Анализ ретиноевой кислоты-индуцированной Neural дифференциации эмбриональных стволовых клеток мыши в двух и трех-мерных эмбриональных телец

Общая цель данной процедуры заключается в анализе экспрессии и продукции генов и белковых маркеров, соответственно, нейронной дифференцировки эмбриональных стволовых клеток мыши. Этот метод может помочь определить механизм, ответственный за ингибирование нейронной дифференцировки к сырому возрасту DPA, и привести к лучшим протоколам дифференцировки стволовых клеток в нейроны для терапевтических целей. Основное преимущество этой методики заключается в том, что она позволяет отслеживать процесс нейронной дифференцировки на уровне эмерина и белка, в том числе с помощью оптической микроскопии.

Демонстрировать процедуру будет доктор Цзюннинг Янг, научный сотрудник моей лаборатории. Начните формирование эмбриоидного тела путем забора эмбриональных стволовых клеток с 0,25% трипсина-ЭДТА в течение двух-пяти минут при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Добавьте свежую модифицированную среду Дульбекко от Iscove, или IMDM, с 15% FBS в отделяющиеся ячейки и перенесите клеточную суспензию в 15-миллилитровую пробирку.

Центрифугируйте при температуре 160 x G в течение пяти минут при комнатной температуре. Затем подсчитайте клетки с помощью гемоцитометра и приготовьте суспензию от пяти х 10 до пятой клетки на миллилитр в ИМДМ с 0,5 микромолярной ретиноевой кислотой. Затем с помощью восьмиканальной пипетки и наконечников на 200 микролитров нанесите 120 микролитров капель на 100-миллиметровую чашку Петри.

Переверните посуду и заполните перевернутую крышку PBS, чтобы предотвратить высыхание висячих капель. Культивируйте при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, в течение трех-четырех дней. Используйте наконечники для пипетки объемом 200 микролитров, чтобы собрать висячие капли эмбрионоидных тел, выращенных в течение трех дней.

Коснитесь эмбриоидного тела наконечником пипетки и перенесите его на покрытый фибренектином покровный листок в 24-луночном планшете. Меняйте среду на культурах каждые два-три дня. При смене среды при необходимости собирайте использованную среду для анализа секреции белка.

Чтобы обнаружить секретируемые белки в среде, перенесите 500 микролитров эмбриоидной среды тела в центробежные фильтры с отсечкой 10 килодальтон и вращайте при температуре 20 000 x G при четырех градусах Цельсия. Проверяйте среду, оставшуюся внутри центробежных фильтров, каждые 15-20 минут, чтобы предотвратить чрезмерное обогащение. Прекращают центрифугирование, когда объем оставшейся среды упал до 25 микролитров.

Переверните фильтр и вращайте при температуре 160 x G при четырех градусах Цельсия, затем соберите оставшуюся концентрированную среду, следуя инструкциям производителя. Для 3D-культуры собирают эмбриоидные тела, выращенные в течение четырех дней в виде висячих капель с наконечниками пипетки объемом 200 микролитров, как и раньше. Перенесите 30 эмбриоидных тел в центрифужную пробирку объемом 1,5 миллилитра, затем приготовьте раствор коллагенового геля, разбавив соответствующие объемы раствора коллагена и 5X DMEM, добавив раствор нейтрализации, и сразу же хорошо перемешайте.

Положите коллагеновый гель на лед. Затем пипеткой наберите соответствующий объем охлажденного раствора коллагена в пробирку, содержащую эмбриоидные тельца, а затем аккуратно пипетируйте суспензию эмбриоидных тел в лунки шестилуночного планшета, не создавая пузырьков. Немедленно перенесите пластину на температуру 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, на 60 минут, чтобы инициировать полимеризацию коллагена.

