Регенерация аксонов в седалищном нерве мыши после раздавливания

Начните с седалищного нерва, изолированного от мыши.

Нейроны внутри нерва были трансфицированы для экспрессии флуоресцентных цитоплазматических белков.

Нерв был раздавлен, чтобы вызвать травму, на которую был наложен шов.

Поврежденные сегменты аксонов на участке вырождаются, а рекрутированные макрофаги очищаются от обломков.

Шванновские клетки пролиферируют, образуя направляющие пути и секретируя нейротрофические факторы, способствующие росту аксонов. Аксоны проходят по этим дорожкам, регенерируя нерв.

Зафиксируйте нерв, чтобы сохранить клеточные структуры, затем удалите все прикрепленные ненейрональные ткани.

Промойте буфером для устранения остатков фиксаторов.

Расположите нерв на предметном стекле микроскопа, нанесите монтажную среду и установите покровное стекло.

Расплющите нерв, чтобы расположить аксоны в одной фокальной плоскости для визуализации.

С помощью эпифлуоресцентного микроскопа проследите аксоны от места раздавливания до их дистальных концов, чтобы

измерить продолжительность регенерации.

Отделите DRG вместе с нервными корешками и седалищным нервом, осторожно с помощью микроножниц и микрощипцов под микроскопом для вскрытия.

Затем переведите седалищный нерв непосредственно в 4% PFA на ночь при четырех градусах Цельсия. Чтобы визуализировать и измерить меченные флуоресценцией сенсорные аксоны под микроскопом для препарирования, осторожно снимите прикрепленную ткань и мембрану на неподвижном седалищном нерве с помощью микроножниц и микрощипцов. Затем промойте нерв PBS три раза.

Далее поместите седалищный нерв на предметное стекло и держите его прямо. Добавьте 80 микролитров раствора против выцветания вокруг нерва, затем наложите на него покровную крышку. Расплющите всю смонтированную ткань с нажимом.

После этого поместите сплющенную ткань под инвертированный эпифлуоресцентный микроскоп, оснащенный аксессуаром для получения мозаики и обработки изображений. При измерении длины регенерированных аксонов проследите все идентифицируемые флуоресцентно меченые аксоны в седалищном нерве от места раздавливания до дистальных концов аксонов.