийся раствор сахарозы собирают с помощью кусочков фильтровальной бумаги.
Конкретное расположение EBS в блоке очень важно для получения ломтиков хорошего качества. Вот пример плохого позиционирования EB внутри оболочки. После позиционирования EBS и удаления раствора сахарозы оболочка заполняется OCT, начиная с краев, при этом всегда следят за тем, чтобы Resus не подвешивал EBS.
Оставшиеся пузырьки удаляются с помощью пипетки, а оболочки взбалтываются в течение 15 минут. После агитации. ОКТ-блок замораживается в сухом льду.
На этом этапе вы можете либо хранить блок, завернутый в алюминиевую фольгу, при температуре минус 80 градусов Цельсия для дальнейшего анализа, либо перейти к криостату Часть четвертая, Резка. Для изготовления криосекций вам понадобится одноразовое или постоянное лезвие, стеклосборники OCT и предварительно обработанные поли L лизином стекла. Блок OCT вынимают из морозильной камеры и держат внутри криостата до тех пор, пока он не достигнет минус 20 градусов по Цельсию.
Затем блок размещается на подставке и выравнивается параллельно краю лезвия. Образцы EB намного меньше, чем большинство других образцов тканей, поэтому очень важно быть уверенным, что вся поверхность блока одновременно соприкасается с лезвием, тем самым сводя к минимуму потери материала. После позиционирования блок разрезается на ломтики размером 10 микрометров, которые собираются непосредственно на предметные стекла.
Предметные стекла можно хранить либо при температуре минус 70 градусов по Цельсию, либо использовать в тот же день. Материал может быть окрашен для иммуногистохимии или иммунофлюоресценции. Заключение. Описанный здесь способ обеспечивает достаточно недорогой и простой в применении протокол получения тонких криостатных срезов тел эмбрионов, развившихся как из человеческих линий H 9, так и из стволовых клеток US P one мыши.
Полученные криосрезы могут быть использованы в широком спектре процедур для анализа экспрессии белка или морфологии EB.
Просмотрите полный транскрипт и получите доступ к тысячам научных видео
Обзор
В этой статье демонстрируется процесс получения высококачественных криосекторов тел эмбриоидных тел (EB) из плюрипотентных стволовых клеток, выращенных в суспензии. Эти криосекторы необходимы для изучения клеточных и молекулярных аспектов эмбриогенеза при сохранении организации EB.
Ключевые компоненты исследования
Область науки
- Биология стволовых клеток
- Эмбриогенез
- Клеточная дифференцировка
Фон
- Плюрипотентные стволовые клетки могут дифференцироваться в различные типы клеток.
- Эмбриоидные тела - это агрегаты, имитирующие раннее эмбриональное развитие.
- Изучение EB помогает понять механизмы эмбриогенеза.
- Высококачественные криосекторы важны для детального анализа.
Цель исследования
- Предоставить метод подготовки криосекторов EB.
- Способствовать изучению клеточных и молекулярных процессов в процессе дифференцировки.
- Сохранить структурную организацию EB в анализе.
Использованные методы
- Подготовка плюрипотентных стволовых клеток в суспензионной культуре.
- Индукция дифференцировки в эмбриоидные тела.
- Техники криосекторирования для получения высококачественных образцов.
- Анализ клеточных и молекулярных характеристик EB.
Основные результаты
- Успешная подготовка криосекторов из EB.
- Сохранение организации EB в криосекторах.
- Повышенная способность изучать эмбриогенез на клеточном уровне.
- Демонстрируемый метод может быть применен в различных исследовательских контекстах.
Выводы
- Метод позволяет проводить детальный анализ EB.
- Высококачественные криосекторы ценны для эмбриональных исследований.
- Этот подход может продвинуть понимание дифференцировки стволовых клеток.
Часто задаваемые вопросы
Executive Industry Relevance
High-quality cryosectioning of embryoid bodies (EBs) derived from pluripotent stem cells enables precise spatial analysis of differentiation markers and tissue organization, supporting early discovery and target validation in regenerative medicine and developmental biology. This capability enhances predictive confidence in stem cell-based models and informs risk-adjusted decisions at key inflection points in the discovery pipeline. Reliable EB cryosections facilitate cross-functional data integration for portfolio advancement.
Strategic Applications in Biopharma R&D
Early Discovery & Target Validation
- Enables interrogation of pluripotency and lineage-specific marker expression within three-dimensional EB structures.
- Supports biological de-risking by clarifying differentiation pathways and cellular heterogeneity.
- Provides spatial context for functional target validation in stem cell-derived systems.
Screening & Assay Development
- Facilitates preparation of standardized EB cryosections for reproducible immunofluorescence and in situ hybridization assays.
- Enables quantitative assessment of protein and RNA distribution across EB sections.
- Supports assay scalability and platform reuse for compound screening in stem cell models.
Translational & Preclinical Research
- Aligns in vitro differentiation with in vivo developmental processes for disease-relevant modeling.
- Enables continuity from discovery through preclinical validation by preserving EB architecture and marker localization.
- Provides mechanistic insights that inform translational biomarker strategies.
Pipeline & Workflow Integration
This cryosectioning method integrates into the discovery continuum from early stem cell differentiation studies through assay development and preclinical model validation.
- Discovery Biology: Supports hypothesis testing on pluripotency and lineage commitment within EBs.
- Screening: Delivers reproducible, quantitative readouts for marker expression and tissue organization.
- Analytics: Enables spatially resolved measurements for comparative analysis of differentiation conditions.
- Translational Research: Bridges in vitro findings with in vivo developmental relevance when supported by marker expression patterns.
- Enterprise Reuse: Establishes a standardized workflow for EB analysis applicable across multiple stem cell lines and differentiation protocols.
Operational & Enterprise Impact
- Scientific Value: Increases predictive confidence in stem cell differentiation and target validation.
- Operational Value: Standardizes EB sectioning for reproducible downstream analyses.
- Strategic Value: Improves go/no-go decisions by providing robust spatial and molecular data.
- Portfolio Impact: Enables risk-adjusted prioritization of stem cell-based discovery programs.
Implementation Considerations
- Requires expertise in cryosectioning and handling of delicate three-dimensional cell aggregates.
- Needs access to cryostats, embedding media, and imaging infrastructure for downstream analysis.
- Demands cross-team standardization of EB preparation and sectioning protocols.
- Adaptable to various pluripotent stem cell lines and differentiation models with attention to EB size and morphology.
- Dependent on careful orientation and embedding to ensure high-quality, interpretable sections.