По истечении 60 минут наложите на пластину, содержащую эмбриоидные тельца, IMDM. Для диссоциации эмбриоидных тел снова собирают четырехдневные висячие капли эмбриоидных тел с наконечниками пипетки объемом 200 мкл. На этот раз перенесите их в неадгезивную бактериологическую чашку Петри, содержащую IMDM с 15% FBS и культуру при температуре 37 градусов Цельсия, 5% углекислого газа, еще на четыре дня.

Проверяйте эмбриоидные тела два раза в день, чтобы убедиться, что они не прилипают ко дну. Осторожно встряхните тарелку, чтобы предотвратить прикрепление эмбриоидного тела. Через четыре дня перенесите эмбриоидные тела в центрифужную пробирку и центрифугуйте при температуре 185 x G в течение пяти минут при комнатной температуре.

После центрифугирования удалите надосадочную жидкость. Объем палитры не должен превышать 100 микролитров. Затем пипеткой в пробирку эмбриоидных тел впрыскивают один миллилитр 0,25% коллагеназы I типа, дополненной 20% FBS в PBS.

Выдерживайте смесь в течение часа при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Аккуратно пипетируйте суспензию с помощью одномиллилитрового наконечника для пипетки каждые 20 минут. После инкубации аккуратно трижды промойте клетки PBS.

Если клеточные агрегаты присутствуют, используйте сетчатое фильтр с ячейкой 100 микрон для их удаления. Поместите клетки на покрытые желатином покровные стекла в IMDM, затем инкубируйте при температуре 37 градусов Цельсия и 5% углекислого газа. Промойте 2D или диссоциированные 3D эмбриоидные тела PBS.

Затем зафиксируйте четырехпроцентным параформальдегидом и PBS в течение 30 минут при комнатной температуре. После трехкратной промывки неподвижных клеток PBS для удаления плавающего клеточного мусора, добавьте 1%-ный тритон X-100 в PBS для проникновения клеток в течение 20 минут при комнатной температуре. После стирки, как и раньше, удалите последнюю стирку и залейте 5% BSA в PBS на 30 минут.

К концу инкубации готовят первичный диллюций антител в 1% БСА в PBS с добавлением 0,03% тритона X-100. По истечении 30 минут замените блокирующий раствор первичным раствором антитела. Выдерживать в течение трех часов при комнатной температуре, или в течение ночи, при четырех градусах Цельсия.

После промывки нанесите вторичное антитело в PBS и инкубируйте в течение одного часа при комнатной температуре. Наконец, крышка крепления надевается на предметные стекла с защитой от выцветания среды для оптической микроскопии. На этом изображении показан росток из эмбриоидного тела, образованного из ЭСК, положительного на две копии гена Syx, который кодирует фактор обмена гуанина, активирующий ГТФазу RhoA.

Снимок был сделан после шести дней работы в 3D-культуре. Это эмбриоидное тельце, образованное из Syx KnockOut ESCs, демонстрирует повышенное прорастание после того же времени в культуре. Здесь фазовые изображения 2D-краев эмбриоидных тел показывают, что клетки расширялись быстрее из Syx KnockOuts, чем из Syx дикого типа.

Эти иммунофлуоресцентные изображения показывают, что маркер нейронной дифференцировки, Nestin, показанный красным цветом, был более распространен в клетках, расширяющихся из шестидневных эмбриоидных тел 2D6 KnockOut, чем в их аналогах дикого типа Syx. Иммунофлуоресцентные изображения показывают, что маркеры нейронной дифференцировки Nestin и бета III тубулин были более распространены в клетках, диссоциированных от 13-дневных эмбриоидных тел 3D6 KnockOut, чем от их аналогов дикого типа Syx. Это трудоемкая процедура из-за длительности роста и дифференцировки эмбриоидного тела.

Для этого требуется не только не менее восьми дней, но в некоторых случаях мы следуем дифференциации до 24 дней. При попытке проведения этой процедуры важно помнить об ограничении жизнеспособности диаметра эмбриоидного тела, чтобы обеспечить одинаковую скорость дифференцировки вдоль эмбриоидных тел.